骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細胞基因表達譜的芯片研究

摘要：目的 通過對于骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細胞基因表達譜的芯片研究，為我國骨關(guān)節(jié)炎疾病治療水平的提升奠定基礎(chǔ)。方法 選取我院2013年收治的3例骨關(guān)節(jié)炎患者，將患有關(guān)節(jié)置換術(shù)的骨關(guān)節(jié)患者，當做骨關(guān)節(jié)組（第一組）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者當做RA組（第二組）、沒有關(guān)節(jié)炎有創(chuàng)傷的患者，當做是創(chuàng)傷組（第三組），進行軟骨標本、細胞培養(yǎng)，利用微陣列差異性基因分析軟件，分析骨關(guān)節(jié)組，分別與剩下兩組軟骨細胞的差異性，以及差異性基因的性質(zhì)。結(jié)果 一、三組的差異基因有133個，包含的上調(diào)和下調(diào)分別是65個、68個；一、二組的差異基因有293個，包含的上調(diào)和下調(diào)分別是106個、187個。第一組與其余兩組的差異性基因功能，屬于生物調(diào)節(jié)等，差異性基因的通路，符合統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05的包括細胞周期通路、一氧化氮通路等。但同時三組配對的差異性基因，既存在差異性，同時也存在相互性。結(jié)論 從差異性基因的多角度入手分析其骨關(guān)節(jié)炎的生物信息，為以后骨關(guān)節(jié)，從基因表達方面進行治療，有了實質(zhì)性的進展。

關(guān)鍵詞：骨關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)軟骨細胞；基因表達譜芯片技術(shù)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的疾病，但是治療的過程和效果卻沒有達到理想狀態(tài)，主要原因是由于該種疾病的發(fā)病原因多樣，且病情程度不同，給治療帶影響；而采用基本表達譜芯片技術(shù)，對于患者的關(guān)節(jié)軟骨細胞，與對照樣品和芯片進行雜交，使其產(chǎn)生差距性基因，通過對于差異性基因的功能、通路等生物學(xué)信息特征進行分析，從而更好的檢測基因表達水平的變化，有效的識別多基因，參與的雜交疾?。粚Υ思訌姶朔矫娴难芯?，更能確定其骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病原理，為以后骨關(guān)節(jié)疾病的根治提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 選取我院2013年收治的3例骨關(guān)節(jié)炎患者，將患有關(guān)節(jié)置換術(shù)的骨關(guān)節(jié)患者、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者、沒有關(guān)節(jié)炎有創(chuàng)傷的患者；男性1例，女性2例，年齡分別是64歲、56歲和45歲；在患者同意之下，按照各個符合分類標準的三組患者，分別分為骨關(guān)節(jié)組（第一組）、RA組（第二組）以及創(chuàng)傷組（第三組）作為研究的對象。

1.2方法

1.2.1選取指定的基因表達譜芯片，其中芯片中，含有指定數(shù)量的看家基因，作為陰性、陽性的對照，以及外標探針。

1.2.2軟骨細胞培養(yǎng)方法 標本的制作，利用胰蛋白酶0.25%、膠原酶0.2%Ⅳ消化軟骨進行切片，然后在37.5℃左右溫度下的溫浴4 h，并將細胞進行篩選，以及離心過濾，過濾的時間為5 min左右，離心轉(zhuǎn)速為1500 r/min，將上層的清液去除。利用標準型的DNEM培養(yǎng)液進行清洗；在吹打的過程中，要注意泡沫對于混勻效果的影響，同時進行離心過濾，并使其細胞密度在4×105；將其接種在培養(yǎng)瓶中，在體積分數(shù)5%二氧化碳、恒溫37.5℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.3 RNA的提取 利用TRIZOL總RNA抽提試劑進行抽取[2]，在應(yīng)用的過程中，避免有毒性的TRIZOL試劑弄到皮膚或是眼睛上。其RNA的濃縮，采用異丙醇進行沉淀；當確定后樣品中的RNA量時，利用RNase-free water，將樣品調(diào)整至體積為100 μl[1]，并將其進行離心，達到洗脫RNA的目的，并進行定量和電泳質(zhì)檢。最后對于RNA進行熒光標記。

