陜縣溫泉嗜熱菌分離與初步鑒定

◎張 晶

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院，河南三門峽，4 7 2 0 0 0）

陜縣溫泉嗜熱菌分離與初步鑒定

◎張 晶

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院，河南三門峽，4 7 2 0 0 0）

從陜縣溫泉水樣中分離純化出一株高溫菌W1，并對其生理生化特征進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：菌株W1為革蘭氏陽性桿菌，最適生長溫度65℃，最適pH為8，能夠利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖，淀粉水解、明膠水解、甲基紅實(shí)驗(yàn)及葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性；吲哚反應(yīng)、VP反應(yīng)和H2S反應(yīng)結(jié)果均為陰性；初步鑒定為嗜熱脂肪地芽孢桿菌屬。

溫泉；嗜熱菌；生理生化特征

溫泉是指水溫超過攝氏20℃的泉水，作為獨(dú)特的自然資源，其開發(fā)利用得到了高度重視[1]。陜縣位于三門峽市區(qū)西15公里處，區(qū)內(nèi)大營鎮(zhèn)溫塘有溫泉出露，該溫泉位于汾渭熱礦水帶弧形轉(zhuǎn)折處和山西裂谷邊緣基地，屬低礦化度淡溫泉，水溫適宜，富含偏硅酸、鍶、鋰、碘、硒、鐵等34種有益人體健康的微量元素和其他成分，是全國少有的優(yōu)質(zhì)礦泉水。嗜熱菌是一類能在45℃以上生長和繁殖的極端環(huán)境微生物，在食品[2]、工業(yè)[3]、生物浸礦、石油及煤炭的脫硫、發(fā)酵生產(chǎn)、污水處理等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。[4-5]

目前關(guān)于陜縣溫泉的研究主要集中在溫泉地質(zhì)和溫泉旅游開發(fā)兩個方面，針對陜縣溫泉微生物資源的研究尚未見報道，微生物是重要的分解代謝類群，其生物多樣性在維持生物圈和為人類提供廣泛而大量的未開發(fā)資源方面起著主要的作用[6]。因此，本研究對陜縣溫泉微生物的組成進(jìn)行分析，并對其中的嗜熱微生物進(jìn)行分離、篩選及理化鑒定，為陜縣溫泉微生物資源的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

溫泉水樣采集自陜縣溫塘村（111.10942E,34.71626N），泉水無色，溫度57℃，pH7.2，水樣采集方法主要參照《中華人民共和國地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行，取純水樣1000ml，置于保冷袋中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室分離。

1.2 嗜熱菌分離

取100ml水樣于5000r/min高速離心機(jī)中離心20分鐘，棄上清，將沉淀重懸于10ml無菌蒸餾水中，充分混勻備用。于無菌條件下采用平板涂布法對溫泉嗜熱菌進(jìn)行分離，60℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-72h。挑取單菌落平板劃線分離，直至分離出純菌種。

1.3 培養(yǎng)基

腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基（BHI分離細(xì)菌）[7]：蛋白胨10g，脫水小牛腦浸粉12.5g，脫水牛心浸粉5g，葡萄糖2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鈉2.5g，蒸餾水1000ml，pH7.2-7.6，115℃高壓滅菌20分鐘，備用。

高氏一號培養(yǎng)基（分離放線菌）：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.2-7.4，配制時，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，便攪拌邊加入其他成分，融化后，補(bǔ)足水分至1000ml，121℃滅菌20分鐘；

馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基（分離真菌）：葡萄糖10g，蛋白胨5g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，1/3000孟加拉紅100ml，瓊脂15-20g，蒸餾水800ml，121℃滅菌30分鐘；臨用前加入0.03%鏈霉素稀釋液100ml，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30μg。

1.4 嗜熱菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

挑取斜面純菌種接種于50ml液體BHI搖瓶中，60℃培養(yǎng)18h，使OD600達(dá)到1.0。取上述菌液2ml轉(zhuǎn)入100ml新鮮液體BHI搖瓶，實(shí)驗(yàn)過程中分別設(shè)置系列溫度（50℃、55℃、60℃、65℃、70℃）和pH（5、6、7、8、9）梯度，180r/min振蕩培養(yǎng)24-28h，測定OD600值，確定所分離嗜熱菌的最適培養(yǎng)溫度和pH。

1.5 嗜熱菌生理生化鑒定

參照相關(guān)文獻(xiàn)[8]及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》對所分離嗜熱菌的形態(tài)及生理生化性能進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫泉微生物群落結(jié)構(gòu)分析

樣品經(jīng)富集處理后，采用平板菌落培養(yǎng)法對溫泉樣品微生物群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。

