基于網絡藥理學和動物實驗探討黃芪葛根湯治療糖尿病腎病的作用

于官正，李 鴻，涂 星，劉音貝，羅 騫，張 燕

（1.湖北民族大學武陵山中藥材檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學醫(yī)學部，湖北 恩施 445000；3.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院藥學部，廣東 廣州 510000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN） 是以白蛋白尿持續(xù)性排泄增加、腎小球濾過率下降、腎小球高濾過等為臨床特征的糖尿病并發(fā)癥，可導致終末期腎臟疾?。╡ndstage renal disease，ESRD）［1-2］。DN 患者常伴食欲低下、倦怠乏力等癥狀［3］。臨床治療DN 常以一般治療、藥物治療、透析治療等手段，療效欠佳且有一定副作用［4］，尋找恰當藥物治療DN 意義重大。中醫(yī)認為DN 為消渴病變證，屬于“尿濁” “水腫” 等范疇，病因病機為正氣虛衰、脾失健運等［5］，治療常以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主［6］。黃芪葛根湯始載于《證類匯補》，由黃芪、葛根組成，具有健脾益氣、滋陰清熱、生津止渴等功效，是治療消渴的經典方［7］。研究發(fā)現，黃芪、葛根具有降糖作用，可應用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療［8］，但具體藥理機制尚不明確。

網絡藥理學將生物學與藥物作用密切結合，可從整體上揭示復方對疾病的作用機制，與中醫(yī)整體觀念的主導思想相似［9］。本研究擬采用網絡藥理學技術預測黃芪葛根湯治療DN 潛在核心靶點與通路，并采用高脂高糖飼料聯合鏈脲佐菌素誘導建立DN 大鼠，給予黃芪葛根湯進行干預，深入挖掘其治療機制，以期為臨床治療DN 提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學

1.1.1 軟件及數據庫 基因綜合表達 （GEO） 數據庫（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）；中藥系統藥理分析平臺（TCMSP，http：／／tcmspw.com／index.php）；中醫(yī)藥綜合數據庫（TCMID，http：／／www.megabionet.org／tcmid／）；中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺（TCMIP，http：／／www.tcmip.cn／TCMIP／index.php）；Cytoscape （version 3.7.2）；Java （version 1.8.0）；Perl 語言 （Active Perl，version 5.30）；R 語言（x64 version 4.2.1）；Bioconductor 平臺 （https：／／www.bioconductor.org）；STRING 數據庫（http：／／string-db.org／）；Uniprot 數據庫 （https：／／www.uniprot.org／）。各數據庫的檢索均于2022 年9 月29 日完成。

1.1.2 DN 差異表達基因的篩選 DN 基因載于GSE30122芯片，包括50 名健康者和19 名活動性DN 患者基因表達量，下載芯片平臺文件及探針文件［10］。運用Perl 語言將探針名稱轉為基因名稱并分為正常組與模型組。以正常組和模型組基因差異倍數絕對值（｜logFC ｜） ≥1、P＜0.05 為條件，運行R 語言篩選差異基因，繪制火山圖及熱圖。

1.1.3 復方活性成分及靶點的預測 檢索TCMSP 數據庫，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥0.30、類藥性（drug likeness，DL） ≥0.18 為條件篩選黃芪、葛根的有效成分［11-12］，Perl 語言篩選活性成分對應靶標；檢索TCMID、TCMIP 數據庫中黃芪、葛根的有效成分及靶點。通過Uniprot 數據庫將靶點名翻譯為基因名。

1.1.4 中藥調控網絡的構建 黃芪葛根湯靶點基因與DN差異基因取交集，繪制Venn 圖。運行Perl 語言得到交集基因的有效成分及網絡屬性與結點屬性文件，將所得作為輸入文件導入Cytoscape 繪制中藥調控網絡并進行拓撲分析。

1.1.5 蛋白互作網絡分析 將交集基因錄入STRING 數據庫，種屬選擇“Homosapiens”，隱藏游離蛋白，構建PPI網絡，下載TSV 格式文件并通過R 語言運行，篩選富集數目排名前二十的核心基因。

