源于Paecilomyces sp.FLH30內(nèi)切β－1，3（4）葡聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)

胡 瑋，張慧玲，魏 歡，付婷婷，陳 勇，武 運(yùn)

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院／新疆肉乳用草食動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

源于Paecilomyces sp.FLH30內(nèi)切β－1，3（4）葡聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)

胡 瑋1，2，張慧玲1，魏 歡1，付婷婷1，陳 勇1，武 運(yùn)2

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院／新疆肉乳用草食動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

【目的】β－1，3（4）－葡聚糖酶是一種重要的工業(yè)用酶，廣泛地應(yīng)用于飼料業(yè)、釀造業(yè)及紡織業(yè)?！痉椒ā恳詠碓从?Paecilomyces sp.FLH30的葡聚糖酶基因?yàn)檠芯繉ο蟆?jù)畢赤酵母GS115對密碼子的簡并性和偏愛性，對來源于淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）β－1，3（4）－葡聚糖酶基因進(jìn)行了優(yōu)化，通過全基因技術(shù)合成了全長基因 GLUnm并構(gòu)建重組酵母表達(dá)載體 pPIC9K－GLUnm，用 Sac I線性化重組質(zhì)粒 pPIC9KGLUnm，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)?！窘Y(jié)果】通過表型篩選，遺傳霉素抗性篩選，經(jīng)PCR鑒定表明，葡聚糖酶基因整合至酵母染色體DNA中。在試管中經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，并測定葡聚糖酶酶活性。在試管水平表達(dá)的酶活性是0.68 IU／mL，即可以認(rèn)為在搖瓶表達(dá)水平的初始酶活性為0.68 IU／mL，將此菌株在搖瓶水平表達(dá)，酶活性在表達(dá)84 h為最高，是11.26 IU／mL?！窘Y(jié)論】重組β－1，3（4）－葡聚糖酶的最適pH為 5.0，最適反應(yīng)溫度為50℃，在pH 5.0～8.0，溫度37～50℃的條件下較穩(wěn)定。

β－1，3（4）－葡聚糖酶；畢赤酵母；表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)

0 引 言

【研究意義】β－葡聚糖酶（β－glucanase）是一類非淀粉多糖，是由β－1，3和／或β－1，4糖苷鍵連接的 D型葡聚糖聚合物［1］。β－葡聚糖酶廣泛地應(yīng)用于食品、生物質(zhì)能源、醫(yī)療、紡織等各方面，在釀酒工業(yè)中，β－葡聚糖酶可以提高啤酒的品質(zhì)和產(chǎn)量，尤其在糖化過程中可以降低啤酒中的凝膠沉淀［2］。在食品烘焙工業(yè)中，β－葡聚糖酶可以增大面團(tuán)面積，從而縮短面團(tuán)的醒發(fā)時(shí)間［3］。β－葡聚糖酶也可應(yīng)用于功能性食品［4］的生產(chǎn)加工中?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】β－葡聚糖酶主要來源于植物和微生物中，已知的產(chǎn)葡聚糖酶的微生物有紅發(fā)夫酵母 （Phaffia rhodozyma）、青霉（Penicillium pinophilum）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）等［5］。有學(xué)者已經(jīng)探究出了地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉產(chǎn)β－葡聚糖酶的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)，地衣芽孢桿菌所產(chǎn)出的β－葡聚糖酶的最適溫度是55℃，最適 pH是5.5～7.0，枯草芽孢桿菌所產(chǎn)出的β－葡聚糖酶的最適溫度是55℃，最適pH是4.5～7.0，黑曲霉所產(chǎn)生的β－葡聚糖酶的最適溫度是45～60℃，最適pH是3.6～6.0［6］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】擬青霉在深層發(fā)酵培養(yǎng)過程中可以產(chǎn)生大量的衍生物，其中有一種和吲哚乙酸產(chǎn)物相似，這種產(chǎn)物的顯著的功效是能夠在低濃度時(shí)促進(jìn)植物根系的生長，從而能夠明顯地阻止線蟲對植物根系的侵染，同時(shí)還能夠促進(jìn)植物的營養(yǎng)器官的成長。除此之外，擬青霉菌還能產(chǎn)生大量的葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、細(xì)胞裂解酶和絲蛋白酶，通過獲得的高效菌株，經(jīng)過深層發(fā)酵產(chǎn)生的葡聚糖酶、蛋白酶和淀粉酶的活性會(huì)比普通菌株中產(chǎn)生的相關(guān)酶的衍生物的酶活性高?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究以源于 Paecilomyces sp.FLH30葡聚糖酶基因，根據(jù)畢赤酵母對密碼子的偏好性，在不改變氨基酸殘基順序的前提下對密碼子進(jìn)行優(yōu)化，合成該基因成熟肽編碼區(qū)的全長序列（GLUnm），在畢赤酵母GS115中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)［7］，并對重組葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)及底物特異性進(jìn)行研究，篩選出產(chǎn)β－葡聚糖酶性能穩(wěn)定的菌株，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與試劑