陜縣溫泉可培養(yǎng)微生物總數(shù)在103cfu/ml，微生物群落結(jié)構(gòu)組成中，細(xì)菌占絕對優(yōu)勢，可培養(yǎng)數(shù)目達(dá)到5×103cfu/ml，放線菌數(shù)目為70cfu/ml，實(shí)驗(yàn)過程中雖經(jīng)過三次重復(fù)檢測，但馬丁氏培養(yǎng)基上均沒有菌落生長，未檢測到真菌。

陜縣溫泉泉水無色，溫度57℃，pH7.2，地?zé)崧癫剌^淺，成因?qū)俾∑饠嗔研?，主要化學(xué)成分為H2CO3· S04-Ca[9,10]。于新娟[6]等研究表明，溫泉微生物多樣性與地理位置、溫度、酸堿度和水化學(xué)成分相關(guān)。

2.2 嗜熱菌菌體形態(tài)

根據(jù)平板數(shù)量優(yōu)勢，從溫塘溫泉水樣中分離得到一株嗜熱菌W1，形態(tài)見圖1，平板菌落近圓形，直徑0.7-1cm，邊緣整齊，亮黃色，光滑潮濕，不透明。顯微鏡染色結(jié)果如圖1B所示，菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陽性。

2.3 嗜熱菌最適生長溫度

嗜熱菌W1自然生長環(huán)境溫度為57℃，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計以60℃為起點(diǎn)，上下浮動10℃，每5℃設(shè)置一個溫度梯度，共五個試驗(yàn)溫度。

如圖2所示，溫度對嗜熱菌生長影響明顯，培養(yǎng)前15h，菌體在各溫度下均生長迅速，15h后除70℃下菌體生長受到抑制外，其他溫度下菌體密度隨溫度升高增加，培養(yǎng)超過25h后，菌體濃度均出現(xiàn)下滑趨勢，由菌體生長曲線可知嗜熱菌W1在65℃下有最大生長量，因此W1的最適生長溫度為65℃。

表1 溫泉微生物群落結(jié)構(gòu)組成（cfu/ml）

圖1 嗜熱菌W1菌落形態(tài)（A）及菌體形態(tài)（B）圖

2.4 嗜熱菌最適pH

嗜熱菌W1自然生長環(huán)境pH值為7.2，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計以pH7為起點(diǎn)，上下浮動2個單位，每1個pH值下設(shè)置一個監(jiān)測點(diǎn)，共五個pH梯度。

pH對嗜熱菌生長影響如圖3所示，培養(yǎng)前25h，初始pH低于5或高于9時，菌體生長緩慢，其他pH下菌體密度隨pH升高而顯著增長，培養(yǎng)超過25h后，菌體濃度均出現(xiàn)下滑，由菌體生長曲線可知嗜熱菌W1的最適生長pH為8。

2.5 嗜熱菌生理生化特征

為進(jìn)一步了解嗜熱菌W1的生物學(xué)分類地位，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》鑒定項(xiàng)目進(jìn)行相關(guān)生理生化特征鑒定，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，所分離嗜熱菌W1能夠利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖，碳源利用形式多樣，適應(yīng)能力較強(qiáng)；淀粉水解、明膠水解、甲基紅實(shí)驗(yàn)及葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性；吲哚反應(yīng)、VP反應(yīng)和H2S反應(yīng)結(jié)果均為陰性；

結(jié)合平板菌落形態(tài)及顯微鏡鏡檢結(jié)果，初步判定所分離嗜熱菌W1為嗜熱脂肪地芽孢桿菌屬。

劉景圣[2]，吳紅萍[3]，萬滋衡[11]等分別從長白山溫泉、海南藍(lán)洋溫泉和湖北咸寧溫泉中分離到嗜熱菌，經(jīng)理化鑒定及分子生物學(xué)鑒定，所分離菌株均為芽孢桿菌屬微生物，此外李聰穎[12]、李楊霞[13]等學(xué)者也從相關(guān)研究中分離到芽孢桿菌嗜熱菌?？梢姕厝獦悠分刑N(yùn)含著豐富的芽孢桿菌資源。

目前嗜熱脂肪芽孢桿菌在食品、酶制劑等領(lǐng)域有較高的應(yīng)用，楊濤等利用嗜熱芽孢桿菌改善醬香型白酒品質(zhì)[14]。黃光榮等研究發(fā)現(xiàn)嗜熱芽孢桿菌可合成蛋白酶HS08[15]。董藝凝等對嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶進(jìn)行了研究[16]。汪璞等分離制備了T1脂肪酶[17]。下一步將對所分離嗜熱菌W1的產(chǎn)酶能力進(jìn)行分析。