1.1.6 GO 功能與KEGG 通路富集分析 通過R 語言對基因ID 進行轉化編碼，以P＜0.05 進行基因本體（GO） 功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 富集分析，P值越小富集越明顯，GO 功能富集分析按P值從小到大選取排名前十的條目進行分析，不足10 條則分析全部；KEGG富集分析同法分析前20 條通路。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠80 只，4 周齡，體質量（100±10） g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （遼） 2020-0001］，在溫度（20±2）℃，相對濕度50%～60%，進食、飲水自由的環(huán)境下飼養(yǎng)，分籠適應性喂養(yǎng)1 周，生存狀態(tài)良好。本實驗經湖北民族大學生物醫(yī)學科研倫理審查通過 （倫理號2022004）。

1.2.2 藥物與試劑 黃芪葛根湯由黃芪36 g （批號210901）、葛根18 g （批號210801） 組成，藥材購自湖北聚瑞生物科技有限公司，經湖北民族大學武陵山中藥材檢驗檢測中心文德鑒副教授鑒定為正品。藥材加8 倍量水浸泡后煎煮2 次，合并濾液，濃縮成生藥量1 g／mL 的濃縮液。高脂高糖飼料（66.5%維持飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+1% 膽酸鈉）、鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、檸檬酸一水、檸檬酸鈉二水合物、鹽酸二甲雙胍（貨號 MS1606-50KG、MS1601-500MG、MS5532-50G、MS5533A-50G、MZ3403-1G，上海懋康生物科技有限公司）；晚期糖基化終末產物（AGEs）、腫瘤壞死因子-α （TNFα）、血管內皮細胞粘附分子1 （VCAM-1）、單核細胞趨化蛋白1 （MCP-1）、核轉錄因子p65 （NF-κB p65） ELISA 試劑盒和DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒（貨號ml002154、ml002095、ml002068、ml037840、ml058779、ml095670，上海酶聯生物科技有限公司）。

1.2.3 儀器 631-B 型血糖儀［配i-sens631A 血糖試紙，歐姆龍健康醫(yī)療（中國） 有限公司］；BS-2000M 型全自動大型生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；LVEM5 型透射電子顯微鏡（美國Delong Instruments 公司）；DSX1000 型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；5810R 型高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；SCIENTZ-48 型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；脫水機、包埋機、病理切片機、組織攤片機 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2.4 造模、分組與給藥 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周，隨機分為正常組和造模組。造模組喂養(yǎng)高脂高糖飼料8 周后，用0.1 mol／L 枸櫞酸緩沖液配制STZ，單次注射劑量為40 mg／kg，注射30 min 后正常喂養(yǎng)，每周1 次，連續(xù)3 周。FBG＞16.7 mmol／L、24 h 尿蛋白定量＞30 mg 則認為DN 大鼠模型造模成功［13］，共成模57 只，隨機分為模型組10只，黃芪葛根湯低、中、高劑量組各12 只，鹽酸二甲雙胍組11 只。黃芪葛根湯的臨床等效劑量為5 g／kg，以1／2、1、2 倍臨床等效劑量為黃芪葛根湯低、中、高劑量［14］；鹽酸二甲雙胍的臨床等效劑量為0.15 g／kg。各給藥組固定時間段灌胃給藥；正常組和模型組同法給予蒸餾水，每天1次，連續(xù)8 周。分別于給藥前和末次給藥24 h 后測定各組大鼠FBG （尾尖血）。

1.2.5 腎組織形態(tài)學觀察 將腎組織于2.5%戊二醛中固定，1%鋨酸固定，經脫水、包埋及染色處理后，使用透射電子顯微鏡4 000 倍下觀察腎組織形態(tài)學變化。

1.2.6 血清BUN、Scr 和UA 水平檢測 分別于給藥前、末次給藥24 h 后取血，采用全自動大型生化分析儀檢測血清腎功能指標BUN、Scr 和UA 水平。

1.2.7 血清AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1 水平檢測取末次給藥24 h 后的股主動脈血，4 ℃、4 000 r／min 離心，取血清，按照ELISA 試劑盒說明書檢測TNF-α、AGEs、VCAM-1、MCP-1 水平。

1.2.8 腎組織VCAM-1、NF-κB p65 水平檢測 精密稱取0.5 g 大鼠腎組織，加0.5 mL 預冷生理鹽水，勻漿，4 ℃、3 000 r／min 離心15 min 后吸取上清液。按照ELISA 試劑盒說明書檢測各組大鼠腎組織VCAM-1、NF-κB p65 水平。

