應(yīng)用等溫環(huán)介導(dǎo)擴增方法檢測蜜蜂殘翅病毒的研究

莊明亮，牛慶生，陳東海，王 志，李志勇，梁 勤

(1.吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 132108；2. 福建農(nóng)林大學(xué)，福州 350002)

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應(yīng)用等溫環(huán)介導(dǎo)擴增方法檢測蜜蜂殘翅病毒的研究

莊明亮1，牛慶生1，陳東海1，王 志1，李志勇1，梁 勤2*

(1.吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 132108；2. 福建農(nóng)林大學(xué)，福州 350002)

本文的目的在于建立用于臨床檢測殘翅病病毒(Deformed wing virus，DWV)的等溫環(huán)介導(dǎo)擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，為該疾病的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。在DWV基因保守序列設(shè)計4條引物，探究LAMP擴增的最優(yōu)條件，并與常規(guī)的PCR(polymerase chain reaction)檢測方法進行比較。建立的LAMP方法檢測下限為0.89 pg，靈敏度比PCR高100倍而且特異性好。臨床檢測顯示建立的LAMP方法可行、準確、方便、靈敏。針對DWV的LAMP建立的檢測方法為養(yǎng)蜂生產(chǎn)第一線檢測和預(yù)防DWV提供了技術(shù)支持，有一定的應(yīng)用價值。

殘翅病毒；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；檢測

蜜蜂殘翅病毒病是已報道的20種病毒病中最常見且具有高傳染性的疾病(Ellis and Munn，2005；Neumann，2010；賈慧茹等，2014)，病源為殘翅病毒(Deformed wing virus, DWV)，于上個世紀90年代初從日本發(fā)病西方蜜蜂Apismellifera分離獲得(Allen and Ball，1996)。DWV可以侵染蜜蜂發(fā)育幼蟲、蛹、成蜂的各個階段(Chen and Siede，2007)，發(fā)病的成蜂具有翅殘缺卷曲、體色變暗、腹部膨脹和失去飛行能力等癥狀，大面積發(fā)生往往于夏秋兩季(Tentchevaetal., 2004)。通常情況下DWV以隱性侵染方式存在蜂群，不表現(xiàn)明顯癥狀，在特殊條件下病毒被激活(Miranda and Genersch，2010)，但蜂群是如何從隱性狀態(tài)轉(zhuǎn)化成具有典型侵染特征直至致死狀態(tài)的機制仍不得而知。有研究表明殘翅病毒病的流行與爆發(fā)與蜂群內(nèi)的狄斯瓦螨Varroadestructor寄生密度有密切關(guān)系，但狄斯瓦螨的寄生不是該病發(fā)生的必要條件(Martinetal.，2010)。DWV通過工蜂飼喂行為水平傳播和侵染卵和精液垂直傳播。DWV具有分布廣泛性、高致病性等特點，已成為蜜蜂烈性傳染性疾病，給蜜蜂飼養(yǎng)管理上帶來極大地危害。

DWV屬于傳染性軟腐病毒科，由10140個核苷酸組成正義單鏈RNA(GenBank登陸號：AJ489744)，只有一個負責(zé)翻譯和復(fù)制的開放閱讀框，編碼328 ku的多聚蛋白前體，含有3個主要衣殼蛋白VP1(44 ku)、VP2(32 ku)和VP3(28 ku)(Gaetanaetal., 2006；梁勤和陳大福，2009)。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本學(xué)者Notomi于2000年發(fā)明的一種新的核酸擴增技術(shù)(Notomietal.，2000；Notomi and Nippon,2007)。LAMP是利用4條特殊設(shè)計的引物識別6個特定區(qū)域和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫60℃-65℃條件即可使目的DNA拷貝數(shù)擴增達到109，特異、高效的完成反應(yīng)。自此技術(shù)發(fā)明以來，已經(jīng)應(yīng)用于病毒病源體的檢測、細菌病源體的檢測、真菌病原體、寄生蟲病的檢測、動物胚胎性別的鑒別和轉(zhuǎn)基因食品的檢測等領(lǐng)域。蜜蜂殘翅病毒病在基層養(yǎng)蜂單位主要診斷手段為癥狀判斷，根據(jù)癥狀判斷具有明顯的滯后性，蜂群具有明顯癥狀時往往疾病已經(jīng)大面積爆發(fā)，錯過的病害防控的最佳時期。在一些有條件的單位可以用PCR技術(shù)進行檢測，但它具有操作復(fù)雜、特異性差、反應(yīng)時間長等弊端，而且需要特殊的PCR儀，使得無法在基層單位大面積推廣。病毒早期的檢測對病毒病的防控意義重大，而應(yīng)用LAMP檢測DWV未見報道。本研究以DWV的保守區(qū)域建立LAMP檢測方法，為基層養(yǎng)蜂生產(chǎn)的快速檢測提供新的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗用樣品來自福州閩侯蜂場和福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，黑蜂王臺病毒(Black queen bee viruses, BQCV)、蜜蜂囊狀幼蟲病毒(Sacbrood virus, SBV)、DWV來自蜂學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 試劑

