冠脈旁路移植術(shù)患者血小板microRNAs的激活與血小板功能的研究

陳 良，呂 琳，龍 村，樓 松

·臨床研究·

冠脈旁路移植術(shù)患者血小板microRNAs的激活與血小板功能的研究

陳 良，呂 琳，龍 村，樓 松

目的 觀察冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）患者血小板microRNAs和血小板功能的變化，對比體外循環(huán)（CPB）和非體外循環(huán)（off－pump）對凝血功能、血小板microRNAs的影響，并了解其與轉(zhuǎn)機(jī)時間的關(guān)系。方法 2015年8月至2015年9月50例CABG患者入組，分為CPB組和off－pump組，排除標(biāo)準(zhǔn)為：急診手術(shù)、二次手術(shù)、CABG合并其他手術(shù)、肝、腎和血液系統(tǒng)慢性疾??；記錄患者術(shù)前基本資料。選取麻醉誘導(dǎo)后（T1）、魚精蛋白中和5 min后（T2），采用常規(guī)實驗室方法測定血常規(guī)；用快速血栓彈力圖儀行凝血功能檢測；RT－PCR技術(shù)檢測miR－223和miR－126基因的表達(dá)。結(jié)果 50例患者，兩組各25例。T2相比于T1，兩組的血小板計數(shù)、血紅蛋白均明顯下降，但off－pump組下降幅度小，且兩組存在顯著性差異（P＝0．030，P＜0．001）；魚精蛋白中和后，兩組血小板功能均下降，但中位數(shù)都在正常范圍內(nèi)，兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0．073）。與術(shù)前相比，miR－223和miR－126魚精蛋白中和后均明顯增高，且CPB組升高更明顯（P＜0．001）。魚精蛋白中和后血凝塊強(qiáng)度最大振幅與轉(zhuǎn)機(jī)時間呈現(xiàn)直線關(guān)系（r＝0．64，P＝0．008）。結(jié)論 CPB和off－pump魚精蛋白中和后血紅蛋白、血小板計數(shù)和血小板功能均明顯降低，但對血小板功能影響相對較小，血小板功能隨著轉(zhuǎn)機(jī)時間延長而代償性增高，與血小板激活水平變化趨勢并不同步。

冠狀動脈旁路移植術(shù)；體外循環(huán)；microRNAs；血小板功能

冠狀動脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG）包括體外循環(huán)（cardiopulmonary by?pass，CPB）和非體外循環(huán)（off－pump）兩種，其利弊一直存在爭議［1］。后者具有相對創(chuàng)傷小、術(shù)后并發(fā)癥少、住院時間短等優(yōu)點，但其長期血管通暢率和生存率低于前者［2］。其實，兩者很難明確判斷孰優(yōu)孰劣，關(guān)鍵在于嚴(yán)格把握適應(yīng)證［3］。目前研究認(rèn)為，循環(huán)中microRNAs可作為多種疾病早期診斷和預(yù)后評估的生物學(xué)標(biāo)記物，血小板microRNAs是其重要組成部分，血小板激活后，血漿中其microRNAs會不同程度的升高［4］，其中miR－223和miR－126變化較大［5－6］。相對于off－pump，CPB對血液凝血系統(tǒng)影響更大，但對凝血功能具體影響，血小板功能、microRNAs與轉(zhuǎn)機(jī)時間的關(guān)系，目前國內(nèi)研究較少。本試驗通過檢測術(shù)中的血小板功能和血小板miR－223、miR－126水平，比較CPB和off－pump下血小板microRNAs和凝血功能變化，同時了解血小板microRNAs、血小板功能與轉(zhuǎn)機(jī)時間的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 研究對象 選取2015年8月至9月50例CABG患者入組，分為CPB組（n＝25）和off－pump組（n＝25）。術(shù)前常規(guī)停用阿司匹林、硫酸氫氯吡格雷7天，低分子肝素抗凝。排除標(biāo)準(zhǔn)為急診、二次手術(shù)、CABG合并其他手術(shù)、慢性肝腎和血液系統(tǒng)疾病。記錄患者術(shù)前資料，包括性別、年齡、身高、體重、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、有無高血壓病史、糖尿病病史、高脂血癥病史、外周血管病史、腦血管病史；術(shù)前血清肌酐（Cr）、白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、術(shù)前左室射血分?jǐn)?shù)（EF）；術(shù)中冠狀動脈遠(yuǎn)端吻合口數(shù)、血液回收輸入量；CPB參數(shù)：CPB時間、主動脈阻斷時間、最低鼻溫、最低肛溫等。記錄ICU住院時間、呼吸機(jī)使用時間。

