增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白在糖尿病大鼠膀胱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用

池俊杰,王東文,原小斌,王 東

(山西醫(yī)科大學(xué)：1.第一臨床醫(yī)學(xué)院;2.第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001)

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·基礎(chǔ)研究·

增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白在糖尿病大鼠膀胱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用

池俊杰1,王東文2,原小斌1,王 東1

(山西醫(yī)科大學(xué)：1.第一臨床醫(yī)學(xué)院;2.第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001)

目的 觀察增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)在糖尿病大鼠DSM細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的表達(dá)變化，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與糖尿病膀胱的關(guān)系。 方法 通過(guò)注射鏈脲菌素誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠模型，于不同的時(shí)點(diǎn)(造模成功后4、 8、12、16周)，電鏡下觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)，應(yīng)用TUNEL技術(shù)檢測(cè)糖尿病大鼠膀胱逼尿肌細(xì)胞的凋亡水平，RT-PCR技術(shù)和Western-blotting技術(shù)分別測(cè)定DSM細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性因子CHOP mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 電鏡下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、融合，逼尿肌細(xì)胞核變形；逼尿肌細(xì)胞凋亡水平、CHOP mRNA和蛋白水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)明顯升高。結(jié)論 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了糖尿病大鼠DSM細(xì)胞凋亡過(guò)程，CHOP與糖尿病膀胱病程進(jìn)展呈正相關(guān)。

糖尿病膀胱；逼尿??；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；CHOP

糖尿病是目前全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的一種慢性代謝性疾病[1]，其可以影響多個(gè)器官功能。糖尿病膀胱(diabetes cystopathy, DCP)作為糖尿病在泌尿系統(tǒng)主要的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，研究顯示，DCP在糖尿病患者中的合并率高達(dá)80%以上[2]。DCP主要特點(diǎn)為伴隨糖尿病病程出現(xiàn)的膀胱感覺(jué)及收縮功能的進(jìn)行性下降。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是真核細(xì)胞中合成和折疊分泌蛋白所必需的細(xì)胞器,參與細(xì)胞的生理及病理過(guò)程，對(duì)細(xì)胞正常生理功能的發(fā)揮起著重要作用[3-4]。當(dāng)細(xì)胞受到如鈣失衡、病毒感染、pH變化等不利環(huán)境的影響，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)腔中堆積大量未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白，致使其平衡紊亂，干擾蛋白質(zhì)折疊過(guò)程，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[5]。在ERS發(fā)生時(shí)，通過(guò)質(zhì)量控制系統(tǒng)，上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶和相關(guān)的蛋白質(zhì)基因表達(dá)和降解折疊蛋白起作用的機(jī)制稱為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。在ERS早期階段，UPR修復(fù)受損細(xì)胞，但長(zhǎng)期持續(xù)的ERS超過(guò)UPR的調(diào)節(jié)能力時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重受損，ERS啟動(dòng)凋亡信號(hào)[6-7]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋(CCAAT / enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)(GADD153)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡信號(hào)下游通路中的一個(gè)關(guān)鍵因子。

ERS及其誘導(dǎo)的凋亡已在多種糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮了重要作用[8-9]，但其是否參與了糖尿病膀胱的發(fā)病過(guò)程，及其在DCP發(fā)病過(guò)程中起什么作用，仍不清楚。由于DCP發(fā)生發(fā)展過(guò)程伴隨著逼尿肌細(xì)胞凋亡水平顯著升高[10]，我們推測(cè)ERS在DCP病變過(guò)程中可能也發(fā)揮了一定作用，本研究主要觀察ERS凋亡通路中特異性因子CHOP的表達(dá)變化以探討他們之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，無(wú)特定病原體級(jí)，體質(zhì)量220～250 g。

1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司上海分公司。TUNEL相關(guān)試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。

1.3 分組與模型制備 經(jīng)過(guò)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將45只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組9只，1組作為正常對(duì)照組，其余4組作為實(shí)驗(yàn)組，分別設(shè)為4周組、8周組、12周組和16周組。

