小麥麩皮阿拉伯木聚糖體外益生活性研究

劉麗婭 趙夢麗 鐘 葵 佟立濤 周閑容 王麗麗 劉興訓 藺艷君 張梅紅 周素梅

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

小麥麩皮阿拉伯木聚糖體外益生活性研究

劉麗婭 趙夢麗 鐘 葵 佟立濤 周閑容 王麗麗 劉興訓 藺艷君 張梅紅 周素梅

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

通過體外發(fā)酵培養(yǎng)的方法，比較了堿提阿拉伯木聚糖(AX)及其酶法(AXEM1、AXEM2)和酸法(AXC1、AXC2)降解產(chǎn)物的體外益生活性。結(jié)果表明，堿提AX及其酶法和酸法降解產(chǎn)物均能促進雙歧桿菌增殖，與葡萄糖相比，log值增加0.98～1.27個數(shù)量級；酶解樣品AXEM1對乳酸桿菌的增殖效果最好，陽性對照菊粉及其他AX樣品及均不能促進乳酸菌生長。AX及其降解產(chǎn)物益生活性分數(shù)均大于0，表明AX及其降解產(chǎn)物均具有一定的益生活性；其中益生活性值最高的為AXEM2，益生活性分數(shù)達到0.35，高于陽性對照菊粉。采用離子色譜測定發(fā)酵液短鏈脂肪酸組成及含量發(fā)現(xiàn)，AXEM1組發(fā)酵液中總短鏈脂肪酸含量最高，約41.02 μmol/mL。丁酸作為益生元活性的重要指示性指標，僅在酶解樣品AXEM2中檢出，含量為0.05 μmol/mL，與AXEM2樣品益生活性分數(shù)最高的結(jié)果一致。

小麥麩皮 阿拉伯木聚糖 益生活性 短鏈脂肪酸

人類每天都要消耗大量的非淀粉多糖(Non-starch polysaccharides, NSP)，這些碳水化合物中許多都不能被小腸消化，但能夠為寄居在大腸中的某些細菌提供發(fā)酵碳源。阿拉伯木聚糖(Arabinoxylan, AX)是小麥麩皮中一種重要的非淀粉多糖。近年來，AX對腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，AX及其水解產(chǎn)物阿拉伯木寡糖(Arabinoxylan oligosaccharide, AXOS)可以促進動物和人腸道雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌的生長[1]。益生元(prebiotics)的概念最早由Gibson于1995年提出[2]，2008年由國際益生元/益生菌聯(lián)合會(ISAPP)修訂為：一種選擇性的對腸道微生物的組成或活性產(chǎn)生特殊改變并有益于機體的發(fā)酵產(chǎn)物。益生元對機體的有益作用主要表現(xiàn)為：穩(wěn)定腸道微生物的組成，促進腸道功能，降低腸道感染性疾病的發(fā)生；增加礦物質(zhì)吸收和促進骨健康；調(diào)節(jié)免疫功能；降低腸癌、肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生等。

體外發(fā)酵技術(shù)被廣泛用于研究多種基質(zhì)的益生元功能特性，定量公式的應(yīng)用促進了不同基質(zhì)的益生元功能研究。Palframan等[3]首次提出采用PI值(Prebiotic index, PI)來評價。B/E值表示腸道內(nèi)雙歧桿菌和腸桿菌數(shù)量log值的比值[4]。Huebner等[5]提出了另一個益生元功能評價的指標——益生元活性分數(shù)(Prebiotic activity score)。這些評價指標都是基于在體外發(fā)酵過程中主要菌群數(shù)量的變化，將數(shù)值帶入公式，計算最終結(jié)果。數(shù)值越大，益生效果越好。非淀粉多糖經(jīng)腸道微生物代謝的終極產(chǎn)物是短鏈脂肪酸(Short chain fatty acids，SCFA)[6]，如乙酸、丙酸、丁酸等。短鏈脂肪酸能夠為腸道菌及宿主提供營養(yǎng)和能量，且被證實具有多種生理功能。