1.2.9 腎組織RAGE 表達檢測 隨機抽取各組4 只大鼠左側腎臟，制成5 μm 的切片，孵育一抗、二抗后顯色，蘇木素輕度復染胞核，1%鹽酸乙醇分化，梯度脫水，透明后中性樹膠封片，200 倍鏡下觀察并采集圖像，每張片隨機取3個視野，利用Image-Pro Plus 6.0 軟件進行分析。

1.2.10 統計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，若數據符合正態(tài)分布，以（±s） 表示，方差齊性采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，自身前后對照采用配對t檢驗；若數據方差不齊則采用Tamhane’s T2法檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡藥理學

2.1.1 疾病差異基因 篩選GSE30122 芯片，獲得正常組和模型組差異基因638 個，其中DN 患者上調與下調基因分別為384、254 個，差異基因熱圖與火山圖見圖1。

圖1 DN 差異基因熱圖（A） 和火山圖（B）

圖2 黃芪葛根湯作用靶點基因與DN 差異基因Venn 圖

圖3 中藥復方調控網絡

2.1.4 蛋白互作網絡 將交集基因輸入STRING 數據庫，構建PPI 網絡，通過R 語言篩選獲得PPI 核心基因，見圖4。

圖4 PPI 蛋白互作網絡（A） 和PPI 網絡核心基因（B）

2.1.2 復方活性成分及靶點 獲得黃芪活性成分20 個，葛根活性成分4 個，含1 個共有活性成分芒柄花素（formononetin），共23 個活性成分，對應靶點191 個。

2.1.3 中藥復方調控網絡 將黃芪葛根湯靶點基因與DN差異基因取交集，獲得交集基因21 個，見圖2。通過Cytoscape 繪制中藥復方調控網絡，包含43 條邊（邊代表黃芪葛根湯與DN 之間的相互作用），33 個結點（結點代表黃芪葛根湯活性成分和DN 靶點基因），見圖3。

2.1.5 GO 功能與KEGG 通路富集分析 獲得416 條GO 富集分析條目，包括BP 391 條，涉及蛋白激酶活性的正向調節(jié)、信號受體活性的正向調節(jié)等；CC 6 條，涉及分泌粒管腔、細胞質囊泡腔等；MF 19 條，涉及蛋白激酶調節(jié)劑活性、腺苷酸環(huán)化酶結合等，見圖5。

圖5 黃芪葛根湯GO 富集功能分析條形圖

獲得KEGG 通路30 條，包括AGE-RAGE 通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、HIF-1 等信號通路，見圖6。

圖6 黃芪葛根湯KEGG 富集分析氣泡圖

2.2 動物實驗

2.2.1 黃芪葛根湯對DN 大鼠空腹血糖值的影響 給藥過程中，黃芪葛根湯高劑量組大鼠死亡2 只、鹽酸二甲雙胍組死亡1 只。最終正常組大鼠10 只，模型組、黃芪葛根湯高劑量組各10 只，黃芪葛根湯中、低劑量組各12 只，鹽酸二甲雙胍組10 只。如表1 所示，給藥前與正常組比較，各造模組小鼠FBG 水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪葛根湯各劑量組和鹽酸二甲雙胍組FBG 水平均無明顯變化（P＞0.05）。給藥后與正常組比較，模型組FBG 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪葛根湯各劑量組和鹽酸二甲雙胍組FBG 水平均降低（P＜0.05），且黃芪葛根湯高組效果優(yōu)于黃芪葛根湯低、中劑量組。

表1 各組大鼠血清FBG 水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清FBG 水平比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與黃芪葛根湯高劑量組比較，△P＜0.05。

組別動物數／只FBG／（mmol·L-1）治療前治療后正常組109.49±0.859.16±0.64模型組1021.72±2.40* 27.06±2.90*黃芪葛根湯高劑量組1021.17±2.93* 17.13±1.57＃黃芪葛根湯中劑量組1222.11±2.45* 18.06±1.61＃黃芪葛根湯低劑量組1222.30±2.73* 21.60±1.69＃△鹽酸二甲雙胍組1021.73±1.66*9.33±0.39?！?/p>

2.2.2 黃芪葛根湯對DN 大鼠腎臟組織形態(tài)學的影響 如圖7 所示，與正常組比較，各造模組大鼠腎小球基底膜增厚，系膜基質增多，足細胞足突融合；與模型組比較，各給藥組大鼠腎小球基底增厚和足細胞足突融合均得到緩解，黃芪葛根湯高劑量組效果尤為顯著。

