ATP熒光檢測儀校準(zhǔn)方法研究

李月玥（廣州計量檢測技術(shù)研究院，廣州 510030）

ATP熒光檢測儀校準(zhǔn)方法研究

李月玥（廣州計量檢測技術(shù)研究院，廣州 510030）

ATP熒光檢測儀是現(xiàn)場水質(zhì)污染及現(xiàn)場環(huán)境物體表面細(xì)菌負(fù)載的快速檢測中逐漸普及的檢驗儀器，在衛(wèi)生檢測領(lǐng)域中起著重要作用。本文依據(jù)ATP熒光檢測儀的工作原理，初步建立一套可靠的校準(zhǔn)方法，并對其線性誤差測量不確定度進(jìn)行分析。

ATP熒光檢測儀；校準(zhǔn)方法；測量不確定度

在衛(wèi)生學(xué)評價中，細(xì)菌污染檢測是常規(guī)監(jiān)測項目。目前，細(xì)菌定量檢測通常采用瓊脂平板計數(shù)法，由于其操作復(fù)雜，耗費(fèi)時間長，很難滿足HACCP(Hazard Analysis and Critical Control Point) 體系中微生物污染的在線監(jiān)測[1]。20世紀(jì)80年代，英國首先研制ATP熒光檢測系統(tǒng)，隨后將其應(yīng)用于檢測微生物和食品殘渣[2]。

1 ATP熒光檢測儀工作原理

ATP熒光檢測儀依據(jù)ATP生物發(fā)光法的基本原理，即熒光素在熒光素酶催化下，由ATP激活，使之與氧結(jié)合，在結(jié)合過程中發(fā)出熒光[3]。其反應(yīng)如下圖1所示。當(dāng)反應(yīng)中的熒光素-熒光素酶達(dá)到飽和反應(yīng)量時，ATP含量與所釋放的熒光光子量成正比。有研究表明，活細(xì)胞數(shù)量的對數(shù)值與ATP生物熒光值的對數(shù)值之間存在良好的線性關(guān)系[4]。因此，ATP熒光檢測儀以相對熒光強(qiáng)度（relative light units，RLU）數(shù)值表示樣品中ATP的總量，進(jìn)而反映樣品中活細(xì)胞數(shù)量。

2 校準(zhǔn)方法分析

根據(jù)ATP熒光檢測儀的性能和工作原理，認(rèn)為測量線性誤差及測量重復(fù)性是影響其分析結(jié)果的主要技術(shù)指標(biāo)，必須進(jìn)行校準(zhǔn)確認(rèn)。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，ATP熒光檢測儀的測量結(jié)果受工作環(huán)境影響，特別是外界ATP干擾、環(huán)境溫度，以及測樣時間。因此，在測試時應(yīng)符合實驗室潔凈無ATP存在，環(huán)境溫度在（10 ～30）℃中某一設(shè)定溫度值下，測樣時間一致等條件。

根據(jù)實際情況，在儀器的量程范圍內(nèi)取4～5個測量點，使用無ATP超純水和ATP純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)準(zhǔn)確配置相應(yīng)濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。各測量點取10μL進(jìn)行檢測，測樣時間為30 s，重復(fù)測量3次，取平均值作為測量結(jié)果。按線性回歸法求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距和線性相關(guān)系數(shù)。按照公式（1）計算標(biāo)準(zhǔn)曲線測量中間點的誤差，即為儀器的線性誤差。

為了得到儀器的測量重復(fù)性，在滿足測試條件的情況下，選取中間測量點重復(fù)測量6次（取樣量為10μL，測樣時間為30 s），計算測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%），即為儀器的測量重復(fù)性。計算公式如下：

3 線性誤差測量不確定度分析

使用一臺性能穩(wěn)定，量程為（0.01～10.0） fmol的ATP熒光檢測儀，取0.01fmol、0.5 fmol、1.0 fmol、2.0 fmol、5.0 fmol為測量點，采用上述方法進(jìn)行校準(zhǔn)。測量線性誤差的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)如表1所示，測量重復(fù)性的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)如表2所示。

表1 測量線性誤差的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)

表2 測量重復(fù)性的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)

3.1 數(shù)學(xué)模型

本文中線性誤差的計算方法如公式（1）所示，其數(shù)學(xué)模型為：

方差：

靈敏系數(shù)：

則：

3.2 測量結(jié)果的不確定度分析

ATP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度≥ 98%，其相對擴(kuò)展不確定度小于2%（k=2），在2.0 fmol含量下，標(biāo)準(zhǔn)溶液含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.02fmol。

3）合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4）擴(kuò)展不確定度

在95%置信概率下取k=2，線性誤差測量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為：

4 結(jié)論

目前，關(guān)于ATP熒光檢測儀的國家計量校準(zhǔn)規(guī)范還未公布。本文根據(jù)ATP熒光檢測儀的工作原理，提出其測量線性誤差及測量重復(fù)性的校準(zhǔn)方法，并分析了線性誤差測量不確定度，對ATP熒光檢測儀的計量校準(zhǔn)具有重要的參考價值。

[1] Tanaka H, Shinji T, Sawada K, et al. Development and application of a bioluminescence ATP assay method for rapid detection of coliform bacteria[J]. Water Research, 1997, 31(8):1913-1918.

[2] Selan L, Berlutti F, Passariello C, et al. Reliability of a bioluminescence ATP assay for detection of bacteria[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30(7):1739-42.

[3] Mcelroy WD, Deluca MA. Firefly and bacterial luminescence: basic science and applications[J]. Journal of Applied Biochemistry,1983, 5(3):197-209.

[4] 廖如燕,陳胤瑜,華志濤,等.ATP生物熒光檢測法快速檢測水細(xì)菌污染的評價[J].旅行醫(yī)學(xué)科學(xué),2011,(6):5-11.

Calibration Method for ATP Fluorescence Detector

LI Yue-yue
(Guangzhou Institute of Measurement and Testing Technology, Guangzhou 510030, China)

The application of ATP fluorescence detector is more and more universal for the water pollution detection and the bacteria load on the object surface on the spot. It plays an important role in hygiene examination. Areasonable calibration method on the principle of ATP biological fluorescence method is established, and the measuring uncertainty of the linear error is analyzed.

ATP fluorescence detector; calibration method; measurement uncertainty

TH744.16

A

1672-6286(2016)8-0046-4

李月玥（1988-），女，河北保定人。碩士，主要從事化學(xué)及生物類儀器計量檢測工作和研究。