納米銅IUD和TCu220C IUD細胞毒性研究

摘要：目的 評價納米銅IUD 和TCu220C IUD的體外細胞毒性。方法 采用納米銅材料IUD和TCu220C IUD，用細胞完全培養(yǎng)液做浸提介質分別浸提24 h、72 h制備相應浸提液，與L929細胞接觸培養(yǎng)，通過采取MTT（四唑鹽）比色法測定細胞毒性和倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)來進行毒性評價。結果 納米銅IUD細胞毒性分級為1～2級，TCu220C IUD細胞毒性分級為2～4級。結論 納米銅IUD較TCu220C IUD對細胞生長情況影響小，細胞相容性更好。

關鍵詞：納米銅IUD； TCu220C IUD； 細胞毒性；MTT

Abstract：Objective To evaluate the cytotoxicity of nano-copper IUDand TCu220C IUD with mouse fibroblast cells. Methods Leaching liquors of nano-copper IUD and TCu220C IUD were prepared with Cell culture fluid. The proliferation of L-929 cells was measured by tetrazolium colorimetric assay （MTT）， and the morphology of the cells were observed by inverted microscope. Results The cytotoxicity of nano-copper IUD group was 1～2， but the TCu220C group was2～4. Conclusion Nano-copper IUD present more cytocompatibility.

Key words：Nano-copper IUD； TCu220C IUD；Cytotoxicity； MTT

宮內節(jié)育器由于具有長效、簡便、經濟、避孕效果好、取出后能很快恢復生育能力等特點，深受廣大育齡婦女的歡迎[1]。我國使用最多的宮內節(jié)育器是含銅節(jié)育器[2]。但目前市面上的含銅宮內節(jié)育器均存在置入后出血、疼痛等副反應，進而影響宮內節(jié)育器的被接受性和使用年限。低密度聚乙烯/納米銅復合材料是采用物理和化學方法研制出的一種新型宮內節(jié)育器材料，本文采用MTT法比較低密度聚乙烯/納米銅復合材料IUD（簡稱納米銅IUD）和TCu220C IUD的細胞毒性，為新型含銅宮內節(jié)育器的應用和推廣提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料 納米銅IUD（納米銅含量為30%的變異T型IUD），由華中科技大學材料與工程學院提供；對照材料TCu220C IUD，無錫市醫(yī)療器械廠生產；細胞株：小鼠成纖維細胞L-929，購買于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保存中心；RPMI1640培養(yǎng)基（改良型）（Hyclone 美國），小牛血清（GIBCO 美國），胰蛋白酶（Amresco），MTT粉劑 （Sigma 美國），二甲基亞楓DMSO （Sigma 美國）。

1.2浸提液的制備 將納米銅IUD和TCu220C IUD紫外線無菌[3]處理以后，依照GB/T16886.12浸提液的制備標準（樣品質量/浸提液=0.2g/ml），用FBS- RPMI1640培養(yǎng)液作為浸提介質，分別放入37℃培養(yǎng)箱中浸提24 h、72 h，制備浸提液，過濾備用。陰性對照溶液：FBS- RPMI1640培養(yǎng)液。陽性對照溶液：濃度為 6.4g/ml的苯酚溶液。

1.3 MTT實驗[4] 將處于對數(shù)生長期的細胞用胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，調整細胞接種密度為5000個/孔[4]接種于96孔板上，每孔100 μl，每板接種60個孔，重復接種3板，待細胞貼壁后吸去原培養(yǎng)液，0.01 mol/L的PBS清洗后，分別加入納米銅和TCu220C IUD制備的浸提液、陽性對照液和陰性對照液，每組設5個復孔，每孔100 μl。在加入干預溶液后的第1 d，第3 d，第5 d分別取出一板，倒置顯微鏡觀察細胞數(shù)量和形態(tài)后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl，再放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸掉原培養(yǎng)液，用0.01 mol/L的PBS清洗后每孔加入150 μl DMSO，室溫避光15 min，用酶聯(lián)檢測儀檢測細胞光密度值（OD值），實驗波長為492 nm，參比波長630 nm，計算各濃度光密度值（OD值）的平均值。