TRlzol Reagent購自Ambion公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司，Dream Tap Green PCR Master Mix(2×)購自Thermo公司，2000 bp DNA Marker、Trans plus Ⅱ DNA Marker 購自Takara公司,DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)、10×Thermopol Buffer購自NEB公司，硫酸鎂(MgSO4)、甜菜堿(Betaine)購自Solarbio公司, DNA Marker、引物由上海生工生物工程有限公司合成，乙醇、異丙醇、氯仿、瓊脂糖及其他常用試劑均為分析純。

1.2.2 儀器

主要儀器有電泳儀購自北京六一儀器廠；5418離心機購自美國Eppendorf公司；凝膠成像儀購自上海培清生物技術(shù)有限公司; TU-1900紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器公司；DK-8D型電熱恒溫水槽購自上海精宏有限公司；PCR儀購自Applied Biosystems公司以及其他常用儀器。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成

通過生物學(xué)軟件Blast對GenBank中蜜蜂病毒基因進行序列分析得到保守基因序列。利用Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e/v4-manual/index.htmL)在線軟件設(shè)計LAMP引物，設(shè)計4條引物包括2條外引物(F3、B3)和2條內(nèi)引物(FIP、BIP)?？梢杂猛庖锍Ｒ?guī)PCR方法來鑒定引物。引物由上海生物工程公司合成，用無離子水稀釋放-20℃?zhèn)溆?表1)。

1.3.2 蜜蜂RNA提取及cDNA的合成

對蜜蜂成年工蜂去除足和翅，50-100 mg先加400 mL Trizol在冰上用研磨棒進行充分研磨，直到看不見成塊的幾丁質(zhì)外殼，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中再加600 mL Trizol，充分混勻，室溫放置5 min。10000 rpm,4℃離心10 min，取上清800 mL。加0.2 mL氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫放置3 min。10000 rpm,4℃離心10 min，取上清600 mL,盡量避免吸沉淀。使用加入0.5 mL的異丙醇，輕柔地混勻，室溫放置10 min。10000 rpm,4℃離心10 min，去上清，形成白色點狀沉淀。加-20℃冷藏的1 mL 75%乙醇，劇烈震蕩。7500 rpm,4℃離心5 min。去除上清，室溫晾曬5 min。沉淀溶于20-50 μL無酶水中，用槍吸吹混勻，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，建立20 μL反應(yīng)體系包括：MgCl2、5×buffer、Inhibitor、隨機引物、Transcriptaste、PCR Nucleotide Mix。42℃水浴延伸15 min，70℃,15 min的反轉(zhuǎn)錄酶滅活。所得到的cDNA產(chǎn)物作為LAMP反應(yīng)模板。

表1 LAMP引物

Table 1 Primers used for LAMP

引物Primer序列(5′-3′)PrimersequenceG+C(%)DWV?F3TCAATTATCAACGACACAGTT333DWV?B3TCAGCATTAAGTCGTGCA444DWV?FIPACAGGCAAACAAGTATCTTTCAAACAGGAAAAAGGGAATAAAACCTC362DWV?BIPAAGTCCGGTACAGTTTACCATACCTCGATAGGATGCCATAAAGTC444

