解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵優(yōu)化

王 楠，苑 暢，汪 瑞，淳于彥潔，吳雅雯，李金寶，丁重陽

(1. 江南大學生物工程學院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2. 江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122)

解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵優(yōu)化

王 楠1,2，苑 暢1，汪 瑞1，淳于彥潔1，吳雅雯1，李金寶1，丁重陽1,2

(1. 江南大學生物工程學院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2. 江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122)

對實驗室前期篩選到的一株解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensJNU002進行培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化。單因素實驗確定最佳碳源為乳糖，除麩皮外，其他氮源對產(chǎn)酶無明顯促進作用，KH2PO4和CaCO3等對產(chǎn)酶有促進作用。通過正交試驗確定最佳培養(yǎng)基成分為麩皮16 g/L、乳糖10 g/L、KH2PO41 g/L、CaCO31 g/L，其中麩皮對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶影響較大。在發(fā)酵溫度37 ℃、種子液培養(yǎng)時間18 h、接種量0.5%、500 mL搖瓶裝液量100 mL時，較適宜解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶。優(yōu)化后解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶活力達到12 766 SU/mL，比優(yōu)化前提高了3.5倍。

解淀粉芽孢桿菌；凝乳酶；優(yōu)化

凝乳酶是干酪制造過程中起凝乳作用的關(guān)鍵性酶，可專一性水解κ-酪蛋白肽鏈的Phe105-Met106之間的肽鍵，破壞牛奶穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使牛奶凝結(jié)，并對干酪的質(zhì)構(gòu)和特殊風味的形成起重要作用[1]。目前，將能夠使乳凝固的一類蛋白酶(如胃蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶等)統(tǒng)稱為凝乳酶[2]。

傳統(tǒng)用于奶酪生產(chǎn)使用的小牛皺胃酶受到來源和道德人文等多方面限制，已經(jīng)不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需求，各國學者開始不斷尋找凝乳酶新來源。近些年來，凝乳酶替代品的研究主要集中在3個方面：動物、植物和微生物。研究證實，哺乳動物如小豬、海豹、羊羔、水牛、貓等的胃中[3-6]和木瓜、無花果、菠蘿、生姜、合歡等[7-10]植物中均發(fā)現(xiàn)有凝乳效果的蛋白酶。微生物生長周期短、產(chǎn)酶種類多，不受原料供應、季節(jié)等因素的限制，后期提取方便，在凝乳酶替代品的研究中顯現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，如微小毛霉[11]、米黑毛霉[12-14]、枯草芽孢桿菌和粟疫霉等均可產(chǎn)凝乳酶。丁明亮等[15]對一株產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵條件優(yōu)化，凝乳酶活達1 129 SU/mL。Wu等[16]對一株產(chǎn)凝乳酶的枯草芽孢桿菌進行響應面優(yōu)化，得到凝乳酶活為1 048.02 SU/mL，較初始提高了428%。杭鋒等[17]篩選到一株高產(chǎn)凝乳酶的類芽孢桿菌，麩皮是其發(fā)酵產(chǎn)酶的理想培養(yǎng)基質(zhì)，對其進行培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，凝乳酶活達6 000 SU/mL。

本研究以實驗室前期篩選到的1株解淀粉芽孢桿菌為出發(fā)菌株，通過單因素實驗和正交設(shè)計，進行發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以期為其工業(yè)化生產(chǎn)應用提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

解淀粉芽孢桿菌Bacillusa-m-y-l-o-l-i-q-u-e-f-a-c-i-e-n-sJNU002，江南大學國家工程實驗室篩選并在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(CCTCC No.M2011045)。

麩皮，購于江蘇省無錫市青山市場；完達山脫脂奶粉，黑龍江省完達山乳業(yè)股份有限公司；福林酚試劑為生物純，其余試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基/初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：麩皮10，無水葡萄糖18，CaCO33，NaCl 5，MgSO45，KH2PO42；pH自然，裝液量100 mL，121 ℃滅菌30 min。

牛奶平板培養(yǎng)基(g/L)：脫脂奶粉30、瓊脂粉20；pH自然，115 ℃滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

