D-核糖誘導人肌紅蛋白快速非酶糖基化

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(1.南華大學醫(yī)學院，湖南 衡陽 421001；2.南華大學蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能實驗室；3.南華大學化學化工學院)

·基礎(chǔ)醫(yī)學·

D-核糖誘導人肌紅蛋白快速非酶糖基化

游詠1,2,劉芳1,2,高淑琴1,2，林英武2,3,文格波1,2*

(1.南華大學醫(yī)學院，湖南 衡陽 421001；2.南華大學蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能實驗室；3.南華大學化學化工學院)

目的探討D-核糖與D-葡萄糖對人肌紅蛋白(HMb)分子構(gòu)象的影響，并研究反應后晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的形成情況，以期為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的研究線索。方法表達、純化獲得HMb，在體外分別與D-核糖及D-葡萄糖共孵育，采用紫外可見光譜(UV-vis)監(jiān)測反應后HMb的結(jié)構(gòu)變化，利用熒光光譜法監(jiān)測反應后AGEs的生成情況。通過SDS-PAGE觀察HMb與D-核糖及D-葡萄糖反應后分子量的變化情況。結(jié)果UV-vis顯示D-核糖可在短時間內(nèi)導致HMb血紅素活性中心構(gòu)象發(fā)生改變，且呈時間依賴性；同時隨著核糖糖化時間的延長，具自發(fā)熒光的AGEs生成也逐漸增多。SDS-PAGE結(jié)果顯示D-核糖能很快地與HMb發(fā)生反應，形成高分子量多聚體。而在相同的反應條件下，D-葡萄糖對HMb構(gòu)象的影響及AGEs的形成顯著較D-核糖為弱。

核糖； 葡萄糖； 肌紅蛋白； 非酶糖基化

據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(International Diabetes Federation，IDF)統(tǒng)計，糖尿病患者數(shù)量正在全球迅速增加，2013年全球糖尿病患者數(shù)量達3.82億人，預計到2035年，這一數(shù)字將達到5.92億[1]。臨床研究表明，糖尿病的并發(fā)癥是其致死致殘的主要原因[2-3]。糖尿病患者體內(nèi)血糖長期高水平促使蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(Non-enzymatic glycation)速度明顯增快，可誘導各種并發(fā)癥的發(fā)生[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠的尿核糖以及血液中的核糖含量均顯著升高[6]，且核糖能快速地誘導蛋白質(zhì)如α-突觸核蛋白(α-Synuclein)等非酶糖基化的發(fā)生[7]。因此，進一步研究核糖糖基化可能為糖尿病的診治提供新的線索。肌紅蛋白(myoglobin，Mb)由一條多肽鏈(153 個氨基酸殘基)和一個血紅素( heme) 輔基組成。Mb與血紅蛋白(hemoglobin，Hb)均為以血紅素為輔基的蛋白，其主鏈與Hb的α鏈和β鏈的折疊形成的三維結(jié)構(gòu)非常相似，而關(guān)于Hb發(fā)生非酶糖基化后形成的糖化血紅蛋白(Hemoglobin A1C，HbA1C)的研究，目前已比較深入[8-9]。Mb主要存在于諸如骨骼肌，心肌及平滑肌等肌肉細胞中，但當這些細胞受損后Mb可迅速進入血液循環(huán)，與血液中的糖類發(fā)生非酶糖基化反應，使其結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，加重糖尿病的并發(fā)癥。之前本文作者的研究也證實葡萄糖可以通過氫鍵與Mb相互作用，從而影響其過氧化物酶活性[10]。而關(guān)于核糖對Mb的影響目前鮮有報道。本研究旨在通過體外實驗，研究D-核糖或D-葡萄糖與Mb共孵育后，對Mb構(gòu)象的影響，以及是否形成晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)，從而為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的研究途徑。

1 材料與方法

1.1材料人肌紅蛋白(human myoglobin，HMb)的cDNA由日本奈良先端科學技術(shù)大學院大學(Nara Institute of Science and Technology，NAIST ) Shun Hirota教授饋贈。D-核糖(Sigma)，D-葡萄糖(Sigma)及其他的所有化學試劑都為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器F-7000FL型熒光分光光度計(日本HITACHI公司)，U Agilent 8453紫外可見分光光度計(美國安捷倫科技公司)，HERA THERM incubator 恒溫培養(yǎng)箱(Thermo 公司)。