1.3.3 LAMP檢測殘翅病毒方法的建立

配制25 μLLAMP初始反應(yīng)體系(表2)：

表2 殘翅病病毒LAMP體系建立

Table 2 The detection system of LAMP for DWV

成份Element使用量(μL)Amount10×ThermopolBufferdNTP(10mm/L)BstDNAPolymerase(8000U/mL)Betaine(10mm/L)MgSO4(100mm/L)FIP，BIP(40mm/L)B3，F(xiàn)3(10mm/L)模板TemplateddH2O2510102020050510補至25

1.3.4 DWV LAMP檢測體系主要條件優(yōu)化

1.3.4.1 LAMP體系中最佳反應(yīng)時間和溫度的確定

為獲得LAMP擴增的最優(yōu)體系和條件，依次對反應(yīng)溫度61℃、62℃、63℃、64℃、65℃進行梯度優(yōu)化。DWV-LAMP以30 min、45 min、60 min、75 min梯度優(yōu)化。反應(yīng)產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，根據(jù)所得條帶清晰和明亮程度來確定最佳反應(yīng)時間和溫度。

1.3.4.2 LAMP體系中最佳外引物與內(nèi)引物比例的確定

1.3.4.3 LAMP體系中最佳Betaine濃度的確定

選擇之前確定最佳的內(nèi)外引物比，以甜菜堿終濃度以0、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1 mmol/L、1.2 mmol/L、1.6 mmol/L、2.0 mmol/L分別進行優(yōu)化固定體系其他條件，進行LAMP反應(yīng)，根據(jù)擴增條帶清晰及明亮程度確定最終的最佳Betaine濃度。

1.3.4.4 LAMP體系中最佳MgSO4濃度的確定

選擇之前確定最佳的內(nèi)外引物比和Betaine濃度，DWV LAMP調(diào)整Mg2+終濃度以0、2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、10 mmol/L、18 mmol/L梯度優(yōu)化固定體系其他條件，進行LAMP反應(yīng)，根據(jù)擴增條帶清晰及明亮程度確定最終的最佳MgSO4濃度。

1.3.5 LAMP方法敏感性測定

用紫外分光光度儀檢測樣品RNA濃度，然后依次稀釋10倍，建立濃度梯度。用優(yōu)化好的DWV LAMP方法和一般的PCR法同時進行檢測。反應(yīng)結(jié)束取擴增產(chǎn)物，瓊脂糖電泳，成像儀觀察結(jié)果。

1.3.6 可視化LAMP特異性試驗

用可視化LAMP方法分別對BQCV、SBV、DWV進行擴增，即在原體系加入螯合好的1 μL鈣黃綠素染料，觀察顏色變化情況并用常規(guī)LAMP法電泳對比擴增反應(yīng)結(jié)果，驗證此LAMP方法的特異性和可視化LAMP的可行性。

1.3.7 臨床樣本的LAMP與PCR對比檢測

對本研究室采集的20頭意大利蜜蜂成蜂樣本按照步驟2中方法進行提取RNA及反轉(zhuǎn)錄cDNA進行LAMP及PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 DWV-LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

圖1 殘翅病毒LAMP體系優(yōu)化Fig.1 The optimization of LAMP for DWV注：M，DNA分子質(zhì)量標準；A，1-5泳道分別為反應(yīng)溫度61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；B，1-3泳道為反應(yīng)時間30 min、45 min、60 min、75 min；C，1-6泳道為DWV-LAMP外引物與內(nèi)引物比例；D，1-8泳道為甜菜堿終濃度0、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L、1.6 mmol/L、2.0 mmol/L；E，1-6泳道為Mg2+終濃度0、2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、10 mmol/L、18 mmol/L。Note: M, DNA marker; A, Lane 1-5 temperature 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃L.

