一種從小卷蛾斯氏線蟲懷卵成蟲制備感染期幼蟲的簡易方法

顏 珣，韓日疇

(廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實驗室，廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實驗室，廣州 510260)

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一種從小卷蛾斯氏線蟲懷卵成蟲制備感染期幼蟲的簡易方法

顏 珣，韓日疇*

(廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實驗室，廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實驗室，廣州 510260)

昆蟲病原線蟲是新型的生物殺蟲劑，其感染期幼蟲是昆蟲病原線蟲產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的唯一蟲態(tài)，對昆蟲病原線蟲基因功能的研究及轉(zhuǎn)基因改造有助于推進(jìn)昆蟲病原線蟲的產(chǎn)業(yè)化。本研究基于昆蟲病原線蟲“噬母現(xiàn)象”的原理，以不同的孵育液孵育小卷蛾斯氏線蟲Steinernemacarpocapsae的懷卵成蟲，找到可以簡單快速從懷卵成蟲直接獲得整齊齡期的感染期幼蟲的方法，為該線蟲卵或性腺的RNA干擾后感染期幼蟲的收集及生物測定提供基礎(chǔ)，為昆蟲病原線蟲的轉(zhuǎn)基因改造以提高其環(huán)境耐受力提供技術(shù)支持。

小卷蛾斯氏線蟲；感染期幼蟲；噬母現(xiàn)象；體外誘導(dǎo)；生物防治

昆蟲病原斯氏屬Steinernema與異小桿屬Heterorhabditis線蟲是國際上新型的生物殺蟲劑，具有廣泛的寄主范圍；對寄主特別是對土棲性及鉆蛀性害蟲具主動搜尋能力；對人畜、環(huán)境安全，易于大量培養(yǎng)，使用方便，在環(huán)境中可循環(huán)利用，已經(jīng)商業(yè)化應(yīng)用于各種重要害蟲的安全防治(Grewaletal.，2005；Georgisetal.，2006；Kayaetal.，2006；Laceyetal.，2015)。在我國，昆蟲病原線蟲也已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)和銷售，并應(yīng)用于防治多種農(nóng)林、草地、花卉以及衛(wèi)生等害蟲，結(jié)果令人鼓舞(Grewaletal.，2005；韓日疇等，2008；顏珣等，2014)。

昆蟲病原線蟲是與其體內(nèi)?；詳y帶的共生菌一起致死寄主昆蟲的。昆蟲病原線蟲以感染期幼蟲(Infective juvenile，IJ)隨寄主食物或從昆蟲的自然開口(如肛門、氣孔)、節(jié)間膜進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，隨后釋放腸腔中攜帶的共生菌。線蟲及其共生菌分泌毒素(毒性因子)導(dǎo)致昆蟲死亡，然后利用寄主體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)繁殖后代。昆蟲病原線蟲的生活史包括卵、一至四齡幼蟲和成蟲階段。感染期幼蟲是昆蟲病原線蟲生活史中唯一具有殺蟲能力的蟲態(tài)，此齡期幼蟲可自由生活于寄主體外，一般滯育不取食，對外界不良環(huán)境的耐受能力強(qiáng)，是昆蟲病原線蟲產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的目標(biāo)蟲態(tài)(Poinar，1990；Adams and Nguyen，2002)。

昆蟲病原線蟲卵纏在母體內(nèi)并在母體內(nèi)孵化，在感染期幼蟲形成之前，幼蟲取食母體組織，該過程稱為“噬母過程”(endotokia matricida)，母體組織的利用有利于將昆蟲營養(yǎng)轉(zhuǎn)化為感染期幼蟲的生物能量(Steiner，1929；Baliadietal.，2001)。在外界營養(yǎng)供給不足或者環(huán)境惡劣時，噬母現(xiàn)象可以保證感染期幼蟲的形成以確保昆蟲病原線蟲的存活。在昆蟲病原線蟲感染寄主昆蟲體內(nèi)或在體外進(jìn)行培養(yǎng)時，由于有充足的營養(yǎng)，感染期幼蟲恢復(fù)后經(jīng)歷多代才形成新的感染期幼蟲。

本研究以不同的孵育液孵育小卷蛾斯氏線蟲Steinernemacarpocapsae的懷卵成蟲，以尋找最快獲得由卵直接誘導(dǎo)形成感染期幼蟲的方法，為小卷蛾斯氏線蟲卵或性腺的RNA干擾后感染期幼蟲的收集及生物測定提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲病原線蟲

小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsaeAll的感染期幼蟲由廣東省昆蟲研究所以人工固體培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得(韓日疇等，1997)，以淺水層方法貯存于10℃±1℃條件下，貯存期不超過15 d。