1.3方法

1.3.1 HMb的表達與純化 按文獻所述的方法[11]，以大腸桿菌BL21(DE3)菌株作為pET29B質(zhì)粒的表達宿主，采用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)后轉(zhuǎn)化，通過測序確定正確后，進行擴大培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6，加入IPTG 誘導4 h，離心并收集沉淀，超聲破菌1 h后再次離心收集上清液超濾，加入DEAE陰離子交換柱，收集蛋白溶液加入少量鐵氰化鉀再次超濾后加入凝膠層析柱，使用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液進行層析；最后，通過UV-vis 光譜，收集ASoret/A280 >4.0 的蛋白溶液進行濃縮，濃縮至1 mL 左右，保存于-20 ℃冰箱備用。離心、層析及超濾均在4 ℃進行。

1.3.2 HMb的體外糖化 在終濃度為100 μmol/L 的HMb溶液中，分別加入終濃度為0.5 mol/L的D-核糖及D-葡萄糖，過0.22 μmol/L微孔濾膜濾器過濾除菌，置于在37 ℃恒溫共孵育7天，在相同條件下，以不加糖的HMb溶液作為對照。工作溶液為20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)。

1.3.3 HMb非酶糖基化的紫外可見光譜(UV-Vis)變化

采用紫外可見分光光度計檢測HMb非酶糖基化后的光譜變化，通過監(jiān)測位于409 nm處Mb的特征性Soret吸收峰與280 nm吸收峰的比值，可以了解非酶糖基化對蛋白血紅素活性中心構(gòu)象的影響。分別于HMb與還原糖孵育的第0，1，3，5，7天取樣，用20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)稀釋50倍，測定UV-Vis。

1.3.4 HMb非酶糖基化的熒光光譜變化 蛋白質(zhì)如果發(fā)生非酶糖基化，生成的AGEs會產(chǎn)生自發(fā)性熒光，通過測定熒光產(chǎn)物的變化情況，可了解AGEs的生成情況。分別于HMb與還原糖孵育的第0，1，3，5，7天取樣，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)稀釋10倍。測定蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光(λex=325 nm；λem=410 nm)，同時選擇激發(fā)光波長為λex= 325 nm ，進行發(fā)射光譜掃描300～500 nm。掃描速度為1 200 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫分別為5 nm，10 nm，PMT voltage：500 V，溫度25 ℃，每個數(shù)據(jù)為3次測量的平均值。

1.3.5 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 由于蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化后會增加被修飾蛋白的分子量，通過SDS-PAGE可以觀察到蛋白因分子量變化而產(chǎn)生的滯后現(xiàn)象。利用這一特性，對HMb的體外糖化修飾進行鑒定。分別于孵育第0～7天的各組樣品20 μL 按4∶1 比例與5×還原型上樣緩沖液混合,95 ℃ 5 min變性后上樣，取10 μL混懸液進行SDS-PAGE電泳。電泳后凝膠用考馬斯亮藍染色，甲醇—冰醋酸脫色后觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 HMb的表達與純化血紅素蛋白，如Mb、Hb、細胞色素c(Cytochrome c)等，具有非常特征的紫外-可見光譜(UV-Vis)，在409 nm左右有特征吸收，稱為Soret峰，而在500～600 nm可見區(qū)域也存在特征性吸收峰ɑ、β峰。Soret峰和ɑ、β峰能反映出血紅素中心鐵的氧化還原態(tài)及配位狀態(tài)，其變化可作為判斷血紅素活性中心構(gòu)象改變的重要依據(jù)。而在280 nm 吸收強度與峰型可以反映出蛋白質(zhì)分子中芳香性氨基酸Trp、Tyr和Phe殘基的數(shù)量及所處的微環(huán)境。本實驗獲得的HMb也具有血紅素蛋白特征性的紫外-可見光譜(UV-Vis)：除280 nm吸收外，可見Soret吸收峰以及ɑ、β峰(圖1)，說明蛋白質(zhì)分子折疊完好，能行使正常的蛋白質(zhì)功能。