1．2 研究方法 患者術(shù)前常規(guī)進(jìn)行左橈動脈和右側(cè)頸內(nèi)靜脈穿刺；常規(guī)麻醉誘導(dǎo)插管，誘導(dǎo)藥物使用依托咪酯、芬太尼、維庫溴銨。誘導(dǎo)后患者經(jīng)口插入氣管插管。術(shù)中采用靜脈持續(xù)麻醉。

CPB采用滾軸泵和非涂層管路，應(yīng)用常規(guī)預(yù)充液（6%羥已基淀粉130／0．4 1 000 ml、乳酸林格液600 ml、肝素4 000 U）。ACT＞480 s進(jìn)行CPB，流量維持著2．2～2．4 L／（min·m2）。升主動脈阻斷后，采用晶體和動脈血氧合（1∶4）灌注冠狀動脈，SvO2維持在60%～75%。鼻咽溫度降至30℃左右，血氣管理采用α穩(wěn)態(tài)，CPB期間MAP維持50～70 mm Hg。直腸溫達(dá)36．0℃后可以停機(jī)。CPB結(jié)束后按照1∶1比例中和肝素（1 mg魚精蛋白：100 U肝素）。術(shù)中常規(guī)應(yīng)用血液回收系統(tǒng)收集術(shù)野失血，經(jīng)離心清洗后回輸。

1．3 觀察項目 麻醉誘導(dǎo)后（T1）、魚精蛋白中和5 min后（T2）兩個時間點采集患者靜脈血測定血常規(guī)?？焖傺◤椓D儀（r－TEG，TEG 5000型，美國Haemoscope公司）測定參數(shù)包括：TEG－ACT值（反應(yīng)時間，正常值86～118 mm）、K值（血凝塊時間，正常值34～138 s）、α角（凝固角，正常值64～80°）和MA（血凝塊強(qiáng)度最大振幅，主要反應(yīng)血小板功能，正常值52～71 mm）。利用ABI 7900熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）實時熒光染料法定量檢測miR－223和miR－126基因的表達(dá)：以線蟲 miR－5652為外參，基因編碼為 GGCCGGTTGAATGT?GAATGAA（5＇－3＇）；按照 miRcute miRNA（TIAN?GEN）試劑盒步驟提取血漿總RNA，逆轉(zhuǎn)錄目的基因，然后進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min后，94℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s；共進(jìn)行40個循環(huán)?；虮磉_(dá)變化倍數(shù)采用2－ΔCt法進(jìn)行比較，ΔCt＝Ct目的基因－Ctath－miR－5652。

1．4 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 22．0軟件，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)正負(fù)標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，組間比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料采用X2檢驗；手術(shù)前后資料兩組比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 一般資料 患者術(shù)前一般臨床資料兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；兩組患者術(shù)中冠脈血管遠(yuǎn)端吻合口數(shù)、呼吸機(jī)使用時間存在明顯差異，見表1。CPB時的轉(zhuǎn)機(jī)時間（94．2±17．5）min、主動脈阻斷時間（66．1±13．8）min、最低鼻咽溫（31．7±1．2）℃、最低肛溫（32．3±1．3）℃。