分泌型酵母表達(dá)載體pPIC9K購自自 Invitrogen公司，宿主菌畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115由新疆畜牧科學(xué)院贈(zèng)送，大腸桿菌 Escherichia coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要工具酶及試劑

限制性內(nèi)切酶 Not I、Sac I和 EcoR I等，DL2000，DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA純化試劑盒，質(zhì)粒純化試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；地衣多糖、YNB酵母氮源，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，大麥β－葡聚糖購自上海普麥生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器及設(shè)備

核酸蛋白檢測儀（Gene Quant，GE，德國），掌中型離心機(jī)（5415D，Eppendorf，德國），酶標(biāo)儀（Infinite M200，TECEN，瑞士），酶標(biāo)儀（Infinite M200，TECEN，瑞士），電泳儀（Powerpal Basic，BIO－RAD，美國），梯度PCR儀（My－Cycler，BIO－RAD，美國），半自動(dòng)部分收集器（Frac－920，Amersham，美國），全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR，BIO－RAD，美國）。

1.2 方 法

1.2.1 Paecilomyces sp.FLH30葡聚糖酶基因的優(yōu)化與合成

在GenBank中檢索出Paecilomyces sp.FLH30葡聚糖酶基因GenBank登錄號(hào)：HQ825092）DNA序列，經(jīng)SignalP 4.1軟件在線分析去除信號(hào)肽編碼區(qū)。根據(jù)畢赤酵母GS115對密碼子的偏愛性及密碼子的簡并性、基因的 GC含量及最低自由能等，利用密碼子在線優(yōu)化工具JCat，對該基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，將優(yōu)化后的核苷酸序列送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.2 Paecilomyces sp.FLH30葡聚糖酶基因畢赤酵母工程菌的構(gòu)建與篩選鑒定

將優(yōu)化以后的 Paecilomyces sp.FLH30葡聚糖酶基因GLUn和酵母表達(dá)載體 pPIC9K用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，將得到的酶切產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進(jìn)行回收純化。對純化后的葡聚糖酶基因 GLUnm和表達(dá)載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，經(jīng)過菌落PCR的鑒定和限制性內(nèi)切酶的鑒定無誤后進(jìn)行DNA測序獲得重組質(zhì)粒 pPIC9KGLUnm。將得到的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶 Sac I線性化并且對得到的酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化后的酶切產(chǎn)物通過電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115的感受態(tài)細(xì)胞當(dāng)中，將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻的涂布在配制好的培養(yǎng)基 MD平板上，于電熱恒溫培養(yǎng)箱29℃恒溫培養(yǎng)48 h后，對重組菌落進(jìn)行篩選。挑選出生長正常的菌落進(jìn)行甲醇利用表型的確定。對甲醇利用表型表達(dá)正確的克隆經(jīng)三代轉(zhuǎn)代中間培養(yǎng)后，根據(jù)其對遺傳霉素抗性大小G418梯度篩選出高拷貝的陽性克隆子。

重組酵母菌株在YPD－G418培養(yǎng)基上生長到肉眼可見時(shí)，以5’AOX1和3’AOX1作為引物，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；然后94℃，60 s、65℃，60 s、72℃，60 s運(yùn)行30 cycle；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)體系總體積為20 μL：上游引物和下游引物各 1 μL、Taq酶和DNA各 1 μL，dNTP需2 μL，10×PCR Buffer需2.5 μL，ddH2O需11.5 μL。接著在0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。將有特異擴(kuò)增條帶出現(xiàn)的克隆用YPD培養(yǎng)基在29°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，將得到的單克隆在YPD液體培養(yǎng)基中，29℃，220 r／min過夜培養(yǎng)，使得OD值在2～6，取750 μL菌液和250 μL丙三醇混勻，放入備好的高壓滅菌的1.5mL離心管中，在－70℃冰箱中保存。