本實驗室前期已通過堿提法獲得了較高純度的AX樣品，并在此基礎(chǔ)上通過酶法和酸水解的方式獲得具有不同分子質(zhì)量組成和分布特點的AX降解產(chǎn)物。本研究進一步通過體外發(fā)酵的方式研究不同方法制備的AX樣品對腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌生長及代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFA)的影響，并采用益生元活性分數(shù)評價了AX樣品的益生效果，為進一步研究AX的益生活性及機制提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗室自制堿提阿拉伯木聚糖產(chǎn)品AX，酶解阿拉伯木聚糖產(chǎn)品(AXEM1、AXEM2)，檸檬酸酸解阿拉伯木聚糖產(chǎn)品(AXC1、AXC2)，制備方法參照文獻[7]；乳酸、乙酸、丙酸、丁酸均為色譜純：美國Sigma公司；厭氧產(chǎn)氣袋：日本三菱公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-3000型離子色譜儀：美國戴安公司；MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱：日本三菱公司；BSD-150型全溫振蕩培養(yǎng)箱：北京東南儀器實驗室設(shè)備有限公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2F型潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基配制

發(fā)酵培養(yǎng)基配制(g/L)：酵母浸膏2，蛋白胨2， K2HPO40.04，KH2PO40.04，NaCl 0.1，CaCl2·H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.01，NaHCO32，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，膽汁酸鹽0.5，氯化血紅素0.005；吐溫-80 2 mL/L，維生素K110 μL/L[8]。注：氯化血紅素需配制1 mol/L NaOH去溶解，每次滴加3滴,滴加2次，溶解后蒸餾水沖洗轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基。待所有試劑全部溶解，用1 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.0。

1.3.2 體外發(fā)酵培養(yǎng)

以健康成人(年齡為20～28歲)的糞便作為發(fā)酵菌種。試驗對象1個月內(nèi)未服用抗生素，且無腸胃病史。糞樣收集于密閉的糞便儲存盒里，冷凍保存。

新鮮糞樣，懸浮于冰冷0.1 mol/L pH 7.3 PBS緩沖液中(緩沖液提前滅菌)，使糞樣質(zhì)量濃度為50mg/mL(10 g糞便樣品溶于200 mLPBS)，加無菌玻璃珠蝸旋1 min，靜置取上清液。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(未加葡萄糖)，對照組1添加1%葡萄糖，2添加1%菊粉，試驗組1～5分別添加1%(以純品計)的堿提阿拉伯木聚糖AX、酶解阿拉伯木聚糖AXEM1、AXEM2，酸解阿拉伯木聚糖AXC1、AXC2。每個樣品定容250 mL。每組設(shè)兩個重復。加塞并插上針頭，115 ℃滅菌15 min。滅菌后拔出針頭。冷卻后在點燃酒精燈情況下，用無菌注射器加入1%糞懸液至發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻。37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)，分別在0、6、12、18、24 h，取1 mL發(fā)酵液接種到9 mL 0.1 mol/L PBS緩沖液中，連續(xù)梯度稀釋，接種到選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)。測定雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌數(shù)量及各發(fā)酵液pH值。并對24 h取樣測定短鏈脂肪酸組成及含量。

1.3.3 測定腸道菌的選擇性培養(yǎng)條件

測定腸道菌的選擇性培養(yǎng)條件[9]，如表1所示。

表1 定腸道菌的選擇性培養(yǎng)條件

1.3.4 益生活性分數(shù)計算

益生活性分數(shù)計算參照參考文獻[5]。

益生活性分數(shù)=[(log 24 h益生元培養(yǎng)基中益生菌數(shù)-log 0 h益生元培養(yǎng)基中益生菌數(shù))/(log 24 h葡萄糖培養(yǎng)基中益生菌數(shù)-log 0 h葡萄糖培養(yǎng)基中益生菌數(shù))]-[(log 24 h益生元培養(yǎng)基中腸道菌數(shù)-log 0 h益生元培養(yǎng)基中腸道菌數(shù))/(log 24 h葡萄糖培養(yǎng)基中益生菌數(shù)-log 0 h葡萄糖培養(yǎng)基中益生菌數(shù))]