平板活化：挑取甘油管中保藏的菌種在牛奶平板劃線，37 ℃培養(yǎng)36～40 h。

種子培養(yǎng)：從牛奶平板上挑取一環(huán)活化后的單菌落，接種于裝有100 mL液態(tài)培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)20 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：以體積分數(shù)0.3%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件與種子液相同。

1.4 酶活的測定

粗酶液的制備：取發(fā)酵液于12 000 r/min離心5 min去除菌體和不溶物，上清液即為待測粗酶液。

凝乳酶活力(MCA)測定采用Arima法[11]。

蛋白酶活力(protease activity，PA)的測定方法采用Arima 1967年提出的修正的Anson的方法：向2.5 mL、1.2%的酪蛋白溶液中加入0.5 mL酶溶液，35 ℃下準確反應10 min后加入2.5 mL(0.44 mol/L)三氯乙酸(TCA)結(jié)束反應。取1 mL反應后的上清液加入5 mLNa2CO3(0.55 mol/L)溶液中，并加1 mL福林酚試劑?；旌衔镌?0 ℃下保溫15 min顯色，并于660 nm處測定其吸光度。

(1)

式中：OD660—在660 nm波長下吸光度；M—吸光常數(shù)；V—反應液體積；T—酶液水解反應時間(10 min)；D—酶液稀釋倍數(shù)。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基成分對產(chǎn)酶的影響

1.5.1 麩皮添加量對產(chǎn)酶的影響

由于實驗菌株篩選自麩皮中，前期實驗已驗證麩皮對產(chǎn)酶有明顯促進作用，改變初始培養(yǎng)基中麩皮質(zhì)量分數(shù)為1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和2.0%，測定產(chǎn)酶情況，確定麩皮添加量。

1.5.2 碳源對產(chǎn)酶的影響

在麩皮添加量優(yōu)化后的基礎(chǔ)上，分別選取1.8%蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、糊精、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、玉米粉和甘油等為碳源，其他條件不變，以葡萄糖培養(yǎng)組為對照，測定產(chǎn)酶情況，確定最優(yōu)碳源。

選取最優(yōu)碳源，調(diào)整添加量為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%和3.5%，其他條件不變，測定產(chǎn)酶情況，確定最佳碳源添加量。

1.5.3 氮源對產(chǎn)酶的影響

在上述麩皮和碳源優(yōu)化基礎(chǔ)上，添加0.5%的有機氮源如酵母粉、胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、脲、干酪素、玉米漿、牛肉膏、豆粕粉等和0.25%無機氮源如KNO3、NH4Cl、NH4HCO3、(NH4)2SO4，其他條件不變，以不添加氮源培養(yǎng)基為對照，測定產(chǎn)酶情況，確定最優(yōu)氮源。

1.5.4 無機鹽對產(chǎn)酶的影響

以優(yōu)化麩皮和碳源后的培養(yǎng)基為對照(不添加無機鹽)，分別添加1、3和5 g/L的NaCl、KCl、NaH2PO4、KH2PO4、MgSO4、MgCl2和0.2、0.6、1.0 g/L的CaCl2和CaCO3，測定產(chǎn)酶情況，確定無機鹽作用。

1.5.5 微量金屬離子對產(chǎn)酶的影響

以優(yōu)化麩皮和碳源后的培養(yǎng)基為對照(不添加無機鹽)，分別添加2和5 mg/L的微量金屬離子，測定產(chǎn)酶情況，確定金屬離子作用。

1.5.6 正交試驗

選取單因素實驗中對產(chǎn)凝乳酶影響較大的幾種離子進行正交試驗。

1.6 發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響

將優(yōu)化培養(yǎng)基接種后分別放置在31、33、35、37和39 ℃搖床上培養(yǎng)，比較其產(chǎn)酶情況。種子液接種量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、3%、5%和7%，37 ℃培養(yǎng)，比較其產(chǎn)酶情況。將培養(yǎng)12、16、18、20、22、24、28、32和36 h種子液按最佳接種量接種，37 ℃下培養(yǎng)，比較其產(chǎn)酶情況。500 mL三角瓶中裝液量依次采用60、80、100、120、140、160、180和200 mL，比較其產(chǎn)酶情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基成分對產(chǎn)酶的影響