1.2.3 重組β－1，3（4）葡聚糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.3.1 重組β－1，3（4）葡聚糖酶在試管水平的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組的酵母菌株劃線接種于 YPD固體培養(yǎng)基，29℃培養(yǎng)48 h；沾取單克隆，接種至含5mL BMGY的試管中，在搖床29℃，220 r／min生長至OD600＝2～6；室溫 12 000 r／min離心 5 min收集細(xì)胞，去除上清，用1／5原培養(yǎng)基體積的 BMMY重懸收集到的細(xì)胞；置于試管中，用滅菌的紗布蓋住試管口，置入搖床當(dāng)中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)；每隔 24 h，加入甲醇，使得甲醇終濃度為0.5%為適宜，繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；分泌表達(dá)時(shí)，將獲得的上清液轉(zhuǎn)移到滅菌過的離心管中，將上清及細(xì)胞沉淀存于－70℃冰箱直至開始檢測。

1.2.3.2 重組β－1，3（4）葡聚糖酶在搖瓶水平的誘導(dǎo)表達(dá)

沾取單克隆接種到裝有25mL BMGY培養(yǎng)基的 250mL搖瓶中，于 29℃、280 r／min培養(yǎng)至OD600＝2～6（約需 16～18 h）；將2.5mL的菌液接種至100mL BMGY的500mL搖瓶中，29℃、280 r／min培養(yǎng)至 OD600＝2～6（對數(shù)生長期）；收集菌體，用 BMMY重懸菌體，使 OD600＝1.0左右；將所得的菌液置于 1 L的搖瓶中，用三層紗布封口，相同條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng) 96 h；每 24 h向培養(yǎng)基中添加甲醇至終濃度為0.5%；分別在0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132和144 h留取菌液樣品1mL，最大轉(zhuǎn)速離心，保留上清，存于－70℃冰箱備用。

1.2.3.3 重組酵母菌株的高效表達(dá)

使用10 L自動(dòng)攪拌發(fā)酵罐，進(jìn)行畢赤酵母深層發(fā)酵。設(shè)置培養(yǎng)溫度為29℃，甲醇流速設(shè)置為400 μL／min，持續(xù)發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)120 h。根據(jù)溶解氧的整體變化水平來相應(yīng)的調(diào)整甲醇流速。在發(fā)酵過程中，每隔12 h取10mL樣品待測。同時(shí)，取0、36和84 h的樣品用剛果紅平板染色法判斷重組β－1，3（4）葡聚糖酶的酶活性。制備含 6 mg／mL的地衣多糖的瓊脂平板，取 80 μL表達(dá)產(chǎn)物的上清液緩慢滴加至平板的空穴中，將平板放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，使用 2 mg／mL的剛果紅染液染色30 min，使用 1 mg／mL的NaCl進(jìn)行脫色1 h。可以根據(jù)平板上的透明圈的直徑初步判斷出表達(dá)產(chǎn)物的酶活性。

1.2.4 重組β－1，3（4）葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

1.2.4.1 重組β－1，3（4）葡聚糖酶活性的測定

重組葡聚糖酶活性采用二硝基水楊酸法測定。每個(gè)測定組設(shè)定2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2個(gè)平行，以滅活菌液作為空白對照。取8 mg／mL的地衣多糖200 μL作為反應(yīng)底物和100 μL待測酶液，震蕩混勻，置于37℃水浴5 min。加入500 μL的DNS試劑，震蕩混勻，于95℃水浴5 min。以流動(dòng)的冷水終止反應(yīng)后，采用Infinite M200于OD540nm測吸光值，對照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測算酶活性。1個(gè)葡聚糖酶活性單位（IU）為：以0.8%地衣多糖為底物，1 min在最適pH和最適反應(yīng)溫度下分解葡聚糖生成1 μmol還原糖所需的酶量。