式中：益生菌以乳酸桿菌和雙歧桿菌計，腸道菌以大腸桿菌計。

1.3.5 發(fā)酵液pH測定

取固定時間的發(fā)酵液，冷卻至室溫，用酸度計測定pH值，每個樣品測定3次，以平均值計。

1.3.6 短鏈脂肪酸的測定

采用離子交換色譜測定短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFA)組成。發(fā)酵液適度稀釋，采用0.22 μm濾膜過濾，濾液備用。進樣量20 μL，檢測溫度30 ℃，洗脫液流速為1.0 mL/min。洗脫程序為：采用 0.08 mmol/L KOH等度洗脫24 min，最終洗脫液中KOH濃度0.08 mmol/L。配制乳酸、乙酸、丙酸、丁酸混標繪制標準曲線。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)整理，用SAS9.2軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同阿拉伯木聚糖樣品分子質(zhì)量分析

按照文獻[7]建立的AX堿法提取及降解的相關(guān)方法，選取的5種AX多糖樣品的分子量測定結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)表明，實驗室堿提AX樣品主要組分分子質(zhì)量(Mw)為2.964×105u，該多糖樣品經(jīng)戊聚糖酶降解、再經(jīng)60%的乙醇分級沉淀后得到的產(chǎn)物AXEM1中仍含有較高比例(44.76%)分子質(zhì)量大于105u的組分；而采用80%乙醇分級沉淀得到的AXEM2分子質(zhì)量大幅度降低，主要組分分子質(zhì)量集中在5.227×104u。檸檬酸作為一種弱酸，能明顯降低AX分子質(zhì)量，AXC2樣品(0.15 mol/L檸檬酸、95 ℃下作用2 h )主要組分分子質(zhì)量降低至1 000 u。

表2 阿拉伯木聚糖樣品分子量分布

2.2 發(fā)酵液pH變化情況

發(fā)酵過程中，分別在0、6、12、18、24 h取不同樣品組發(fā)酵液，測定pH值。由表3知，發(fā)酵液初始pH值均有所升高。隨著發(fā)酵時間的延長，pH均呈現(xiàn)下降趨勢。其中，葡萄糖培養(yǎng)基pH下降最快，降至4.63。相對較低的為AXEM2和AXC1發(fā)酵液(最低pH值分別為5.06和5.11)。發(fā)酵液pH的下降，與多糖在代謝過程中被雙歧桿菌等利用產(chǎn)生乙酸等短鏈脂肪酸有關(guān)[9]。也有研究報道，隨菌密度的增加，培養(yǎng)基pH也會不斷下降[10]。

表3 樣品發(fā)酵液pH的變化

2.3 發(fā)酵液主要腸道菌群變化研究

不同實驗組發(fā)酵液中主要腸道菌數(shù)量統(tǒng)計如表4所示。所有阿拉伯木聚糖樣品及菊粉均能促進雙歧桿菌的增殖。與葡萄糖組相比，log值增加0.98～1.27個數(shù)量級。AX、AXEM1、AXEM2分子質(zhì)量依次減小，與AX相比，AXEM1對應(yīng)發(fā)酵液中24 h雙歧桿菌數(shù)量無顯著差異，AXEM2則顯著增大(9.04 log cfu/mL發(fā)酵液)；AX經(jīng)檸檬酸酸解所得樣品AXC1、AXC2分子質(zhì)量有所降低，但AXC1對雙歧桿菌的益生效果比AX差，AXC2則無顯著差異，這可能是由于酸解破壞了某些活性基團。其中AXEM2對雙歧桿菌的增殖效果與菊粉效果相當。Napolitano等[11]將小麥水不溶性阿拉伯木聚糖酶解成為水溶性阿拉伯木聚糖后，模擬人體腸道微生物環(huán)境分別對其進行體外發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與水不溶性阿拉伯木聚糖相比，酶解后的樣品更快地促進了益生菌的生長。這也證實了對堿提阿拉伯木聚糖的適度酶解，可以提高其益生活性。另外，葡萄糖組，乳酸桿菌數(shù)量也有所增加。不同阿拉伯木聚糖樣品中，AXEM1對乳酸桿菌的增殖效果最顯著，其他均低于葡萄糖組。不同分子質(zhì)量AX對乳酸桿菌的增殖，無明顯規(guī)律性。Rycroft 等[12]通過研究幾種商品益生元益生功能，發(fā)現(xiàn)幾乎所有益生元都能有效促進雙歧桿菌的增殖，但對于乳酸桿菌的增殖效果，卻存在不確定性，并非所有益生元均能引起乳酸桿菌的顯著增殖。