2.1.1 麩皮含量對產(chǎn)酶的影響

麩皮成分復雜，純麩皮培養(yǎng)基可支持B.amyloliquefaciensJNU002正常生長，前期已驗證麩皮對產(chǎn)酶有明顯促進作用。培養(yǎng)基中麩皮質(zhì)量分數(shù)與產(chǎn)酶關(guān)系如圖1所示。由圖1可知：初始培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)24 h后，各組酶活均達最高值，且其產(chǎn)酶水平在一定范圍內(nèi)隨麩皮質(zhì)量分數(shù)增加而上升，麩皮質(zhì)量分數(shù)為16 g/L時，凝乳酶活最高，此時MCA/PA也為最高值。根據(jù)MCA和MCA/PA變化，選取16 g/L麩皮含量進行下一步優(yōu)化。

圖1 麩皮質(zhì)量分數(shù)對凝乳酶活力和MCA/PA值的影響Fig.1 Effects of wheat bran concentration on milk-clotting enzyme activity and MCA/PA

2.1.2 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

不同碳源對B.amyloliquefaciensJNU002產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可見：殼聚糖對其產(chǎn)酶有抑制作用，添加后明顯抑制菌體生長及產(chǎn)酶。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉等碳源效果相近，乳糖和半乳糖為碳源時，菌體產(chǎn)酶水平明顯高于其他碳源，綜合考慮生產(chǎn)成本等原因，選取乳糖為最優(yōu)碳源。

圖2 不同碳源對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)酶影響Fig.2 Effects of different carbon sources on milk-clotting enzyme activity and MCA/PA

2.1.3 乳糖添加量的確定

乳糖添加量對B.amyloliquefaciensJNU002產(chǎn)酶的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：當乳糖添加量大于5 g/L時，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)酶已經(jīng)達到較高水平。隨著乳糖量的增加，MCA逐漸上升，但當乳糖超過20 g/L時，MCA有下降趨勢；乳糖質(zhì)量濃度為35 g/L時，由于碳源過量對菌體生長及產(chǎn)酶產(chǎn)生抑制作用，其產(chǎn)酶水平明顯降低。綜合考慮產(chǎn)酶成本與酶活水平，確定乳糖添加量為10 g/L。

圖3 乳糖添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of additive amount of lactoseon milk-clotting enzyme activity

2.1.4 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

氮源是微生物生長和合成酶必需的營養(yǎng)成分之一，常用氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。以不添加氮源培養(yǎng)基為對照，研究不同氮源對B.a-m-y-l-o-l-i-q-u-e-f-a-c-i-e-n-sJNU002產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出：添加有機氮源時，培養(yǎng)基產(chǎn)酶水平較之空白對照均下降；添加無機銨鹽后，菌體產(chǎn)凝乳酶水平明顯下降，添加硝酸鹽對產(chǎn)酶無明顯影響?？梢娞砑拥床⒉焕诮獾矸垩挎邨U菌產(chǎn)凝乳酶。此結(jié)果與吳進菊等[18]、王艷萍等[19]實驗結(jié)果一致，可能由于麩皮本身已含有足夠解淀粉芽孢桿菌正常生長代謝所需的氮源。

圖4 氮源添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sourceon milk-clotting enzyme activity

2.1.5 無機鹽對產(chǎn)酶的影響結(jié)果

無機鹽對微生物生長有重要作用，如構(gòu)成細胞的組成成分、調(diào)節(jié)細胞滲透壓、參與酶的合成和分泌等?？疾鞜o機鹽對B.amyloliquefaciensJNU002產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知：各組產(chǎn)凝乳酶水平均有所上升，其中添加5 g/L 的MgSO4、1 g/L的CaCl2和0.2 g/L的CaCO3效果最好。由于CaCO3添加量少且實驗組在24 h即達到最高產(chǎn)酶水平，后期可能由于發(fā)酵液pH上升導致發(fā)酵液酶活下降，而其余實驗組均在48 h達到最高產(chǎn)酶水平。從發(fā)酵周期考慮，選取CaCO3為首選無機鹽離子，其他無機鹽離子將在此基礎(chǔ)上進一步選擇。