圖7 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學電鏡觀察（×4 000）

2.2.3 黃芪葛根湯對DN 大鼠血清BUN、Scr 和UA 水平的影響 因給藥前模型組與黃芪葛根湯各劑量組BUN、Scr 和UA 水平有差異，故對治療前、后的變化量進行分析（變化量＝治療前-治療后）。如表2 所示，給藥后與正常組比較，模型組BUN 水平變化量升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪葛根湯各劑量組BUN 和UA 水平均降低（P＜0.05），且黃芪葛根湯高劑量組降低血清BUN、Scr 和UA 水平效果最佳。

表2 各組大鼠BUN 、Scr、UA 水平變化量比較（±s）

表2 各組大鼠BUN 、Scr、UA 水平變化量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與黃芪葛根湯高劑量組比較，△P＜0.05。

組別動物數／只BUN／（mmol·L-1）Scr／（μmol·L-1）UA／（μmol·L-1）正常組100.23±0.560.51±5.340.60±1.23模型組10-3.23±1.67*-5.86±11.54-2.60±2.78黃芪葛根湯高劑量組105.40±2.74＃1.45±17.0342.53±5.84＃黃芪葛根湯中劑量組122.92±2.86＃-1.83±15.3919.22±5.57?！鼽S芪葛根湯低劑量組122.75±2.14＃-4.82±11.006.65±2.33?！鼷}酸二甲雙胍組10-6.10±5.21△-16.43±18.56-6.16±4.06△

2.2.4 黃芪葛根湯對DN 大鼠血清AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1 水平的影響 如表3、圖8 所示，與正常組比較，模型組AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1 水平均升高 （P＜0.05）；與模型組比較，黃芪葛根湯各劑量組AGEs、TNFα、VCAM-1、MCP-1 水平均降低（P＜0.05），且黃芪葛根湯高劑量組降低大鼠血清AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1水平作用最佳。

表3 各組大鼠血清AGEs、TNF-α、VCAM-1 水平比較（pg／mL，±s）

表3 各組大鼠血清AGEs、TNF-α、VCAM-1 水平比較（pg／mL，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與黃芪葛根湯高劑量組比較，△P＜0.05。

組別動物數／只AGEsTNF-αVCAM-1正常組1040.966±5.88671.990±6.74241.379±2.895模型組10126.019±7.036*96.039±8.162*72.386±3.914*黃芪葛根湯高劑量組1061.385±6.188＃77.465±3.682＃52.833±2.440＃黃芪葛根湯中劑量組1279.785±5.945?！?1.232±6.102＃57.493±4.080＃△黃芪葛根湯低劑量組1298.429±8.284?！?4.580±4.405＃△66.322±5.621?！鼷}酸二甲雙胍組1047.618±6.152?！?3.804±2.875?！?7.508±3.473?！?/p>

圖8 各組大鼠血清MCP-1 水平（±s）

2.2.5 黃芪葛根湯對DN 大鼠腎組織VCAM-1、NF-κB p65水平的影響 如表4 所示，與正常組比較，模型組腎組織VCAM-1、NF-κB p65 水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪葛根湯高、中劑量組腎組織VCAM-1 水平升高（P＜0.05），黃芪葛根湯各劑量組和鹽酸二甲雙胍組NF-κB p65 水平均升高（P＜0.05），且黃芪葛根湯高劑量組降低腎組織VCAM-1、NF-κB p65 水平作用最優(yōu)。

表4 各組大鼠腎組織VCAM-1、NF-κB p65 水平比較（ng／g，±s）

表4 各組大鼠腎組織VCAM-1、NF-κB p65 水平比較（ng／g，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與黃芪葛根湯高劑量組比較，△P＜0.05。

組別動物數／只VCAM-1NF-κB p65正常組10182.789±11.024127.699±8.149模型組10266.652±9.207*337.820±15.523*黃芪葛根湯高劑量組10203.524±22.960＃190.964±17.259＃黃芪葛根湯中劑量組12208.494±18.869＃208.832±18.849＃△黃芪葛根湯低劑量組12245.746±13.796295.529±14.691?！鼷}酸二甲雙胍組10247.857±9.134152.591±9.969?！?/p>