2.4 阿拉伯木聚糖益生元功能評價

采用益生活性分數(shù)計算法對菊粉及阿拉伯木聚糖樣品的益生活性進行了評價，結(jié)果如圖1所示，菊粉和阿拉伯木聚糖的益生活性分數(shù)均大于0，說明阿拉伯木聚糖與菊粉一樣，具有益生活性，益生活性值最高的為AXEM2，分數(shù)為0.35，超過菊粉。從益生活性值可以看出，阿拉伯木聚糖的益生活性可與菊粉相媲美。且多糖降解程度越高，益生活性越好。這與已有相關(guān)文獻報道一致[11]。對比酶解樣品與酸解樣品，雖然酸解樣品AXC1和AXC2分子質(zhì)量小于酶解樣品AXEM2，但益生效果不如酶解樣品好。這可能是因為酸解對阿拉伯木聚糖的功能活性基團有一定的破壞作用。

圖1 益生元活性值

表4 不同碳源發(fā)酵液中主要腸道菌數(shù)量統(tǒng)計

菌種時間/h葡萄糖菊粉AXAXEM1AXEM2AXC1AXC2雙歧桿菌127.69±0.04d8.95±0.04ab8.85±0.06bc8.99±0.08a9.00±0.03a8.74±0.04c8.84±0.01bc247.78±0.03d9.05±0.03a8.94±0.02b8.96±0.03b9.04±0.02a8.76±0.02c8.96±0.01b乳酸桿菌127.00±0.01e6.88±0.01f6.54±0.04g7.91±0.02a7.78±0.02b7.28±0.02d7.63±0.01c248.43±0.01b8.42±0.05b8.18±0.01e8.53±0.01a8.26±0.01d8.27±0.01d8.33±0.01c大腸桿菌127.33±0.01e7.49±0.02a7.35±0.01d7.35±0.01d7.43±0.01b7.31±0.01f7.38±0.01c247.57±0.11abc7.71±0.02a7.46±0.01d7.63±0.01ab7.49±0.03bc7.52±0.01bc7.61±0.04abc

注：單位：log cfu/mL發(fā)酵液，同行中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表5 24 h不同碳源樣品發(fā)酵液中SCFA含量統(tǒng)計

注：單位μmol/mL，總SFCA=乳酸+乙酸+丙酸+丁酸，“—”表示未檢出，同行中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05 )。

2.5 發(fā)酵液短鏈脂肪酸測定結(jié)果

短鏈脂肪酸(SCFA)對機體具有重要的生理功能。譚力等[13]認為盲襻綜合征大鼠血漿SCFA水平明顯升高，能較好地反映腸道菌群的增殖程度，從而達到調(diào)節(jié)腸道正常菌群平衡的目的。生物體內(nèi)的SCFA主要包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸。其中丁酸是結(jié)腸細胞的主要能源物質(zhì)，能夠維持結(jié)腸黏膜的完整性，對于抵御癌癥和潰瘍性結(jié)腸炎等疾病等起著至關(guān)重要的作用；而乙酸、丙酸經(jīng)結(jié)腸吸收后成為肝臟用以合成葡萄糖的底物。此外，丙酸、丁酸對調(diào)節(jié)細胞增殖和分化起主要作用。阿拉伯木聚糖作為腸道細菌發(fā)酵底物，主要被雙歧桿菌和乳酸桿菌利用產(chǎn)生SCFA，從而使結(jié)腸pH值降低。腸道的酸性環(huán)境具有較強的抑菌作用，能夠控制病原菌的生長和繁殖，并有效抑制大腸桿菌、沙門氏菌的生長[14]。本試驗測得24 h時，總短鏈脂肪酸含量最高的為AXEM1組。這主要是因為該組乙酸含量較高，分別為(34.37±0.61)、(23.17±0.03)μmol/mL，文獻[15]報道乳酸桿菌發(fā)酵提取物中乙酸含量最高。除AXEM2樣品外，其他樣品均未檢出丁酸。劉小華等[16]研究證實丁酸在毫摩爾濃度下就能發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導分化和凋亡作用。丁酸是益生元活性的重要指示性指標，這與AXEM2樣品益生活性分數(shù)最高相符。菊粉樣品丙酸含量最高，但卻與其他大多數(shù)阿拉伯木聚糖樣品一樣，未檢出丁酸。