1.2 孵育液

用于懷卵成蟲孵育的溶液包括純水，0.9%氯化鈉溶液(NaCl)，PBS(0.85% NaCl，0.22% NaH2PO4，0.04% NaH2PO4，pH7.0)，Ringer’s液1(0.9% NaCl，0.04% KCl，0.05% CaCl2，0.02% NaHCO3)，Ringer’s液2(0.58% NaCl，0.01% KCl，0.02% CaCl2，0.02% MgCl2·6H2O，0.12% HEPES)，P溶液(1%蛋白胨，1% NaCl)，LB培養(yǎng)液(1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl)，NB培養(yǎng)液(1.8%營養(yǎng)肉湯)。配制好各孵育液，于121℃，1.05 kPa滅菌30 min，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 感染期幼蟲的誘導(dǎo)

將感染期幼蟲接種到長好XenorhabdusnematophilaAll共生細(xì)菌的NBO培養(yǎng)基上(營養(yǎng)肉湯，1.5%瓊脂粉，1%玉米油)，每日觀察感染期幼蟲發(fā)育情況，約3 d后線蟲發(fā)育成成蟲且懷有成熟的卵。在超凈工作臺內(nèi)用無菌Ringer’s液1將懷卵成蟲洗出，清洗懷卵成蟲3次。于96孔板內(nèi)每孔加入50 μL的孵育液，每種孵育液12個孔，每孔挑入1條懷卵成蟲，每個處理重復(fù)3次。封口膜封口，26℃孵育。每24 h觀察卵孵化及幼蟲發(fā)育情況，觀察兩周。實驗用不同批次的共生細(xì)菌和昆蟲病原線蟲重復(fù)2次。

1.4 感染期幼蟲對大蠟螟的感染力

在培養(yǎng)皿中測定線蟲對大蠟螟的感染力(Yanetal.，2012)。收集形成的感染期幼蟲，無菌水重懸，在墊有2層中速定性濾紙(新華牌)的滅菌培養(yǎng)皿(6 cm)中挑入5頭大蠟螟末齡幼蟲，然后均勻滴入1 mL含有100條在純水中形成的感染期幼蟲，封口膜封好后置于25℃黑暗條件下，對照為無菌水處理的大蠟螟。3 d后檢查大蠟螟的死亡情況，5 d后解剖大蠟螟，檢查線蟲侵染及發(fā)育情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

計算懷卵成蟲的存活率，卵孵化的比例，感染期幼蟲形成最短時間，全部幼蟲形成感染期幼蟲的時間，單條懷卵成蟲最終形成感染期幼蟲的數(shù)量，以及感染期幼蟲對大蠟螟的致死率。統(tǒng)計分析使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行。百分?jǐn)?shù)值均經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，采用Duncan檢驗各處理之間的差異顯著性，顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷卵成蟲存活及卵孵化情況

懷卵成蟲在P，LB和NB溶液中的存活時間及比例見表1，在這3種孵育液中，由于細(xì)菌的大量生長，孵育液變混濁，懷卵成蟲最短僅存活1 d，最長3 d即死亡。成蟲體內(nèi)卵不孵化，會釋放部分卵到體外，LB溶液中釋放的卵不孵化，P和NB溶液中有部分卵可孵化至1齡幼蟲后死亡(比例分別為58.3%及37.5%)。懷卵成蟲在其他5種孵育液中均可以存活至體內(nèi)卵孵化后耗盡成蟲營養(yǎng)，體外卵均可孵化并發(fā)育至2齡幼蟲。

表1 懷卵成蟲在不同孵育液中的存活時間及存活率

注：不同字母表示相同處理時間下不同孵育液中懷卵成蟲的存活率之間存在顯著性差異(Duncan檢驗，P<0.05)。Note: Different letters show significant differences among survival rates of the gravid female adults in different incubation buffers at the same treated time (Duncan’s test,P<0.05).

2.2 感染期幼蟲的形成

不同孵育液中開始形成感染期幼蟲的時間見圖1。感染期幼蟲在純水中最快形成，最快僅需要2.5 d的時間即可觀察到感染期幼蟲的形成；感染期幼蟲在PBS溶液中形成所需要的時間最長，最長需要6 d才能觀察到感染期幼蟲的形成。

圖1 感染期幼蟲(Infective juveniles，IJ)在不同孵育液中開始形成時間Fig.1 Time for the first infective juvenile(IJ) formation in different incubation buffers注：不同字母表示感染期幼蟲形成的時間之間存在顯著性差異(Duncan檢驗，P<0.05)。Note: Different letters show significant difference among IJ formation time in different incubation buffers (Duncan’s test, P<0.05).