2．2 血常規(guī)、r－TEG檢測結(jié)果 血常規(guī)：血小板計數(shù)和血紅蛋白濃度術(shù)前CPB組和off－pump組均無差異（P＝0．477，P＝0．089）；相比于T1，T2時間點兩組血小板計數(shù)、血紅蛋白均明顯下降，且都具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．001，P＜0．001），且兩組之間存在明顯差異性（P＝0．030，P＜0．001）。r－TEG：①MA值：在off－pump組，T1和 T2的MA值未見統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．098）；CPB組，T2時MA值比術(shù)前明顯減小（P＜0．001），但中位數(shù)均在正常范圍內(nèi)。兩組未見明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．073）。②TEG－ACT：兩組術(shù)前、術(shù)后（P＝0．285、P＝0．575）組別之間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＝0．563）。③K：在off－pump組，T1和T2的K值未見統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．662）；CPB組，T2時K值比術(shù)前明顯延長（P＝0．002）。但兩組之間未見差異性（P＝0．067）。④α角：在offpump組，T1和 T2的α角未見統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．118）；CPB組，T2時α角比術(shù)前明顯減?。≒＜0．001）。兩組無差異性（P＝0．059）。見表2。

表1 圍手術(shù)期兩組患者一般臨床資料

2．3 MicroRNAs檢測結(jié)果 相對于T1，T2時miR－223和miR－126均明顯增高（P＜0．001，P＜0．001），CPB組升高更明顯（P＜0．001）。見表3。

2．4 MA、MicroRNAs與轉(zhuǎn)機(jī)時間的關(guān)系 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白中和后MA與轉(zhuǎn)機(jī)時間直線關(guān)系（r＝0．64，P＝0．008）。見圖1。采用非參數(shù)回歸的曲線擬合方法，局部多項式估計（Loess）發(fā)現(xiàn)，Mi?croRNAs與轉(zhuǎn)機(jī)時間存在曲線變化，見圖2和圖3。

表2 血常規(guī)及r－TEG指標(biāo)比較（n＝25）

表3 兩組血小板MicroRNAs表達(dá)比較（n＝25，±s）

表3 兩組血小板MicroRNAs表達(dá)比較（n＝25，±s）

注：??為與T1比較，P＜0．01；＃＃為與轉(zhuǎn)機(jī)組比較，P＜0．01。

項目 CPB組off－pump組T1 T2T1 T2 miR－126 0．35（0．19～0．61） 6．18（0．91～30．22）??0．27（0．18～0．54） 1．08（0．41～2．19）??＃＃miR－223 0．23（0．15～0．74） 4．90（2．14～9．20）??0．22（0．13～0．50） 0．61（0．17～1．84）??＃＃

圖1 魚精蛋白中和5 min后MA與轉(zhuǎn)機(jī)時間的關(guān)系

圖2 魚精蛋白中和5min后2－ΔCtmiR－126與轉(zhuǎn)機(jī)時間散點圖及曲線擬合

圖3 魚精蛋白中和5 min后2－ΔCtmiR－223與轉(zhuǎn)機(jī)時間散點圖及曲線擬合

3 討 論

CPB下CABG是傳統(tǒng)心臟外科手術(shù)之一，近年來，off－pump下CABG手術(shù)（off pump coronary artery bypass，OPCAB）由于相對創(chuàng)傷小、痛苦小、恢復(fù)快等優(yōu)點而受到外科醫(yī)生的青睞。臨床醫(yī)生認(rèn)為OP?CAB可明顯減少CPB帶來的多種并發(fā)癥，所以會帶來更大的獲益，但越來越多的meta分析和隨機(jī)對照實驗表明，兩者在死亡率、卒中、心肌梗死、術(shù)后認(rèn)知方面未見明顯差異性［2，7－8］；OPCAB的遠(yuǎn)期血管通暢率和長期存活率低于CPB下手術(shù)患者［2］，所以臨床上誰獲益更大兩者仍存在爭議。