2.2 LAMP外引物的PCR反應(yīng)與鑒定

1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性擴增可見清晰明亮的條帶，大小片段與預(yù)期216 bp相吻合(圖2B)。測序結(jié)果在NCBI中Blast與AJ489744對比覆蓋范圍86%，同源率達到96%，表明檢測樣本發(fā)現(xiàn)DWV,同時說明此LAMP引物可用于檢測DWV。

2.3 LAMP 與 PCR 的敏感性對比實驗

用已完成優(yōu)化的DWV LAMP體系與常規(guī)PCR同等條件下進行檢測，靈敏度結(jié)果顯示DWV LAMP體系可達8.9 fg的RNA模板(圖2A)、DWV PCR體系可達8.9 pg的RNA模板(圖2B)，說明DWV LAMP的靈敏度比常規(guī)PCR高100倍。

圖2 LAMP(A)與PCR(B)敏感性對比圖Fig. 2 The sensitivity comparison of LAMP and PCR注：M，DNA分子質(zhì)量標準；A，依次稀釋10倍DWV模板的LAMP瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，1-7: 8.9 ng、0.89 ng：89 pg、8.9 pg、0.89 pg、89 fg、8.9 fg；B，依次稀釋10倍DWV模板的PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，1-7，8.9 ng、0.89 ng、89 pg、8.9 pg、0.89 pg、89 fg、8.9 fg。Note: M，DNA marker; A, Agarose gel electrophoresis of LAMP products using 10-fold dilution DWV, 1-7,8.9 ng, 0.89 ng, 89 pg, 8.9 pg, 0.89 pg, 89 fg, 8.9 fg; B, Agarose gel electrophoresis of PCR products using 10-fold dilution DWV, 1-7,8.9 ng, 0.89 ng, 89 pg, 8.9 pg, 0.89 pg, 89 fg, 8.9 fg.

2.4 可視化DWV-LAMP的特異性試驗

用已完成優(yōu)化反應(yīng)的DWV-LAMP檢測，最終結(jié)果顯示只有DWV的cDNA反應(yīng)呈多梯形條帶出現(xiàn)，對照的BQCV、SBV的cDNA和陰性對照沒有多梯形條帶(圖3A)。熒光可視化結(jié)果只有DWV試管顯綠色熒光，其他陰性對照和BQCV、SBV試管顯橘色(圖3B)。

2.5 臨床樣本的檢測

檢測意大利蜜蜂20個樣品LAMP檢測陽性數(shù)量分別為11；PCR檢測陽性數(shù)量為7(表3)。PCR檢測陽性的樣品LAMP均顯示陽性，說明LAMP檢測準確度高。且LAMP陽性數(shù)量比PCR多檢出4個，說明LAMP檢測靈敏度高。且LAMP方法在在一個水浴鍋反應(yīng)儀器下比PCR節(jié)約2 h。

表3 LAMP和PCR對臨床樣本檢測結(jié)果

Table 3 Results of LAMP and PCR for clinical samples

品種Variety方法Methods樣品數(shù)Samples陽性檢測數(shù)Positivecounts意大利蜜蜂LAMP2011ApismelliferaligusticaPCR207

3 結(jié)論與討論

蜜蜂的殘翅病毒病是由病原體DWV所引起的一種病害，感染率高嚴重危害蜜蜂群勢健康發(fā)展。提前、快速、準確的發(fā)現(xiàn)病原對于早期病害的防控至關(guān)重要。

圖3 DWV LAMP反應(yīng)特異性擴增結(jié)果Fig. 3 LAMP specific amplified products of DWV注：M， DNA分子質(zhì)量標準；A，DWV-LAMP反應(yīng)特異性瓊脂糖凝膠電泳圖：1，殘翅病毒；2，黑蜂王臺病毒；3，囊狀幼蟲病毒；4，陰性對照；B，熒光可視化特異性試驗：1， 殘翅病毒；2， 黑蜂王臺病毒；3， 囊狀幼蟲病毒；4，陰性對照。Note: M, DNA marker; A, LAMP specific amplified products of DWV:1,DWV, deformed wing virus;2,BQCV, black queen bee viruses;3,SBV, sacbrood virus; 4,Negative control; B,the visual observation of specific amplified products of BQCV:1,DWV, deformed wing virus;2,BQCV, black queen bee viruses;3,SBV, sacbrood virus;4, Negative control.