本研究采用純培養(yǎng)方法對溫泉微生物群落結(jié)構(gòu)做了初步分析，但由于純培養(yǎng)方法僅能分離到自然環(huán)境中1%的微生物，存在分離量低的弊端，不能準(zhǔn)確的反映溫泉微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，因此，課題組將采用分子生物學(xué)方法做進(jìn)一步研究，加強(qiáng)陜縣溫泉微生物資源的開發(fā)和應(yīng)用，服務(wù)三門峽經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展。

圖2 溫度對嗜熱菌W1生長的影響

圖3 pH對嗜熱菌W1的影響

表2 嗜熱菌生理生化特征

3 結(jié)論

采用純培養(yǎng)方法分析了陜縣溫泉微生物群落結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果表明，可培養(yǎng)微生物達(dá)到103cfu/ml，細(xì)菌占絕對優(yōu)勢，放線菌次之，未檢測到真菌。分離出一株嗜熱菌W1，桿狀，革蘭氏陽性，最適生長溫度為65℃，最適生長pH為8，能夠利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖，碳源利用形式多樣，適應(yīng)能力較強(qiáng)；淀粉水解、明膠水解、甲基紅實(shí)驗(yàn)及葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性；吲哚反應(yīng)、VP反應(yīng)和H2S反應(yīng)結(jié)果均為陰性；初步鑒定為嗜熱脂肪地芽孢桿菌屬。

[1]張建.再論我國溫泉旅游的開發(fā)與利用[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境.2 0 0 5,1 9(6):6 7-7 2.

[2]劉景圣,許志超,劉回民,等.一株長白山溫泉高溫菌的分離鑒定[J].食品科學(xué),2 0 1 3,3 4(2 1):2 7 4-2 7 7.

[3]吳紅萍,張飛官,孟甜,等.溫泉嗜熱菌LY的分離鑒定及治理的初步研究[J].生物技術(shù),2 0 1 2,2 2(6):5 6-6 0.

[4]王柏婧,馮雁,王師鈺,等.嗜熱酶的特性及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)報,20 0 2,4 2:2 5 9-2 6 2.

[5]歐平.嗜熱菌的研究進(jìn)展[J].賀州學(xué)院學(xué)報,20 0 9,25(3):1 3 5-1 4 0.

[6]于新娟,王莉莉,賈盛佼,等.溫泉微生物多樣性與酶類分析[J].微生物學(xué)通報,20 1 4,4 1(1):1 3 0-1 35.

[7]王佳,易弋,夏杰,等.嗜熱微生物的分離及其產(chǎn)酶特性的初步研究[J].食品工業(yè).20 1 4,3 5(1 1):2 7 8-28 1.

[8]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2 0 0 1.

[9]梁亞紅,魯?shù)?伏牛山溫泉旅游文化建設(shè)[J].平頂山學(xué)院學(xué)報.20 1 0,25(2):1 1 9-1 21.

[1 0]張古彬,王現(xiàn)國,羅新杰.三門峽盆地地下熱水形成條件分析及保護(hù)研究[J].人民黃河,20 1 1,3(7):8 1-8 6.

[1 1]萬滋衡,龔逢萍.湖北咸寧溫泉嗜熱菌的分離與初步鑒定[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2 0 1 0,3 0(1 1):2 8 2 7-2 8 2 8.

[1 2]李聰穎,曾曉莉,石賢愛,等.福州溫泉嗜熱菌的分離與鑒定[J].福州大學(xué)學(xué)報,20 0 3,3 1(4):4 9 9-5 0 2.

[1 3]李楊霞,張心齊,林盈盈,等.我國中部地區(qū)溫泉嗜熱菌的分離及其產(chǎn)酶研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報:理學(xué)版,2 0 0 8,3 5 (2):20 4-2 0 9.

[1 4]楊濤,梁明峰,李國友,等.微生物技術(shù)在醬香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J].釀酒科技,2 0 1 1,4:20-2 4.

[1 5]黃光榮,應(yīng)鐵進(jìn).戴德慧,等.嗜熱芽孢桿菌蛋白酶HS 0 8的分離純化研究[J].食品科學(xué),2 0 0 7,28(4):1 7 9-1 8 2.

[1 6]董藝凝,陳海琴,張灝,等.嗜熱脂肪芽孢桿菌耐熱β-半乳糖苷酶功能位點(diǎn)的累積進(jìn)化研究[J].食品工業(yè)科技, 2 0 1 5,7:1 4 8-1 5 3.

[1 7]汪璞,王方華,唐慶蕓,等.固定化嗜熱嗜堿土芽孢桿菌T1脂肪酶的制備及其催化特性研究[J].現(xiàn)代食品科技. 2 0 1 5,31(5):1 7 5-1 8 0.

（責(zé)任編輯 卞建寧）

Q933

：B

：1671-9123（2016）01-0137-03

2015－12－05

張晶（1985-），女，河南三門峽人，三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品園林學(xué)院講師。