桑葉多糖提取及抑菌實驗研究

王世寬， 張代芳， 陳欲云

(四川理工學院a.生物工程學院；b.化學工程學院， 四川 自貢 643000)

桑葉多糖提取及抑菌實驗研究

王世寬a， 張代芳b， 陳欲云b

(四川理工學院a.生物工程學院；b.化學工程學院， 四川 自貢 643000)

以超聲波輔助水提醇沉法提取桑葉多糖，采用正交實驗法優(yōu)化桑葉多糖的提取工藝；采用濾紙片法進行抑菌試驗評價桑葉多糖體外抑菌作用。實驗考察提取時間、液固比、提取溫度等因素對桑葉多糖提取率的影響，觀察桑葉醇提物和桑葉多糖對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌抑制作用。實驗結(jié)果證明：超聲波提取時間50 min，液固比40:1(mL.g-1)，提取溫度為70 ℃，其桑葉浸提液中的多糖得率達到5.50%，體外抑菌實驗結(jié)果顯示桑葉醇提物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌有明顯的抑制作用，桑葉多糖對這兩種菌則沒有抑制作用。

桑葉；多糖；水提醇沉；抑菌作用

引 言

桑葉是?？浦参锷５娜~，栽培或野生，完整葉片呈寬卵形，葉片基部心臟形，頂端微尖，邊緣有鋸齒，葉脈密生白柔毛。氣淡，味微苦澀。中國多數(shù)地區(qū)多有生產(chǎn)[1]，特別是長江中下游及四川盆地。

桑葉不僅是蠶的“糧食”，在醫(yī)學方面也有很大的用途，桑葉最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有祛風清熱、涼血明目、補益之功效[2]。由于桑葉含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、鐵、鋅及維生素，并且還含有豐富的人體所需的必須氨基酸以及其他生物活性成分，所以很多學者已經(jīng)在積極研究藥食兩用的桑葉[3]。

桑葉中含有豐富的活性物質(zhì)，如黃酮及黃酮苷類、生物堿類、植物甾醇類、多糖類等[4]。生物堿是桑葉的主要活性成份[5]。桑葉中的桑葉多糖很豐富，具有顯著的降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化和抗病毒等多種藥理活性[6-7]。

我國桑葉資源豐富，但是目前桑葉利用只限于養(yǎng)蠶和加工葉類藥材，用途單一。所以桑葉資源的利用與開發(fā)勢在必行。相關(guān)文獻對桑葉多糖提取工藝的報道并不多見，本文通過正交實驗法優(yōu)化桑葉多糖的提取工藝。

1 材料與儀器

1.1 材料

桑葉購自藥房。其他藥品均為分析純。

1.2 儀器

恒溫鼓風干燥箱(上?，槴\實驗設備有限公司)，SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司)，F(xiàn)A1004電子天平(上海精科天平)，250HL恒溫恒濕培養(yǎng)箱(金壇市醫(yī)療儀器廠)，MP5002電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)，UV1000紫外可見分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 測定桑葉多糖含量和提取得率的方法

利用苯酚-硫酸法測定多糖含量[8-9]。10 mL容量瓶中放入樣品溶液0.5 mL，通過加水稀釋定容，吸取1 mL置于比色管中，加入1.0 mL 6%苯酚及5.0 mL 98%濃硫酸，搖勻冷卻，室溫放置20 min，于490 nm測光密度，以2.0 mL水按相同顯色操作為空白。根據(jù)多糖回歸曲線方程求得濃度。

多糖得率(%)=(多糖濃度×提取液體積×100)/樣品質(zhì)量

2.2 葡萄糖標準曲線的制作

采用苯酚-硫酸法。準確稱取葡萄糖0.020 g于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取1.8 mL、1.6 mL、1.4 mL、1.2 mL、1.0 mL、0.8 mL、0.6 mL及0.4 mL,各以蒸餾水補至2.0 mL，然后加入1.0 mL 6%苯酚及5.0 mL 98%濃硫酸，搖勻冷卻，室溫放置20 min，于490 nm測光密度，以2.0 mL水按相同顯色操作為空白，橫坐標為多糖微克數(shù)，縱坐標為光密度值，繪制標準曲線，線性回歸得到葡萄糖濃度與吸光度值的回歸方程。