實(shí)驗(yàn)組以50 mg/kg的劑量腹腔注射STZ,對(duì)照組以同等劑量生理鹽水行腹腔注射。注射后72 h尾靜脈采血測(cè)定血糖濃度，以血糖濃度>300 mg/dL(即16.7 mmol/L)為符合1型糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)觀察 對(duì)照組、4、8、12、16周組大鼠成模后，分別于3 d、4、8、12、16周行腹腔麻醉后，切除膀胱組織，去除黏膜，將其分成4份，1份樣本放在2.5%戊二醛溶液中硬化，1%鋨酸固定，經(jīng)梯度乙醇脫水，將樣本切割成400～600 nm的薄片，1%醋酸雙氧鈾染色后透色電子顯微鏡觀察(×20 000)，其余3份，液氮冰凍后-80 ℃保存。

1.5 檢測(cè)DSM細(xì)胞凋亡水平 將樣本用4%中性甲醛固定，石蠟包埋切片。切片脫蠟，放置于20 mg/mL蛋白酶K緩沖液中。加入末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(TDT酶)緩沖液(含生物素、TDT酶及緩沖液)，終止反應(yīng)，Tris-HCl緩沖液(TBS)液清洗，置于聯(lián)苯二胺(DAB)底物溶液，蘇木素染色，在400倍焦距下隨機(jī)觀察3個(gè)不同視野，計(jì)算DSM細(xì)胞凋亡率[11]。

1.6 RT-PCR檢測(cè)CHOP mRNA表達(dá)水平 用 Trizol試劑提取總RNA。CHOP引物為F5′CGGAACCTGAGGAGAGAGTG3′，R5′CGTTTCCTGGGGATGAGATA3′，擴(kuò)增條帶219 bp，β-actin引物F5′GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT3′，R5′AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT3′，擴(kuò)增條帶147 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃，10 min；94 ℃,15 s，60 ℃,60 s，共45個(gè)循環(huán)。逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增反應(yīng)完成后讀取數(shù)據(jù)，取相對(duì)定量值統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.7 Western-blotting檢測(cè)CHOP蛋白表達(dá)水平 樣本中加入RIPA提取總蛋白，在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中以200 mA電流轉(zhuǎn)膜2 h，溶液封閉后，加(1∶2 000稀釋的CHOP) 一抗過(guò)夜，TBST洗滌后加二抗孵育，再次洗滌后通過(guò)ECL顯影檢測(cè)，以β-actin作為內(nèi)參，吸光度通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)處理量化，灰度比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠DSM內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)變化 對(duì)照組：大鼠DSM細(xì)胞呈類圓柱形，包膜完整，肌漿網(wǎng)呈小管狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈層疊管狀樣結(jié)構(gòu)，整齊排列，漿膜極少見(jiàn)或無(wú)核糖小體附著。實(shí)驗(yàn)組:逼尿肌細(xì)胞和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分散在逼尿肌細(xì)胞核周圍，可見(jiàn)不同程度腫脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，層疊管狀樣結(jié)構(gòu)改變甚至消失，呈空泡樣結(jié)構(gòu)，漿膜附著核糖體逐漸增多。4周組見(jiàn)輕度腫脹內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，漿膜上附著少量核糖小體。8周組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹程度明顯。12周組逼尿肌細(xì)胞核出現(xiàn)扭曲、固縮，其內(nèi)可見(jiàn)深染色顆粒，腫脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯融合，呈不規(guī)則囊泡，有脫顆粒表現(xiàn)。16周組逼尿肌細(xì)胞核扭曲甚至塌陷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈不規(guī)則巨型空泡樣結(jié)構(gòu)(圖1)。

2.2 DSM細(xì)胞凋亡形態(tài)及凋亡水平 對(duì)照組:凋亡DSM細(xì)胞少見(jiàn)，均勻分布，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞核染色淺，呈淡藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)4周組逼尿肌凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞核染色加深。8周組逼尿肌凋亡細(xì)胞大小不一，排列明顯紊亂，細(xì)胞間可見(jiàn)明顯纖維結(jié)締組織增生，12周組可見(jiàn)固縮細(xì)胞核，呈褐色。16周組固縮核數(shù)量明顯增多，顏色進(jìn)一步加深，呈黑褐色(圖2)。

圖1 電鏡下各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)

各圖依次為對(duì)照組、4周組、8周組、12周組、16周組；Control組：對(duì)照組；W:周。

在逼尿肌細(xì)胞凋亡率的比較中，4周組(17.9±2.0)%表達(dá)高于對(duì)照組(5.8±0.5)%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；8周組(27.5±3.9)%明顯高于對(duì)照組及4周組，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；12周組(55.2±6.6)%表達(dá)高于對(duì)照組、4周組及8周組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；16周組(67.4±6.0)%表達(dá)水平最高(P<0.05)。