2.2.6 黃芪葛根湯對DN 大鼠腎組織RAGE 表達的影響RAGE 蛋白陽性表達呈棕色或棕黃色。如圖9 所示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織RAGE 蛋白陽性著色覆蓋面積增多，蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪葛根湯各劑量組和鹽酸二甲雙胍組腎組織RAGE 蛋白陽性著色覆蓋面積減少，表達降低（P＜0.05），且黃芪葛根湯高級劑量組降低RAGE 蛋白表達的作用最佳。

圖9 各組大鼠腎組織RAGE 表達（×200，±s）

3 討論

近年來，DN 發(fā)病率持續(xù)攀升，給社會帶來沉重負擔［15］。中醫(yī)認為，消渴導致的腎損傷，是日久耗氣傷血，瘀血內阻所致，故主要治法是益氣養(yǎng)陰［16］。臨床使用黃芪葛湯治療糖尿病作用明顯，但具體作用機制尚不明確［8，17］。DN 患者FBG 水平可反應DN 的嚴重程度，FBG 水平低的DN 患者發(fā)展為ERSD 的風險較低［18］。DN 可導致蛋白尿和腎小球彌漫性硬化，進而發(fā)展為終末期腎衰竭［19］。本研究發(fā)現，經黃芪葛根湯給藥后，大鼠FBG 水平降低，透射電鏡觀察可見大鼠腎小球基底增厚和足細胞足突融合減輕，系膜基質減少，表明黃芪葛根湯可降低FBG，改善腎損傷。BUN、Scr 和UA 是評估腎臟功能的金指標［20-21］。腎小球發(fā)生損傷后，血清BUN、Scr 和UA 水平的升高多用于評估疾病嚴重程度［22］。本研究發(fā)現黃芪葛根湯可降低大鼠血清BUN、Scr 和UA 水平，改善腎功能。

本研究基于網絡藥理學預測黃芪葛根湯可能通過調節(jié)AGE-RAGE 通路及NF-κB 的表達治療DN。DN 高血糖環(huán)境可導致糖基化終末產物積累，氧化損傷腎細胞，使DN 惡化［23］。研究表明，降低TNF-α 表達可抑制氧化應激反應進而改善DN 癥狀［24］。高血糖會使機體呈高凝狀態(tài)，AGEs 結構穩(wěn)定，會大量累積，并與其受體RAGE 結合后激活AGERAGE 通路激發(fā)NF-κB 核轉錄因子，引起諸多異常反應，如血管通透性增加、促炎因子釋放等，造成腎組織的損傷［25-26］。NF-κB 會提高RAGE 的表達形成惡性循環(huán)，加劇腎損傷。VCAM-1 為免疫球蛋白超家族成員，DN 患者尿中VCAM-1 水平升高［27］。AGE-RAGE 通路可以使系膜細胞MCP-1 水平上調，引起單核與巨噬細胞浸潤和遷移，加速腎間質纖維化及腎小球硬化［28-29］。DN 的炎癥反應會激活IκB 激酶，釋放NF-κB p65，促進炎癥反應［30］。本研究結果顯示，黃芪葛根湯可降低DN 大鼠血清AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1 水平及腎組織VCAM-1、NF-κB p65 水平與RAGE 表達，緩解炎癥反應、纖維化等生物過程，發(fā)揮對DN 的治療作用，驗證了網絡藥理學的分析結果。

本研究在網絡藥理學預測黃芪葛根湯活性成分、靶標及作用通路的基礎上，通過動物實驗驗證黃芪葛根湯可能通過調節(jié)AGE-RAGE 信號通路，降低血清AGEs、TNF-α、VCAM-1、MCP-1 水平與腎組織VCAM-1、NF-κB p65 水平及RAGE 表達緩解炎癥反應及纖維化，減輕DN 大鼠腎臟損傷，發(fā)揮治療作用。但本實驗仍有局限性，第一，TCMSP等數據庫篩選的成分受限于中藥成分的理化性質，與煎煮后的成分并不等同，需通過HPLC 等進行檢測；第二，本研究尚未探討具體的藥物成分和藥物靶點的作用機制，需通過分子對接預測藥物小分子和藥物靶點的結合模式，并檢測親和力；第三，需結合細胞實驗，進一步分析作用機制；第四，后期仍需采用多種檢測手段，多角度驗證。