2.3 桑葉樣品的處理

將購買的干桑葉粉碎，過80目篩。稱取干桑葉粉末10 g于脂肪抽提器，加入石油醚100 mL，90 ℃回流提取直至石油醚流為無色為止。

2.4 超聲波輔助水提醇沉法單因素試驗提取多糖

10 g桑葉粉末脫脂后，抽濾去石油醚，濾渣置于250 mL圓底燒瓶中，加入160 mL 80%乙醇，80 ℃回流提取1.5 h，減壓抽濾取沉淀物。超聲波功率控制在280 W，將沉淀物置于燒杯中，分別加入一定量的蒸餾水，在一定溫度和一定時間條件下超聲波提取，4000 rpm離心10 min，減壓抽濾，吸取濾液測定樣品吸光度，然后計算多糖含量。最后通過設計單因素試驗考查超聲波提取時間、液固比、提取溫度對多糖提取的影響。

2.4.1 超聲波提取時間對多糖得率的影響

10 g桑葉粉末脫脂后，抽濾去石油醚，濾渣置于250 mL圓底燒瓶中，加入160 mL 80%乙醇，80 ℃回流提取1.5 h，減壓抽濾取沉淀物。在液固比40:1(mL.g-1)和提取溫度60 ℃的條件下，選擇超聲波提取時間分別為30 min、40 min、50 min、60 min進行提取，考查提取時間對多糖得率的影響。

2.4.2 液固比對多糖得率的影響

10 g桑葉粉末脫脂后，抽濾去石油醚，濾渣置于250 mL圓底燒瓶中，加入160 mL 80%乙醇，80 ℃回流提取1.5 h，減壓抽濾取沉淀物。在超聲波提取時間50 min和提取溫度60 ℃的條件下，選擇液固比20:1、30:1、40:1、50:1(mL.g-1)進行提取，考查液固比對多糖得率的影響。

2.4.3 提取溫度對多糖得率的影響

10 g桑葉粉末脫脂后，抽濾去石油醚，濾渣置于250 mL圓底燒瓶中，加入160 mL 80%乙醇，80 ℃回流提取1.5 h，減壓抽濾取沉淀物。在液固比40:1(mL.g-1)和超聲波提取時間50 min的條件下，選擇溫度50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃進行提取，考查溫度對多糖得率的影響。

2.5 采用正交實驗優(yōu)化桑葉多糖的提取工藝

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取超聲波提取時間(A)、液固比(B)、提取溫度(C)做三因素三水平實驗，具體正交實驗設計見表1。

表1 正交實驗因素與水平設計表

2.6 桑葉多糖體外抑菌實驗

2.6.1 桑葉醇提物與桑葉多糖的準備

將干桑葉粉碎，過80目篩。稱取10 g，按照30:1的液固比加入70%乙醇，70 ℃水浴回流提取4 h。4000 rpm離心10 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容至10 mL，得桑葉醇提物備用。

桑葉多糖提取液濃縮至200 mL，加入粉末活性炭，于60 ℃保溫30 min，抽濾，取清液，在清液中加入無水乙醇使乙醇濃度達到80%，靜止12 h后進行過濾，將濾渣放入恒溫鼓風干燥箱中干燥，60 ℃烘干至恒重，得精制多糖[10]。配制濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.5%、3.0%多糖溶液。在105 ℃下的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌8～10 min，備用。