目前應(yīng)用檢測DWV技術(shù)主要有免疫學(xué)方法及PCR方法。免疫學(xué)方法存在操作時間長、敏感性和特異性低、有效的抗血清不易尋找等弊端。隨著PCR技術(shù)發(fā)展，現(xiàn)已成為主流的DWV檢測方法，但在生產(chǎn)實踐中，PCR檢測方法需要特定的儀器和較長的時間，在一些基層單位無法應(yīng)用。而LAMP技術(shù)是一種等溫核酸擴增技術(shù)，通過可視化方法，整個反應(yīng)過程只需要恒溫水浴鍋在一個小時內(nèi)即可完成檢測，LAMP方法發(fā)明至今已被廣泛用于多種病原體的檢測，如兔出血病癥病毒(原冬偉等，2013)、禽流感病毒(Dinhetal., 2011)、家蠶核型多角體病毒(唐芬芬等，2013)等。本試驗經(jīng)過多次驗證及重復(fù)性試驗優(yōu)化后的LAMP體系對SBV、BQCV的檢測均為陰性，表明所建立的DWV-LAMP體系特異性強；而且DWV-LAMP方法檢測靈敏度比DWV用PCR靈敏度高出100倍，可用于DWV的早期診斷。建立的DWV LAMP可視化反應(yīng)體系，只需在水浴鍋中反應(yīng)65 min即可觀察結(jié)果。

LAMP的引物設(shè)計工作在整個實驗中起十分關(guān)鍵的作用。由于LMAP設(shè)計要針對靶基因序列6個區(qū)域設(shè)計4條引物，要求靶基因序列的保守性較高。首先通過NCBI找到DWV同屬其他病毒基因的全序列，通過DNAman軟件進行序列對比，找到同源性高的區(qū)域，這是在長期進化變異過程中保守的部分；對照在國內(nèi)的不同亞型，發(fā)現(xiàn)這3種亞型基因序列上差異不大，找到的大約800 bp的序列。而且可以設(shè)計2-3對引物，通過引物篩選設(shè)計成功率比較高。具體的引物設(shè)計過程需要注意如下幾步：1)5′端F2區(qū)域到B2區(qū)域之間的距離控制在120-180 bp，F(xiàn)1、F2、F3和B1、B2、B3各個區(qū)域間距在18-20 bp；2)引物Tm值：富含AT片段55℃-60℃，富含GC片段60℃-65℃。6個區(qū)域的TM值滿足：F2>F3、B3；B2

本研究建立的LAMP方法和可視化LAMP方法具有操作簡便、快速、靈敏度高等特點，可用于快速準確診斷出殘翅病毒，對病毒侵染初期時，為蜜蜂殘翅病毒病診斷、防治提供了一種準確、簡便的新方法。為提前預(yù)防有效防控該病和降低蜂產(chǎn)品中藥物殘留提供了技術(shù)保障，對日后蜜蜂病害診斷和檢測必能起到促進作用。

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Diagnosis of the deformed wing cell virus(DWV)by loop-mediated isothermal amplification

ZHUANG Ming-Liang1，NIU Qing-Sheng1，CHEN Dong-Hai1，WANG Zhi1，LI Zhi-Yong1，LIANG Qin2*

(1. Apiculture Science Institute of Jilin Province, Jilin 132108, China; 2.Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

The objective of this study is to establish a simple, fast and accurate method to deformed wing virus(DWV) in clinical by using loop-mediated isothermal amplification(LAMP), which provides an experimental proof for controlling the disease. Four primers were designed based on six conserved regions of gene sequence on DWV, and were used for exploring the optimal LAMP amplification conditions. And the LAMP amplification result was compared conventional PCR(polymerase chain reaction) method. The established LAMP could detect as low as 0.89 pg DNA, which was 100 times sensitive than PCR method. Clinical result showed LAMP could be used to detect DWV whatever in Italian bee (Apismelliferaligustica) or in Chinese bee(A.ceranacerana), and the real positive detected ratio was 20% higher than PCR tested. The established LAMP was practical valuable for detecting and controlling the DWV in honeybee keeping.

Deformed wing virus; loop-mediated isothermal amplification; detection

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金(CARS-45-KXJ7)

莊明亮，男，1989年生，吉林遼源人，碩士研究生，E-mail: mingliang89@126.com

*通訊作者Author for correspondence，E-mail: lq-fz@163.com

2015-12-21；接受日期：2016-03-16

Q963; S893.3

A

1674-0858(2016)06-1192-07