圖2 各組細(xì)胞凋亡情況

A、B、C、D、E：分別為對(duì)照組、4周、8周、12周、16周組凋亡細(xì)胞表達(dá);F：各組DSM細(xì)胞凋亡率的變化(與對(duì)照組比較,P<0.05)；Control組：對(duì)照組；W:周。

2.3 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 大鼠DSM細(xì)胞CHOP mRNA表達(dá)水平4周組(1.83±0.33)較對(duì)照組(1.03±0.27)增加(P<0.01)；8周組(4.10±0.94)表達(dá)明顯高于對(duì)照組及4周組，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；12周組mRNA表達(dá)(5.04±0.58)高于對(duì)照組、4周組及8周組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；16周組(5.61±0.76)表達(dá)水平最高(P<0.05，圖3)。

圖3 RT-PCR檢測(cè)CHOP mRNA的表達(dá)水平

2.4 Western-blotting蛋白印跡實(shí)驗(yàn) Western-blotting蛋白印跡圖顯示各組蛋白條帶隨時(shí)間的遞增而增粗(圖4)。相對(duì)灰度值顯示，大鼠DSM細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)水平4周組(0.73±0.06)明顯高于對(duì)照組(0.32±0.04)，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；8周組(0.97±0.04)表達(dá)高于對(duì)照組及4周組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；12周組(1.06±0.06)mRNA表達(dá)高于對(duì)照組、4周組及8周組，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；16周組(1.12±0.08)表達(dá)水平最高(P<0.05)(圖5)。

圖4 Western-blotting蛋白印跡圖

圖5 Western-blotting檢測(cè)CHOP蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

隨著糖尿病病程進(jìn)展，DSM細(xì)胞受損不斷加重，膀胱功能由代償期發(fā)展到失代償期。在發(fā)病早期，膀胱功能障礙主要表現(xiàn)為逼尿肌過(guò)度活動(dòng)導(dǎo)致的儲(chǔ)尿期癥狀；發(fā)病晚期，毒性代謝產(chǎn)物不斷堆積，主要表現(xiàn)為膀胱活動(dòng)度減低癥狀[2，12-13]。

當(dāng)細(xì)胞受到鈣離子平衡紊亂、毒性產(chǎn)物堆積等因素影響時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)感受刺激發(fā)生ERS，UPR調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而恢復(fù)或增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊和處理蛋白質(zhì)的能。UPR主要有三個(gè)經(jīng)典特異性反應(yīng)，其包括三個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器，PRKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)激酶(PKR-like ER kinase,PERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6),肌醇需酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1)[14]。正常情況下，他們處于無(wú)活性狀態(tài)，發(fā)生ERS時(shí)，與免疫球蛋白結(jié)合蛋白分離后活化。

CHOP,屬于CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白、C/EBP 轉(zhuǎn)錄因子家族，其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和表達(dá),以及細(xì)胞特異性基因的能量代謝[15-16]。CHOP是分子量29 ku的蛋白。CHOP有兩個(gè)功能域,一個(gè)N末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和C-末端亮氨酸鏈(bZIP蛋白)結(jié)構(gòu)域[17]。CHOP基因啟動(dòng)子中含有結(jié)合UPR中XBP1、ATF6、ATF4等蛋白的位點(diǎn)。當(dāng)ERS誘導(dǎo)凋亡時(shí)，IRE1信號(hào)通路、ATF6信號(hào)通路及PERK信號(hào)通路可以誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CHOP的轉(zhuǎn)錄生成。ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡三條通路中，PERK信號(hào)通路起主要作用[18-19]。CHOP可以下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2[20]，減弱其調(diào)節(jié)鈣離子能力，同時(shí)使BAX結(jié)合減少，游離的促凋亡蛋白BAX增多，激活caspase，誘導(dǎo)線粒體凋亡。CHOP也可以上調(diào)相關(guān)促凋亡蛋白[21-22]，改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜通透性，激活caspase家族。TRB3是一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的偽激酶，影響細(xì)胞生存和代謝，干擾細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。轉(zhuǎn)染CHOP基因的足細(xì)胞中TRB3表達(dá)增加[23]。在腦部腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，TRB3可以抑制Akt而激活自噬，也可以激活caspase，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。GADD34可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)敏感性，敲除GADD34基因減輕了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能負(fù)荷，同時(shí)降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平[25-27]。