2.6.2 桑葉醇提物與桑葉多糖抑菌作用的比較

將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌菌種用適宜的斜面培養(yǎng)基進行活化，用無菌生理鹽水稀釋制成菌懸液。選擇吸水性強的濾紙用打孔器打成直徑為6 mm的圓形濾紙片，滅菌，取一濾紙片在無菌的桑葉醇提取液中浸泡1 h后取出，揮干溶劑；另取濾紙片在無菌的桑葉多糖溶液中浸泡24 h，于37 ℃烘干備用。

無菌操作，吸取0.1 mL的菌液涂布做成含菌平板，平行三組，在培養(yǎng)基表面相應位置放上含有桑葉醇提物的濾紙片，每皿三片，三份樣品；同法，含桑葉多糖的濾紙片，每皿四片，三份樣品，一份用無菌生理鹽水做對照。恒溫培養(yǎng)(37 ℃，24 h)，取出后測定抑菌圈直徑，比較抑菌效果。

3 結(jié)果與討論

3.1 葡萄糖標準曲線的繪制

按照2.2葡萄糖標準曲線的制作方法，以吸光度值為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線，如圖1所示。用最小二乘法進行線性擬合，標準曲線回歸方程為Y=0.0152x+0.0004，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9992。

圖1 葡萄糖標準曲線

3.2 超聲波輔助水提醇沉法單因素實驗結(jié)果

3.2.1 超聲波提取時間對多糖得率的影響

在提取溫度為60 ℃和液固比為40:1(mL.g-1)的條件下，提取時間對多糖得率的影響如圖2所示。由圖2可知，桑葉多糖得率受溫度的影響較大，隨著時間增加，桑葉多糖得率先升高再下降，在50 min時多糖得率最高。提取時間50 min為最佳。

圖2 超聲波提取時間對多糖得率的影響

3.2.2 液固比對桑葉多糖得率的影響

在超聲波提取時間50 min和溫度60 ℃提取條件下，選擇不同液固比進行提取，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，多糖得率隨著液固比的增加先升高再下降，當液固比超過40:1(mL.g-1)時，多糖得率減小，可見液固比選擇40:1(mL.g-1)最佳。

圖3 液固比對多糖得率的影響

3.3.3 提取溫度對多糖得率的影響

在超聲波提取時間50 min和液固比40:1(mL.g-1)的條件下，選擇不同提取溫度進行提取，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，提取溫度對多糖得率影響較大。多糖得率最佳溫度是70 ℃，隨后溫度升高得率開始下降，而60 ℃～70 ℃時，多糖得率沒有顯著變化，綜合成本，溫度60 ℃時最佳。

圖4 提取溫度對多糖得率的影響

3.4 桑葉多糖正交實驗結(jié)果

由正交實驗結(jié)果(表2)可知，根據(jù)統(tǒng)計學原理，極差R值越大，說明此因素對實驗的影響較大，由于RC>RB>RA，所以三個影響因素中C(提取溫度)對桑葉多糖的提取率影響最大，其次為B(液固比)，影響程度最小的是A(超聲波提取時間)，影響多糖提取得率的主次因素是C>B>A。

表2 正交實驗結(jié)果

由表2可知，A因素中K2值影響最大，B因素中K2值影響最大，C因素中K3值影響最大，桑葉多糖提取的最優(yōu)搭配水平為A2B2C3，即超聲波提取時間50 min，液固比為40:1(mL.g-1)，提取溫度為70 ℃，最佳組合時桑葉多糖得率達到5.50%。

由表3可知，在正交實驗優(yōu)化工藝基礎上，超聲波提取時間具有顯著性，說明超聲波縮短提取時間對桑葉多糖的提取率影響最大，這與丁銳[11]有關(guān)桑葉多糖的研究實驗結(jié)果相類似。

表3 正交實驗方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00。

3.4 抑菌實驗結(jié)果

采用濾紙片法研究桑葉醇提物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌試驗菌的抑制效果，以抑菌圈直徑的大小為衡量指標，實驗結(jié)果見表4和圖5。