1.2.4芯片技術(shù)應(yīng)用 首先將標記好的DNA，與由SSC、SDS、DENHART與指定濃度甲酰胺組成的混合液，取80 μl使其進行雜交，之后在由指定溫度，以及濃度SSC、SDS混和成的混合液中，和SSC溶液進行清洗，最后利用指定的雙通道激光掃描儀進行掃描。之后利用laxScan3.0圖像分析軟件，根據(jù)圖像質(zhì)量程度和信號，對于基因進行標記，將其幾組熒光信號強度的比值，輸入到微陣列差異性軟件進行差異表達基因的篩選。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 利用SAM基因芯片分析軟件，進行差異性基因的挑選，當P<0.05時，則說明差異符合統(tǒng)計學(xué)意義[3]。

2結(jié)果

一、三組的差異基因有133個，包含的上調(diào)和下調(diào)分別是65個、68個；一、二組的差異基因有293個，包含的上調(diào)和下調(diào)分別是106個、187個。第一組與其余兩組的差異性基因功能，屬于生物調(diào)節(jié)等，差異性基因的通路，符合統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05的包括細胞周期通路、一氧化氮通路等。第一組與二、三組表達基因的基因功能的分類，其中細胞過程差異性基因，第二組占到14.4%，第三組占到14.8%；生理過程差異性基因，第二組占到12.3%，第三組占到13.9%；生物調(diào)節(jié)差異性基因，第二組占到8.2%，第三組占到7.3%；生物調(diào)節(jié)過程差異性基因，第二組占到7.6%，第三組占到6.7%；代謝差異性基因，第二組占到5.5%，第三組占到5.6%；細胞成分差異性基因，第二組占到5.4%，第三組占到4.8%；細胞差異性基因，第二組占到5.4%，第三組占到4.8%；結(jié)合差異性基因，第二組占到4.3%，第三組占到4.1%。其中部分差異基因通路見表1。

3討論

對于關(guān)節(jié)軟骨功能分析，有利于醫(yī)療水平的提升，因為一旦細胞功能出現(xiàn)問題，就會導(dǎo)致其細胞出現(xiàn)死亡、損傷、因子異常等情況的出現(xiàn)，同時細胞因子，對于關(guān)節(jié)軟骨具有一定的刺激作用，對此加強此方面的研究，有利于對于關(guān)節(jié)炎發(fā)病機理的研究。

本文采用SAM基因芯片分析的方法，將關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的全基因表達譜進行深入的研究，一些下調(diào)基因PSME2、VCAM1等生物學(xué)特征等信息，可以更好的發(fā)現(xiàn)以往沒有發(fā)現(xiàn)的致病原因，多增加一些治療的方式，從而更好的拯救骨關(guān)節(jié)炎患者的疾病。

綜上所述，通過對于骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細胞基因表達譜的芯片研究分析，發(fā)先第一組與第二組，比到一組與第三組，在差異性因數(shù)的數(shù)量上和信息上，要豐富的多，并表明了骨關(guān)節(jié)炎，退行性病變的發(fā)病過程，比免疫機制所導(dǎo)致的老年人風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以較大的差距。同時通過這兩組差異基因通路的研究，發(fā)現(xiàn)兩組在凋亡通路、細胞周期通路、肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)通路、硫酸軟骨生物合成通路等多種通路上，都有明顯的差異，像JaK-STAT信號通路方面，第一組與第三組的參與基因是STAT2、PIK3CD；而第一組與第二組的參與基因卻是IRF9、IL11，且P<0.05，說明這兩組的差異基因的功能、通路，不僅存在一定的差異，與此同時，與存在一定交叉關(guān)系。

參考文獻：

[1]張榮凱.早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨基因表達譜的實驗研究[D].中山大學(xué)，2012.

[2]孫天聞.基因表達譜芯片技術(shù)研究炎癥狀態(tài)下塞來昔布對關(guān)節(jié)軟骨細胞PGE2相關(guān)基因表達譜的影響[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2013.

[3]夏澤楠.骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨祖細胞功能活性及miRNA表達譜的改變[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2014.編輯/孫杰