圖5 添加不同無機鹽對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of different inorganic salton milk-clotting enzyme activity

圖6 添加CaCO3基礎(chǔ)上不同無機鹽對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of different inorganic salt on milk-clotting activity after adding CaCO3

為防止由于添加不同無機鹽離子間相互作用使培養(yǎng)基有效成分減弱，故在添加CaCO3基礎(chǔ)上再次進行無機鹽離子優(yōu)化，以添加CaCO3后培養(yǎng)基為對照，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：添加MgSO4和MgCl2后酶活明顯下降，鉀鹽和鈉鹽對產(chǎn)酶有明顯促進作用，且KH2PO4和NaH2PO4較KCl和NaCl對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶促進效果更佳，可能是由于磷酸鹽不僅為微生物生長提供了磷源，KH2PO4和NaH2PO4與CaCO3還可以形成緩沖體系，為微生物提供穩(wěn)定的生長環(huán)境。

2.1.6 微量金屬離子對產(chǎn)酶的影響結(jié)果

復雜成分培養(yǎng)基往往已經(jīng)含有多種微量金屬離子，以不添加金屬離子實驗組為對照，研究微量金屬離子對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知：添加CuCl2、ZnSO4、MnCl2、NiCl2和CoCl2等微量金屬離子后，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)酶水平略有所上升。但考慮到幾種金屬離子均為重金屬離子，為方便后續(xù)處理和環(huán)境因素，故培養(yǎng)基不添加微量金屬離子。

2.1.7 正交試驗結(jié)果與分析

選取單因素實驗中對產(chǎn)酶影響明顯的4個因素麩皮、乳糖、KH2PO4和CaCO3進行正交試驗，正交試驗結(jié)果和極差分析如表1和表2所示。

圖7 添加微量金屬對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effects of different amounts of other metal ionson milk-clotting activity

表1 正交實驗結(jié)果Table 1 The result analyses of orthogonal experiment

表2 極差分析Table 2 Range analysis

由表1和表2可知，4個考察因素的極差大小順序從大到小依次為A(麩皮添加量)、 D(CaCO3添加量)、B(乳糖質(zhì)量濃度)、C(KH2PO4質(zhì)量濃度)。由此可見，麩皮的添加量對其凝乳酶影響最大。實驗確定最優(yōu)組合培養(yǎng)基為麩皮16 g/L，乳糖10 g/L，KH2PO41 g/L，CaCO31 g/L。

2.1.8 驗證實驗結(jié)果

由于得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基參數(shù)不在正交試驗設(shè)計的9組內(nèi)，因此需要進行驗證實驗。采用最優(yōu)組合培養(yǎng)基進行平行驗證實驗，得到凝乳酶最高酶活為10 369 SU/mL。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化對產(chǎn)酶的影響

2.2.1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

圖8 發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of culture temperature onmilk-clotting enzyme activity

發(fā)酵溫度對微生物生長、產(chǎn)物合成代謝、發(fā)酵液的性質(zhì)等都有重要影響。發(fā)酵溫度過低，菌體生長緩慢，產(chǎn)酶延滯期較長，增加生產(chǎn)成本；發(fā)酵溫度過高，不適宜菌體生長，可能影響發(fā)酵產(chǎn)物活性。菌體發(fā)酵溫度對B.amyloliquefaciensJNU002產(chǎn)凝乳酶影響如圖8所示。由圖8可知：在一定范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的提高，菌體產(chǎn)酶水平逐漸上升，37 ℃為最適培養(yǎng)溫度。溫度大于37 ℃時，產(chǎn)酶水平下降，故選取37 ℃為最適培養(yǎng)溫度。

2.2.2 接種量對產(chǎn)酶的影響

接種量指接入種子液和培養(yǎng)基體積的比值，對菌體的生長速度和發(fā)酵周期都有一定影響。以優(yōu)化前接種量0.3%為對照，比較不同接種量對B.a-m-y-l-o-l-i-quefaciensJNU002產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖9所示。由圖9可以看出，接種量對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)酶影響相對較小，接種量在0.3%～0.7%范圍內(nèi)，產(chǎn)酶能保持較高水平，其中接種量為0.5%時產(chǎn)酶效果最好，而后隨著接種量的增加，產(chǎn)酶水平逐漸下降并趨于穩(wěn)定。