表4 桑葉醇提取物的抑菌結(jié)果

注：“+”表示抑菌圈在8.0～10.0 mm，“++”表示抑菌圈在10.0 mm以上。

圖5 桑葉醇提物抑菌實驗結(jié)果

由文獻[12]可知，抑菌圈直徑8.0 mm≤r≤10.0 mm為抑菌較明顯，抑菌圈直徑r≥10.0 mm為抑菌明顯。由表4可知，桑葉醇提物對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有較強的抑制作用，抑制效果為枯草芽孢桿菌>大腸桿菌，這與陳佳佳[13]發(fā)現(xiàn)桑葉醇提取物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌有較強抑制作用的結(jié)論一致。桑葉醇提物具有抑菌活性，其抑菌主要成分可能是黃酮類[14]。

桑葉多糖抑菌作用結(jié)果見表5和圖6。由文獻[12]可知，抑菌圈直徑r<6.5 mm規(guī)定為無抑菌作用。在本次實驗中，5個濃度的多糖溶液對兩種試驗菌的抑菌圈均小于6.5 mm，因此桑葉多糖對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌都沒有抑菌作用。

表5 桑葉多糖的抑菌結(jié)果

注：“--”表示抑菌圈小于6.5 mm，無意義。

注：1-空白對照；2、3、4-均為樣品

有資料顯示，黃精多糖、黃芪多糖、香菇多糖、鐵皮石斛多糖等許多中藥多糖均具有抑菌活性[15-16]。，沈建林[17]實驗證明15%乙醇提取得到香蕉多糖對大腸桿菌具有抗菌作用。而在桑葉多糖抑菌實驗中，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌為指示菌，桑葉多糖溶液對這兩種試驗菌都沒有抑菌作用，結(jié)果與姜延偉[18]在黃連多糖的研究結(jié)論類似。這可能是因為桑葉多糖不具有抑菌活性，桑葉多糖的活性主要表現(xiàn)在其他方面，有待進一步深入研究。

4 結(jié)束語

桑葉多糖具有顯著的藥理活性，利用和開發(fā)前景廣闊，本文通過對桑葉多糖提取工藝的優(yōu)化，為桑葉多糖進一步開發(fā)利用做初步研究，其最佳提取工藝為超聲波提取時間50 min，液固比為40:1(mL.g-1)，提取溫度為70 ℃，在此工藝下，桑葉多糖得率達到5.50%，桑葉多糖對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌沒有抑制作用。

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Extraction and Antibacterial Experiment Research of Polysaccharide From Mulberry Leaves

WANGShikuana,ZHANGDaifangb,CHENYuyunb

(a.School of Bioengineering, b.School of Chemical Engineering, Sichuan University of Science & Engineering,Zigong 643000, China)

The polysaccharides from mulberry leaf were extracted by water and precipitated by alcohol with the help of ultrasonic. The extraction process of polysaccharides from mulberry leaves was optimized by orthogonal experimental method and the antibacterial effect of mulberry polysaccharide in vitro was evaluated by the filter paper method. The effects of extraction time, liquid-solid ratio and extraction temperature were investigated on the extraction rate of polysaccharide from mulberry leaves. The inhibitory effects of mulberry polysaccharide on Bacillus subtilis and Escherichia coli were observed. The experimental results show that the ultrasonic extraction time was 50min; liquid-solid ratio was 40∶1; extraction temperature was 70℃; and the extraction of mulberry leaf polysaccharide liquid yield reached 5.50%. The ethanolic extract from Mulberry leaves had obvious inhibitory effect on Bacillus subtilis and Escherichia coli. The polysaccharides of Mulberry leaves have no inhibitory effect on Bacillus subtilis and Escherichia coli.

mulberry leaf; polysaccharide; water extraction and alcohol precipitation; antimicrobial effect

2016-09-10

釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室項目(NJ2014-11)

王世寬(1964-)，男，重慶人，教授，碩士，主要從事食品科學與工程方面的研究，(E-mail)sclgsuse@163.com

1673-1549(2016)06-0001-05

10.11863/j.suse.2016.06.01

Q814

A