在觀察的2周時期內(nèi)，孵育單條懷卵成蟲的8種孵育液中，僅在純水及兩種Ringer’s液中可觀察到2齡幼蟲全部轉(zhuǎn)化成感染期幼蟲，所需的時間見圖2。2周內(nèi)，其他孵育液中的幼蟲或全部死亡，或者仍未完全轉(zhuǎn)變成感染期幼蟲。

圖2 孵育孔內(nèi)全部形成感染期幼蟲(Infective juveniles，IJ)時間Fig. 2 Times for all the infective juveniles (IJ) formation in different incubation buffers注：不同字母表示感染期幼蟲全部形成的時間之間存在顯著性差異(Duncan檢驗，P<0.05)。Note: Different letter shows significant difference among IJ formation time in different incubation buffers (Duncan’s test, P<0.05).

2.3 單條懷卵成蟲形成感染期幼蟲的數(shù)量及感染力

單條懷卵成蟲產(chǎn)生的感染期幼蟲的數(shù)量見圖3。單條懷卵成蟲產(chǎn)生的感染期幼蟲數(shù)量差異較大，實驗中觀察到在純水中最多能形成66條感染期幼蟲，單條懷卵成蟲平均能形成21±5條感染期幼蟲。兩種Ringer’s溶液中由于感染期幼蟲形成耗時較長，線蟲在孵育過程中死亡，因此全部幼蟲形成感染期幼蟲的最終數(shù)量顯著下降，在Ringer’s 1和Ringer’s 2溶液中最高僅為21和13條。形成的感染期幼蟲感染大蠟螟3 d后大蠟螟死亡率為100%(對照大蠟螟全部存活)；5 d后解剖大蠟螟，體內(nèi)由感染期幼蟲發(fā)育而成的母蟲已死亡，幼蟲已發(fā)育至2-3齡。10 d后可觀察到有感染期幼蟲爬出大蠟螟尸體。

圖3 孵育孔內(nèi)全部形成感染期幼蟲(Infective juveniles，IJ)時感染期幼蟲數(shù)量Fig.3 Numbers of infective juveniles (IJ) produced from one gravid female adult in each incubation buffer注：不同字母表示不同孵育液中感染期幼蟲數(shù)量之間存在顯著性差異(Duncan檢驗，P<0.05)。Note: Different letter shows significant difference among IJ numbers in different incubation buffers (Duncan’s test, P<0.05).

3 結(jié)論與討論

本研究選用了8種孵育液來孵育小卷蛾斯氏線蟲的懷卵成蟲，觀察懷卵成蟲在不同孵育液中的存活及卵的孵育情況，以及感染期幼蟲誘導(dǎo)形成的情況。結(jié)果表明在含有營養(yǎng)物質(zhì)的孵育液中(P，LB和NB溶液)，由于共生細(xì)菌的大量生長，懷卵成蟲體內(nèi)卵無法孵化，懷卵成蟲3 d即全部死亡；雖然有從母體排出的卵在孵育液P和NB溶液中能夠孵化并發(fā)育，但生長至1齡幼蟲末期即死亡。而在另外5種孵育液中，共生細(xì)菌不能大量生長，懷卵成蟲均能存活。懷卵成蟲會將部分卵排出體外，卵可在體外孵化并發(fā)育；懷卵成蟲體內(nèi)部分卵會在母體內(nèi)孵化，出現(xiàn)噬母現(xiàn)象，母體營養(yǎng)耗盡后以2齡幼蟲，或由2齡幼蟲向感染期幼蟲轉(zhuǎn)變的蟲態(tài)出母體，在孵育液中繼續(xù)以2齡幼蟲存活或形成感染期幼蟲。在選擇的5種孵育液中，純水中是最先誘導(dǎo)出感染期幼蟲的，也是所有幼蟲都轉(zhuǎn)變成感染期幼蟲所需時間最短的。

Johnigk & Ehlers(1999)研究了H.bacteriophora和H.megidis線蟲噬母現(xiàn)象發(fā)生的過程及其功能，發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)成分不如LCM培養(yǎng)液的Ringer’s液中，噬母現(xiàn)象發(fā)生更早；Baliadi等(2001)研究了H.bacteriophora，S.glaseri和S.carpocapsae等3種線蟲在Ringer’s液1，營養(yǎng)瓊脂及加了共生細(xì)菌的營養(yǎng)瓊脂上發(fā)生噬母現(xiàn)象的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Ringer’s液1中，噬母現(xiàn)象發(fā)生的比例最高，發(fā)生噬母現(xiàn)象的成蟲數(shù)量幾乎是在另外兩種孵育液中數(shù)量的兩倍。這與本研究的結(jié)果一致，在低水平食物供應(yīng)的情況下會顯著刺激噬母現(xiàn)象的發(fā)生，共生細(xì)菌的存在會延長成蟲產(chǎn)卵的周期，從而推遲噬母現(xiàn)象的發(fā)生(Johnigk and Ehlers，1999)。本研究發(fā)現(xiàn)，在純水中發(fā)生噬母現(xiàn)象的成蟲，其后代能在少于1周的時間內(nèi)全部形成IJ，全部形成IJ的時間顯著短于在兩種Ringer’s液中所需的時間，而營養(yǎng)成分介于純水和Ringer’s液中的生理鹽水及PBS中，則無法誘導(dǎo)獲得全部的感染期幼蟲，這其中的原因有待進(jìn)一步研究。