近年來，有關(guān)腸道菌群調(diào)節(jié)功能的研究多以低聚糖為主，主要集中在低聚木糖、低聚異麥芽糖等低聚糖的研究。聚合度相對較高的大分子多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的報道則較少。在人體腸道中，低聚糖的發(fā)酵主要位于結(jié)腸近端，通過代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸，從而使pH值下降。阿拉伯木聚糖的溶解度、聚合度、取代度A/X、側(cè)鏈的分布以及阿魏酸發(fā)生交聯(lián)的程度均能對其益生活性產(chǎn)生影響，這是研究其構(gòu)效關(guān)系的主要因素。Grotaert等[17]研究發(fā)現(xiàn)，阿拉伯木聚糖的結(jié)構(gòu)多樣性、高聚合度以及腸道菌群中相關(guān)水解酶的代謝抑制作用使得阿拉伯木聚糖的發(fā)酵部位發(fā)生在結(jié)腸更遠端，成為慢發(fā)酵型潛在益生元。它們在結(jié)腸遠端可作為產(chǎn)生SCFA的碳源，也可以抑制脂類和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生有害物質(zhì)，從而降低了結(jié)腸癌發(fā)生的風險。深入開展阿拉伯木聚糖的腸道菌群調(diào)節(jié)功效研究將為小麥麩皮功能性多糖的有效利用和開發(fā)提供科學依據(jù)。

3 結(jié)論

所有AX樣品均能促進雙歧桿菌的增殖，與葡萄糖組相比，log值增加0.98～1.27個數(shù)量級。不同樣品中，AXEM1對乳酸桿菌的增殖效果最顯著，其他均低于葡萄糖組。菊粉和所有樣品益生活性分數(shù)均大于0，說明阿拉伯木聚糖與菊粉一樣，均具有益生活性，益生活性值最高的為AXEM2，分數(shù)為0.35。并且降解程度越高的，益生活性較好。采用離子色譜測定發(fā)酵液短鏈脂肪酸組成，標準品與發(fā)酵液樣品中SCFA分離效果良好，不存在拖尾現(xiàn)象。試驗結(jié)果，發(fā)酵液中總短鏈脂肪酸最多的為AXEM1培養(yǎng)基。除AXEM2樣品外，其他均未檢出丁酸。丁酸是益生元活性的重要指示性指標，這與AXEM2樣品益生活性分數(shù)最高相符。菊粉樣品雖丙酸含量最高，但卻與其他大多數(shù)阿拉伯木聚糖樣品一樣，未檢出丁酸。

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In Vitro Prebiotic Activity of Arabinoxylan from Wheat Bran

Liu Liya Zhao Mengli Zhong Kui Tong Litao Zhou Xianrong Wang LiliLiu Xingxun LinYanjun Zhang Meihong Zhou Sumei

(Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture; Institute of FoodScience & Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)

Invitrofermentation method was used to evaluate the prebiotic activity of arabinoxylan with alkali extraction (AX) and its degradation products with enzyme (AXEM1, AXEM2) and acid (AXC1, AXC2). The results showed that all arabinoxylan samples could promote the proliferation of bifidobacteria and the log value of bifidobacteria increased from 0.98 to 1.27 magnitude compared with glucose. AXEM1had a better effect on the proliferation of lactobacilli. Inulin, the positive control and other AX samples could not promote the growth of lactobacillus. The prebiotic activity scores of arabinoxylan samples were higher than 0, which indicated that they all had prebiotic activity. And AXEM2sample showed the highest score 0.35, which was higher than the score of inulin. Short-chain fatty acids (SCFA) detected by ion Chromatography showed that the total SCFA contents of AXEM1was the highest, which was about 41.02 μmol/mL. Butyrate, as an important indicative target of prebiotic activity was only detected in AXEM2group with the content of 0.05 μmol/mL, which was consistent with the result that the highest prebiotic activity score was obtained in AXEM2group.

wheat bran, arabinoxylan, prebiotic activity, short-chain fatty acids

TS210.9

A

1003-0174(2016)10-0001-06

國家自然科學基金(31271852)，國家國際科技合作專項(2012DFA31400)

2015-01-20

劉麗婭，女，1982年出生，副研究員，糧油加工與功能食品

周素梅，女，1971年出生，研究員，糧油加工與功能食品