圖1 人肌紅蛋白(human myoglobin，HMb)的紫外—可見光譜圖

2.2 D-核糖及D-葡萄糖與HMb反應后UV-Vis變化血紅素蛋白Soret峰的變化可反應出其結(jié)構(gòu)的改變。將HMb分別與0.5 mol/L的D-核糖及D-葡萄糖，共孵育7天，通過UV-Vis光譜檢測發(fā)現(xiàn)：HMb與D-核糖共孵育后隨著核糖化時間的延長，Soret峰顯著降低，而280 nm吸收峰逐漸增高，說明HMb核糖糖基化后，會導致血紅素輔基從蛋白肽鏈中逐漸解離，導致蛋白分子內(nèi)的芳香性氨基酸殘基逐漸暴露(圖2a)。與D-葡萄糖共孵育組對照，后者也有相似的改變，但至共孵育后第7天Soret峰稍有下降，此反應遠不及D-核糖組明顯(圖2b)。因此，通過UV-Vis的監(jiān)測提示，HMb與D-核糖共孵育后，HMb的分子構(gòu)象已經(jīng)發(fā)生了明顯的變化。

2.3 D-核糖及D-葡萄糖與HMb反應后熒光光譜的變化蛋白質(zhì)在發(fā)生非酶糖基化后，若形成AGEs則可產(chǎn)生新的熒光衍生物，在320 nm左右的激發(fā)光下，產(chǎn)生410 nm發(fā)射波長的特定熒光[12]。為了判斷HMb體外能否發(fā)生非酶糖基化形成AGEs，本實驗將D-核糖及D-葡萄糖分別與HMb溶液共孵育7天后，取反應后1、3、5、7天的混合溶液，在325 nm激發(fā)光下，進行300～500 nm區(qū)間熒光掃描。本文作者觀察到D-核糖與HMb共孵育后第1天，在410 nm左右就出現(xiàn)了一個新的熒光發(fā)射峰，其熒光強度隨著HMb反應的時間延長逐漸增高(圖3a)。而在7天內(nèi)，與D-葡萄糖共孵育組卻未見明顯的變化(圖3b)。因此，實驗證明D-核糖，而不是D-葡萄糖，能更快速地誘導HMb發(fā)生非酶糖基化，產(chǎn)生的AGEs呈時間依賴性增加。

圖2 人肌紅蛋白(human myoglobin，HMb)與D-核糖(a)/D-葡萄糖(b)共孵育后UV-Vis光譜變化 (RMb，D-核糖與肌紅蛋白共孵育組；GMb，D-葡萄糖與肌紅蛋白共孵育組)

2.4糖與HMb反應后SDS-PAGE檢測HMb與其他種屬Mb最大的區(qū)別在于，其存在一個特有的氨基酸，即110位的半胱氨酸(Cysteine，Cys)。單Cys的存在，會使得蛋白質(zhì)分子之間會通過二硫鍵形成二聚體。SDS-PAGE顯示，HMb存在兩個條帶，與預染蛋白分子量標準對比，上一條帶分子量是下一條帶的兩倍，因此提示分別為HMb的單體(Monomer)與二聚體(Dimer)。HMb分別與D-核糖/D-葡萄糖共孵育后0～7天，進行SDS-PAGE電泳。圖4a為HMb與D-核糖共孵育組，結(jié)果顯示：孵育第1天，即可見單體分子量的條帶位置稍有上移，自反應后第2天起，隨著核糖化時間的延長，單體分子量的蛋白條帶逐漸減少，而出現(xiàn)了逐漸增多的拖尾現(xiàn)象，可見較大分子量的區(qū)域條帶漸增。圖4b為HMb與D-葡萄糖共孵育組，也出現(xiàn)了類似于D-核糖組的條帶變化趨勢，但明顯較D-核糖延遲，說明D-葡萄糖相比于D-核糖，影響較小，與UV-vis光譜的結(jié)果一致。

圖3 人肌紅蛋白(human myoglobin，HMb)與D-核糖 (a)/D-葡萄糖(b)共孵育后熒光光譜變化 (RMb，D-核糖與肌紅蛋白共孵育組；GMb，D-葡萄糖與肌紅蛋白共孵育組)