在懷卵成蟲出現(xiàn)噬母現(xiàn)象時，分泌到母體外的卵孵化后，在饑餓的情況下會提高其直接形成感染期幼蟲的比例(Strauchetal.，1994)。本研究中，雖可觀察到懷卵成蟲在發(fā)生噬母現(xiàn)象之前，會將一部分卵排出體外，這些排出體外的卵在不同的孵育液中均可孵化并發(fā)育，但存活時間不長，且不能最終發(fā)育成感染期幼蟲。

Baliadi等(2001)在研究3種昆蟲病原線蟲感染大蠟螟后產(chǎn)生的懷卵成蟲在Ringer’s液1中孵育后的感染期幼蟲產(chǎn)量時發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)3代的S.carpocapsae懷卵成蟲中，噬母現(xiàn)象發(fā)生后能產(chǎn)生的感染期幼蟲的比例最高僅為40%，得不到全部為感染期幼蟲的情況，第3代成蟲的IJ產(chǎn)量每條懷卵成蟲僅約為20條，而H.bacteriophora，S.glaseri則在第3代時可以最終獲得整齊齡期的感染期幼蟲。本研究在純水中孵育懷卵成蟲時，隨著1齡，2齡幼蟲的逐漸死亡，在5 d左右可獲得整齊齡期的感染期幼蟲，存活感染期幼蟲的最終產(chǎn)量最高可達(dá)66條。這與營養(yǎng)成分對噬母現(xiàn)象的影響至關(guān)重要相關(guān)，噬母現(xiàn)象形成的過程并不受營養(yǎng)缺乏的影響，但營養(yǎng)缺乏可促使噬母現(xiàn)象提前發(fā)生(Johnigk and Ehlers，1999)。

從純水中孵育懷卵成蟲所獲得的感染期幼蟲，保持了對大蠟螟幼蟲的感染力，并且能在大蠟螟體內(nèi)繁殖，說明以這種方法誘導(dǎo)獲得的感染期幼蟲保持了對寄主昆蟲的毒力，因為從母體中孵育出的感染期幼蟲既儲存了足夠多的能量，又?jǐn)y帶有共生細(xì)菌(Johnigk and Ehlers，1999)，與從活體或離體培養(yǎng)獲得的感染期幼蟲的感染力一致。

本研究通過使用不同的孵育液孵育S.carpocapsae線蟲的懷卵成蟲，篩選到一種簡便快速從懷卵成蟲母體誘導(dǎo)獲得整齊齡期且保持感染力的感染期幼蟲的方法，為該線蟲卵或性腺的RNA干擾后感染期幼蟲的收集及生物測定提供基礎(chǔ)，為昆蟲病原線蟲的轉(zhuǎn)基因改造以提高其環(huán)境耐受力提供技術(shù)支持。

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A simple method for induction of infective juveniles from gravid female adults ofSteinernemacarpocapsae

YAN Xun, HAN Ri-Chou*

(Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization，Guangdong Institute of Applied Biological Resources，Guangzhou 510260，China)

Entomopathogenic nematodes (EPN) are obligate parasites of many insect pests and have been used as biological pest control agents. The infective juveniles are the only stage that is used for commercial production and application. The study on the gene functions and transgenic modification of EPN may help to promote the industrialization of EPN. The gravid female adults ofSteinernemacarpocapsaewere incubated in different incubation buffers in this study and a method for simple and fast induction of accordant stage of infective juveniles was founded. This method is the basis for collection of infective juveniles for bioassay after RNA interference in eggs or gonad. The method also provides technical support for transgenic EPN modification to improve environmental resistance.

Steinernemacarpocapsae; infective juveniles; endotokia matricida;invitroinduction; biological control

廣東省省級科技計劃項目(2016A020210076，2014A020208075)；廣東省科學(xué)院科研平臺環(huán)境與能力建設(shè)專項資金項目(2016GDASPT-0305)；廣東省科學(xué)院人才基金(rcjj201201);國家自然科學(xué)基金(31101494)

顏珣，女，1980年生，廣東汕頭人，博士，副研究員，研究方向為生物農(nóng)藥-昆蟲病原線蟲及其應(yīng)用，E-mail：yanxun@gdabr.gd.cn

*通訊作者Author for correspondence，E-mail：hanrc@gdabr.gd.cn

Received：2016-06-12；接受日期Accepted：2016-07-01

Q968.1;S476

A

1674-0858(2016)06-1288-05