本試驗表明CABG魚精蛋白中和后，兩組血紅蛋白、血小板計數(shù)均有不同程度的下降，且CPB組下降更明顯。CPB結(jié)束后血細(xì)胞計數(shù)的上述變化，與既往研究類似［9］。首先，CPB存在一定的血液稀釋；其次，CPB過程中，血液與大量的外源性異物表面接觸發(fā)生反應(yīng)是導(dǎo)致血液系統(tǒng)發(fā)生變化的主要原因，如泵的機(jī)械轉(zhuǎn)動對泵管的擠壓，心內(nèi)吸引等多種因素產(chǎn)生渦流和剪切力變化，紅細(xì)胞表面張力發(fā)生改變均可導(dǎo)致血細(xì)胞破壞［10］；同時血小板會吸附于管路及膜肺的表面產(chǎn)生聚集反應(yīng)，甚至釋放反應(yīng)［11］。以上因素相互影響會引起血細(xì)胞計數(shù)的變化。

綜合魚精蛋白中和后血常規(guī)和TEG結(jié)果可見，相對于off－pump，CPB下心臟外科手術(shù)對血液系統(tǒng)影響相對較大，原因是多方面的，除了上述提到的血小板計數(shù)減少外，CPB時血液稀釋、低溫、炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體激活等因素均對凝血系統(tǒng)產(chǎn)生不同程度的影響［11］。值得一提的是，停CPB后，兩組血小板功能均有下降，但中位數(shù)均在正常范圍內(nèi)，且兩組之間未見統(tǒng)計學(xué)意義。提示隨著管路材料的發(fā)展，CPB管理的完善［12－13］，外科手術(shù)的成熟和提高，特別是對于轉(zhuǎn)機(jī)時間相對較短的CABG術(shù)，與既往相比，CPB對機(jī)體凝血功能的影響有所減輕，其安全性逐漸提高［14］。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白中和后血小板功能隨著轉(zhuǎn)機(jī)時間的延長有升高的趨勢。原因可能是，在轉(zhuǎn)機(jī)開始時，活化的血小板黏附于暴露的內(nèi)皮下組織及CPB管道系統(tǒng)，與循環(huán)中的單核細(xì)胞或中性粒細(xì)胞結(jié)合，血小板數(shù)量、功能較術(shù)前偏低，隨著時間延長，部分與管壁結(jié)合的血小板脫落進(jìn)入血液循環(huán)，同時CPB引起兒茶酚胺大量釋放，通過與血小板表面的α－腺苷受體結(jié)合可使血小板對其他激活劑的反應(yīng)能力大大增強(qiáng)，血小板功能代償性增高［11］，但均仍低于術(shù)前水平。然而這并不意味著轉(zhuǎn)機(jī)時間越長，血小板功能的代償就越強(qiáng)［15］。

MicroRNAs是一類進(jìn)化上保守的非編碼RNA，它主要通過靶標(biāo)基因3’UTR區(qū)的完全或者不完全互補(bǔ)配對，抑制靶標(biāo)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯或者能夠剪切靶標(biāo)基因mRNA并促進(jìn)其降解，從而參與調(diào)控個體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動。健康人血小板的microRNAs已發(fā)現(xiàn)將近500種［16］，研究認(rèn)為，血小板激活后可釋放大量血小板microR?NAs，含量豐富的包括miR－223、miR－24、miR－126、miR－191，可作為血小板激活的指標(biāo)，反映血小板的活性［6］。本研究結(jié)果表明CABG術(shù)與術(shù)前相比，魚精蛋白中和后血小板miR－223、miR－126均呈現(xiàn)顯著升高，CPB組升高更明顯。進(jìn)一步曲線擬合發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白中和后miR－223、miR－126隨著轉(zhuǎn)機(jī)時間的延長呈現(xiàn)不同變化趨勢，在90 min左右達(dá)高峰。由此可見，血小板的激活與血小板的功能變化并不完全同步。原因可能是，CPB管路與血液接觸后，大量血小板被激活，其細(xì)胞內(nèi)miR－223、miR－126逐漸釋放入血液中，隨著轉(zhuǎn)機(jī)時間延長，血小板激活的數(shù)量持續(xù)增多，microRNAs表達(dá)呈升高趨勢；但隨著時間進(jìn)一步延長，血小板的破壞不斷增加，miR－223、miR－126持續(xù)降解，血液中microRNAs含量逐漸下降；另外，試驗中血小板功能的檢測僅反映流轉(zhuǎn)時血液中的血小板，而無法測量貼壁吸附于管壁上的血小板的功能。