圖4 人肌紅蛋白(human myoglobin，HMb)與D-核糖(a)以及與D-葡萄糖(b)共孵育SDS-PAGE

3 討 論

蛋白質(zhì)的非酶糖基化修飾會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，使得其難以被蛋白酶降解，甚至發(fā)生交聯(lián)，導致一系列的功能障礙，而蛋白質(zhì)糖化后AGEs的生成與聚集不僅加速了糖尿病病程的發(fā)展，也與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展有著密切的關(guān)系?，F(xiàn)研究已經(jīng)證實Hb的非酶糖基化產(chǎn)物HbA1C與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生直接相關(guān)[13-15]。Mb與Hb有著極其相似的三維結(jié)構(gòu)和功能，這也為Mb非酶糖基化研究提供了理論依據(jù)。2004年首次報道，Mb可與葡萄糖發(fā)生非酶糖基化反應[16]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Mb還可與諸如果糖，非糖類中間產(chǎn)物丙酮醛(Methylglyoxal，MG)等發(fā)生非酶糖基化反應，改變Mb的空間構(gòu)象，進而影響Mb的氧釋放、過氧化物酶等多種生物學功能的發(fā)揮[17-21]。Mb作為重要的氧載體以及具有多重生物學效應的蛋白，非酶糖基化后對其影響，還存在很大的研究空間。人Mb與其他物種Mb的最大區(qū)別在于其存在一個特有的氨基酸，即Cys110，后者的存在會導致蛋白質(zhì)形成二聚體，這種特殊的結(jié)構(gòu)是否影響蛋白的非酶糖基化，目前尚無報道，本課題組就這一方面也正在研究之中。

D-核糖作為生物體內(nèi)自然生成的還原性戊醛糖，其分子量小，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且廣泛分布于細胞內(nèi)外。近年來研究發(fā)現(xiàn)D-核糖具有很強的非酶糖基化能力，并已經(jīng)在體內(nèi)和體外的實驗中證實核糖可與多種蛋白質(zhì)，包括牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)、清蛋白(albumin)、β2微球蛋白(β2 microglobulin，β2M)、以及α-突觸核蛋白(α-Synuclein)等發(fā)生快速的非酶糖基化反應，引起蛋白的聚集，形成AGEs，從而造成對細胞及機體的損傷[6,7,22-25]。而且，核糖糖基化速度顯著快于葡萄糖，也更容易造成機體的損傷，因而對核糖糖基化的深入研究具有重要的生物學意義。

本研究通過將HMb分別與D-核糖/D-葡萄糖共孵育，采用紫外可見光譜觀察Mb特征性吸收峰的變化，同時利用熒光光譜檢測非酶糖基化反應產(chǎn)物AGEs的熒光衍生物形成情況。結(jié)果顯示：D-核糖能在短期內(nèi)可導致HMb的血紅素活性中心構(gòu)象發(fā)生變化，并產(chǎn)生AGEs的特征性熒光光譜改變。進一步通過SDS-PAGE電泳也證實D-核糖能很快地與HMb發(fā)生反應，形成多聚體。而在相同的反應條件下，D-葡萄糖對HMb構(gòu)象的影響及AGEs的形成明顯較D-核糖為弱。由此證實，D-核糖，而不是D-葡萄糖，能更快速地誘導HMb發(fā)生非酶糖基化，從而影響其結(jié)構(gòu)，形成AGEs。這為進一步深入研究肌紅蛋白的非酶糖基化，提供了一定的實驗基礎(chǔ)，同時為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供了新的研究途徑。

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D-riboseInducedRapidNon-enzymaticGlycationofHumanMyoglobin

YOU Yong,LIU Fang,GAO Shuqin,et al
(MedicalCollegeofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of D-ribose and D-glucose on molecular conformation of human myoglobin(HMb),determine the formation of advanced glycation end products (AGEs) through in vitro glycation,and provide new clues for the prevention and treatment of diabetes mellitus and its complications.MethodHMb was expressed in BL21(DE3),purified,and incubated with D-ribose or D-glucose.Structural changes of HMb were studied by using UV-Vis spectroscopy.The formation of AGEs was monitored by Fluorescence spectrum.The molecular weight changes of HMb after reaction were observed by SDS-PAGE.ResultsIt showed that the heme active site of HMb was altered by interactions with D-ribose in a time-dependent manner.Simultaneously,the specific fluorescence of AGEs was found to increase markedly with increasing the incubation time of HMb incubated with D-ribose.SDS-PAGE showed that HMb rapidly reacted with D-ribose and formed higher aggregates.However,D-glucose has slight effects on the structural change of HMb and the formation of AGEs under the same conditions.ConclusionIn summary,this study shows that D-ribose,but not D-glucose,rapidly induces ribosylation of human myoglobin and generates AGEs.

D-ribose; D-glucose; Myoglobin; non enzymatic glycation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.005

2016-03-26；

2016-05-31

湖南省教育廳資助科研項目(13C817)，湖南省衛(wèi)生計生委科研計劃課題項目(C2016041).

*通訊作者，E-mail:yoyomo916@163.com.

結(jié)論D-核糖，而不是D-葡萄糖，能更快速地誘導HMb發(fā)生非酶糖基化，形成AGEs。

R587.1

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蔣湘蓮)