按以下公式計算細胞相對增殖率。細胞增值率與細胞毒性的關系見表1。

實驗結果為0級～1級的為合格，結果為2級反應的應結合細胞形態(tài)觀察，結果為3～5級的為不合格[4]。

2 結果

2.1倒置顯微鏡細胞形態(tài)觀察 加干預液前用倒置顯微鏡觀察，各孔細胞貼壁伸展，形態(tài)正常，胞體呈梭形或不規(guī)則三角形。加入干預液培養(yǎng)后24 h觀察，陰性對照細胞形態(tài)良好，為長梭形和多角形，可見圓形分裂細胞，表明細胞生長旺盛（圖1）；陽性對照組存留細胞多數(shù)形態(tài)異常，核皺縮或溶解，偶見細胞影像及崩解產物（圖2）。用72 hTCu220C浸提液干預24 h可見細胞見少量絮狀物，貼壁的細胞約占觀察視野的75%～85%，部分貼壁細胞發(fā)生變形，高倍鏡下可見細胞內出現(xiàn)較多黑色顆粒，部分細胞體積變大或皺縮，有胞質溢出（圖3）；第3 d，第5 d貼壁細胞約占整個視野的35%～45%。72 h TCu220C浸提液干預后有少量漂浮的死細胞和絮狀物，貼壁細胞中有約30%的細胞呈圓形。24 h納米銅浸提液干預后有10%～20%的細胞呈圓形，偶可見漂浮死細胞，細胞數(shù)量有增加但增加幅度不及陰性組。MTT染色后， 陰性對照組可見大量密集的藍紫色針狀結晶（圖4），陽性對照組僅有少量結晶沉積。

2.2不同浸提液中細胞增殖率及毒性分級 不同組別的細胞相對增殖率和毒性評級結果見表2。納米銅浸提72 h干預5 d發(fā)現(xiàn)有輕度細胞毒性，TCu220C浸提24 h、72 h時細胞毒性分別為2～3級和3～4級。

3 討論

L929是具有傳代容易、繁殖迅速、體外培養(yǎng)條件低、易儲存，1982年美國質量標準協(xié)會將L929推薦為細胞毒性試驗中的標準細胞。本試驗采取MTT比色法是一種新的快速評定細胞增殖和細胞毒性的比色法，目前在國際上已廣泛地應用于免疫學，腫瘤學和醫(yī)用生物材料的生物相容性評價[5]。

含銅IUD的避孕效果主要依賴于銅在宮腔內腐蝕而釋放出的銅離子[2]。所以銅的腐蝕會影響到含銅IUD的避孕效果和長期使用。有研究表明，納米銅材料中銅的腐蝕與含銅IUD中銅的腐蝕過程是相同的[6]，而且本實驗所使用的納米銅材料中納米銅粉是均勻分布在復合材料內部的，外界溶液通過復合材料中的微孔進入材料內部與納米銅接觸發(fā)生反應產生銅離子，銅離子進入溶液后發(fā)揮細胞毒性作用[7]，而不是納米銅直接作用于細胞[8]，所以納米銅材料浸提液中銅對細胞的作用機制與TCu220C浸提液中銅對細胞的作用機制是一樣的，兩者具有可比較的條件。

前期研究[9，10]提示金屬銅釋放的銅離子對中國倉鼠卵巢細胞有一定的細胞毒性，含銅 IUD 因含銅面積不同，其表現(xiàn)出來的細胞毒性也不同，含銅面積越大，細胞毒性越大[6，10]。而納米銅材料的特殊結構使得材料中銅顆粒的腐蝕速率是可控的，在理論上不僅避免了一般的含銅IUD在置器初期發(fā)生的爆釋現(xiàn)象[11]，而且對細胞毒性的影響也是可以控制的，所以在臨床應用前景上納米銅材料更有優(yōu)勢。

本次的細胞毒性實驗中，納米銅IUD浸提液的細胞毒性處于1～2級，TCu220C IUD細胞毒性分級為2～4級，說明納米銅IUD對細胞生長情況影響較TCu220C IUD小，細胞相容性更好，可以對其在臨床上的使用起到可靠的指導作用。

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編輯/周蕓霏