本研究存在一定的局限性：①樣本量有限，且為單中心數(shù)據(jù)，在不同地區(qū)、醫(yī)院，外科手術(shù)對血小板數(shù)量及功能影響不同，同時手術(shù)患者難以做到完全隨機(jī)性分組；②CABG術(shù)轉(zhuǎn)機(jī)時間相對較短，未能完全反映出停機(jī)后血小板功能和轉(zhuǎn)機(jī)時間的關(guān)系。

綜上，近年來隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是對于轉(zhuǎn)機(jī)時間相對較短的CABG術(shù)，CPB對患者的凝血功能的影響較前減??；CPB后幾乎所有患者血小板功能均在正常范圍內(nèi)，與轉(zhuǎn)機(jī)時間（＜140 min）成正比；而血小板miR－223、miR－126水平隨轉(zhuǎn)機(jī)時間呈雙向變化。

4 結(jié) 論

CABG魚精蛋白中和后 Hb、Plt均明顯降低，CPB組下降的更明顯。雖然CPB和off－pump術(shù)后血小板功能也有不同程度下降，但絕多數(shù)患者均在正常范圍內(nèi)。魚精蛋白中和后血小板功能隨著轉(zhuǎn)機(jī)時間延長而代償性增高，而血小板miR－223、miR－126水平在轉(zhuǎn)流90 min左右達(dá)高峰，兩者變化趨勢并不完全同步。該結(jié)果仍需更多觀察和研究去證實。

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Study of plateletm icroRNA activation and p latelet function in adult patients un?dergoing coronary artery bypass grafting

Chen Liang，Lyu Lin，Long Cun，Lou Song
Department of Extracorporeal Circulation，F(xiàn)uwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Chinese Academy ofMedical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100037，China

Objective To evaluatethe change of plateletmicroRNA levels and the platelet functionin patients after off－pump versus on－pump coronary artery bypass graft（CABG）surgery and to observe the relationship between the function of platelet and car?diopulmonary bypass（CPB）time．M ethods Consecutive adult patientswere assigned to on－pump or off－pump CABG surgery from August2015 to September 2015．Exclusion criteria included emergency operation，re－operation，compound operation and the chronic disease of liver，renal and blood system．Preoperative demographic data was recorded．The function of platelet（MA）and coagulation were tested by thrombelastogram（TEG）at two intervals，namely after anesthesia induction（T1）and 5mins after protamine neutraliza?tion（T2）．The expression levels ofmiR－223 and miR－126 were detected by real－time PCR．Results Fifty patientswere entered into this study（25 patients off－pump and 25 on－pump CABG surgery）．Compare with T1，the hemoglobin（Hb），platelet count（PLT）and MA levels in both groups significantly decreased after heparin reversal．The platelet function ofmost patientswere at normal range．There was significant difference between the two groups in the reduction of the Hb and PLT exceptMA．The level of bothmicroRNAs in two groups significantlyincreased at T2（P＜0．001）．There was a liner correlation between MA and CPB（r＝0．64，P＝0．008）．Con?clusion The levels of HB，PLT and MA in two groups significantly decreased after heparin reversal．The effect of on－pump CABG surgery on platelet function was similar to that of the off－pump surgery．The function of platelet after protamine administeration in?creased with CPB time，the pattern ofwhich was different from the trend of plateletmicroRNAs activation．

Coronary artery bypass grafting；Cardiopulmonary bypass；MicroRNAs；Platelet function

2016?01?06）

2016?04?18）

10．13498／j．cnki．chin．j．ecc．年．期．流水號

100037北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國家心血管病中心，阜外心血管病醫(yī)院體外循環(huán)科［陳良（研究生）］

樓松，lousongfw＠163．com