對(duì)照組CHOP蛋白表達(dá)量低，提示通常情況下，CHOP的表達(dá)低；實(shí)驗(yàn)組由4周至16周，細(xì)胞凋亡率明顯升高，提示隨著DCP發(fā)生發(fā)展，DSM細(xì)胞凋亡數(shù)量逐漸增多；CHOP mRNA及蛋白表達(dá)均持續(xù)增加,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹程度明顯增加，提示隨著DCP發(fā)生發(fā)展，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡不斷增強(qiáng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了糖尿病大鼠DSM細(xì)胞凋亡過(guò)程，CHOP與糖尿病膀胱病程進(jìn)展呈正相關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的胰島素抵抗與膀胱過(guò)度活動(dòng)的表現(xiàn)相關(guān)，胰島素可以激活UPR減輕OAB癥狀[28]。研究顯示，CHOP除誘導(dǎo)凋亡外，可以加重炎癥反應(yīng)[29-30]。據(jù)此我們推測(cè)，發(fā)病早期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中UPR起主導(dǎo)作用，恢復(fù)或增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊和處理蛋白質(zhì)的能力，減輕膀胱逼尿肌功能損害，緩解逼尿肌過(guò)度活動(dòng)，延緩DCP病情發(fā)展，與其他因素共同作用使膀胱處于代償期。發(fā)病晚期，ERS主要誘導(dǎo)凋亡，大量逼尿肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)CHOP的大量表達(dá)加重炎癥反應(yīng)，長(zhǎng)期的炎癥刺激，逼尿肌細(xì)胞損傷加重，膀胱功能進(jìn)一步惡化，和線粒體應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡等因素共同作用使膀胱處于失代償期，表現(xiàn)為膀胱活動(dòng)度減低癥狀。

本研究沒(méi)有針對(duì)每個(gè)時(shí)間序列的實(shí)驗(yàn)組設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組，結(jié)果可能產(chǎn)生偏差，需要更精準(zhǔn)的研究。ERS在DCP發(fā)生發(fā)展中如何發(fā)生作用以及CHOP通過(guò)哪些途徑影響逼尿肌細(xì)胞功能尚不清楚，今后我們將圍繞時(shí)間序列做進(jìn)一步的研究。

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(編輯 王 瑋)

The role of CHOP in the endoplasmic reticulum stress of diabetic rats’ bladder

CHI Jun-jie1, WANG Dong-wen2, YUAN Xiao-bin1, WANG Dong1

(1.the First College of Clinical Medicine, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; 2.Department of Urology,the First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

Objective To evaluate the effect of CHOP on the endoplasmic reticulum stress of diabetic rats’ detrusor muscle and investigate the relationship between the endoplasmic reticulum stress and development of diabetic cystopathy(DCP). Methods Rat models of type 1 diabetes mellitus were induced by injecting streptozocin. At different time points(4, 8, 12, 16 weeks after rat models were established), the ultrastructure of endoplasmic reticulum(ER) was observed with transmission electron microscopy(TEM), and the apoptosis was identified with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated DNA nick-end labeling(TUNEL) staining. The expression of the hallmarks of ERS-associated apoptosis, and CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein(CHOP), were detected with quantitative real-time polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blotting. Results The ultrastructural changes featuring the swollen and fused cisternaes in ER zone and deformed nucleus were observed in the detrusor smooth muscle(DSM). Increased apoptosis of DSM and elevated expression of CHOP at both mRNA and protein levels in a time-dependent fashion were detected.Conclusion Endoplasmic reticulum stress(ERS) contributes to the apoptosis of the DSM cells of SD rats. CHOP was positively correlated with the development of DCP.

diabetic cystopathy; detrusor; endoplasmic reticulum stress; CHOP

2015-11-26

2016-02-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81370861)

王東文，教授.E-mail:Urology2007@126.com

池俊杰(1988-)，男(漢族)，在讀碩士研究生.研究方向：尿動(dòng)力學(xué).E-mail:chijunjie.999@163.com

R332

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.06.014