圖9 不同接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effects of inoculum amount on milk-clotting enzyme activity

2.2.3 種子液培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

種子液培養(yǎng)時間影響發(fā)酵過程中菌體的生長狀態(tài)，適宜菌齡的種子液可以縮短發(fā)酵周期。以培養(yǎng)24 h種子液為對照，研究種子液培養(yǎng)時間對B.amyloliquefaciensJNU002產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知：種子液培養(yǎng)時間對接種后發(fā)酵液最終酶活影響較小，為縮短接種后延滯期，確保最佳接種狀態(tài)，選擇指數(shù)生長中后期即18 h種子液接種。

圖10 種子液培養(yǎng)時間對凝亂酶活力的影響Fig.10 Effects of culture time on milk-clotting enzyme activity

2.2.4 搖瓶裝液量對產(chǎn)酶的影響

解淀粉芽孢桿菌是耗氧微生物，裝液量多少在很大程度上影響發(fā)酵液溶氧水平，裝液量越少，傳氧系數(shù)越大，進而影響菌體生長和產(chǎn)酶。考察搖瓶裝液量對B.amyloliquefaciensJNU002產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖11所示。由圖11可知：隨著搖瓶裝液量的增加，酶活逐漸下降，裝液量大于140 mL時，酶活迅速下降?？紤]到發(fā)酵過程裝液量過少時相對蒸發(fā)損耗較多，故選擇500 mL搖瓶中100 mL裝液量。

圖11 裝液量對凝亂酶活力的影響Fig.11 Effect of liquid volume on milk-clottingenzyme activity

3 結(jié)論

從實驗室前期篩選到的1株解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensJNU002出發(fā)，采用單因素實驗和正交試驗實驗對菌株產(chǎn)凝乳酶進行了培養(yǎng)基優(yōu)化和培養(yǎng)條件優(yōu)化，結(jié)果表明，麩皮16 g/L、乳糖10 g/L、KH2PO41 g/L、CaCO31 g/L、溫度37 ℃、種子液培養(yǎng)時間18 h、接種量0.5%、500 mL搖瓶裝液量100 mL時，較適宜解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶。優(yōu)化后培養(yǎng)基酶活達12 766 SU/mL，比優(yōu)化前提高了3.5倍。

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(責任編輯 管珺)

Optimizing of medium and fermentation conditions for milk-clottingenzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens

WANG Nan1,2,YUAN Chang1,WANG Rui1,CHUNYU Yanjie1,WU Yawen1,LI Jinbao1,DING Zhongyang1,2

(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

We optimized of culture medium and fermentation conditions to produce milk-clotting enzyme produced byBacillusamyloliquefaciensJNU002.The results of single factor experiments showed that the best carbon source was lactose;nitrogen source had no obvious promoting effect;KH2PO4and CaCO3had promoting effect on enzyme production.Through the orthogonal experiment, the optimum culture medium composition was obtained: bran 16 g/L,lactose 10 g/L,KH2PO41 g/L,CaCO31 g/L.Bran had great influence on milk-clotting enzyme production.The culture temperature was 37 ℃,incubation time of liquid seed was 18 h,inoculum amount was 0.5%,the liquid volume 100 mL/500 mL.In the optimized medium and under the optimized culture condition,milk-clotting enzyme activity ofBacillusamyloliquefaciensJNU002 reached 12 766 SU/mL an increase of 3.5 times.

Bacillusamyloliquefaciens； milk-clotting enzyme; optimization

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.010

2016-04-04

“十二五”國家科技支撐計劃(2013BAD18B02)；國家星火計劃重點項目(2015GA690004)；江蘇省重點研發(fā)計劃(現(xiàn)代農(nóng)業(yè))項目(BE2015306)；江蘇省產(chǎn)學研合作項目(BY2015019-36)

王 楠(1990—)，女，河北石家莊人，研究方向：發(fā)酵過程優(yōu)化控制；丁重陽(聯(lián)系人)，教授， E-mail:zyding@jiangnan.edu.cn

TQ925

A

1672-3678(2016)06-0054-07