1.2.4.2 重組β－1，3（4）葡聚糖酶的純化

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)離心后，取 6mL上清于4℃、12 000 r／min離心，直到上清超濾濃縮至1mL為止。濃縮上清經(jīng) G－75葡聚糖凝膠進(jìn)行層析純化，以pH 5.0的0.2 mg／mL磷酸氫二鈉0.1 mg／mL檸檬酸緩沖液作為洗脫液，采用部分收集器對洗脫組分進(jìn)行收集。調(diào)節(jié)適合的流速，在每只收集管處停留1 min，每管取2 μL樣品采用酶標(biāo)儀于280 nm處測定吸光度，直至OD280回至基線后停止收集。根據(jù) OD280值將處于同一吸收峰的樣品進(jìn)行合并，并測定合并樣品的酶活性。

1.2.4.3 重組β－1，3（4）葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度及pH

最適反應(yīng)溫度的測定：取適量純化后的重組β－1，3（4）葡聚糖酶液，分別在20、30、37、40、50、60、70、80和90℃下測定其酶活性。以酶活性最高者為100%，繪制溫度 －相對酶活性曲線。

1.2.4.4 重組β－1，3（4）葡聚糖酶的最適反應(yīng)pH

最適反應(yīng)pH的測定：取適量純化后的重組β－1，3（4）葡聚糖酶液，分別在pH為 2.2、3、4、5、5.6、6、7、8、9、10、10.5下在最適溫度條件下測定酶活性。以酶活性最高者為100%，繪制 pH－相對酶活性曲線。

1.2.4.5 重組β－1，3（4）葡聚糖酶的溫度穩(wěn)定性

溫度穩(wěn)定性的測定：取適量純化后的重組β－1，3（4）葡聚糖酶液，分別在 20、30、37、40、50、60、70、80和 90℃條件下保持30 min，在最適溫度及pH值條件下測定其剩余酶活性，以0 min時(shí)取出的酶液的酶活性為100%。繪制溫度－相對酶活性曲線。當(dāng)剩余酶活性達(dá)到85%以上，即定義為穩(wěn)定。

1.2.4.6 重組β－1，3（4）葡聚糖酶的pH的穩(wěn)定性

pH穩(wěn)定性的測定：取適量純化后的重組β－1，3（4）葡聚糖酶液，分別在pH為2.2、3、4、5、5.6、6、7、8、9、10和10.5下保持30 min，在最適溫度及pH值條件下測定其剩余酶活性。以酶活性最高者為 100%，繪制pH－相對酶活性曲線。當(dāng)剩余酶活性達(dá)到85%以上，即定義為穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 源于 Paecilomyces sp.FLH30葡聚糖酶基因的優(yōu)化

通過網(wǎng)址 http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／nuccore／HQ825092（GenBank登錄號(hào)為 HQ825092）得到Paecilomyces sp.FLH30葡聚糖酶基因的優(yōu)化前后的核苷酸序列。采用Jcat在線分析軟件（http：／／www.jcat.de／）可對優(yōu)化前后的序列進(jìn)行比較。圖1

圖1 Paecilomyces sp．FLH30葡聚糖酶基因的優(yōu)化前和優(yōu)化后序列比較Fig．1 Alignment of before and optimized glucanase nucleotide sequence of Paecilomyces sp．FLH30

研究表明，Paecilomyces sp.FLH30葡聚糖酶基因優(yōu)化前后的序列對比，優(yōu)化后的序列和優(yōu)化前的序列的相似性為86.05%。

優(yōu)化后的Paecilomyces sp.FLH30葡聚糖酶基因 GLUnm的相對優(yōu)化指數(shù)由 0.103 3提高到0.684 6，GC含量由優(yōu)化前的66.22%變?yōu)閮?yōu)化后的49.05%，由此可知GC含量變化不大。這些數(shù)據(jù)表明優(yōu)化后的葡聚糖酶基因 GLUnm更有利于在畢赤酵母GS115中表達(dá)。圖1

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

研究表明，將pPIC9K－GLUnm重組質(zhì)粒分別經(jīng) EcoR I單酶切，Not I單酶切，EcoR I和 Not I雙酶切。重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切以后產(chǎn)生一條1.4 kb左右的條帶，而空載體pPIC9K沒有這個(gè)片段，表明目的基因已經(jīng)連接到載體pPIC9K中。圖2

圖2 重組質(zhì)粒pPIC9K－GLUnm酶切鑒定Fig．2 Identification of expression plasmids for P．pastoris by digestion

2.3 重組酵母GS115的PCR鑒定

研究表明，GS115的PCR產(chǎn)物在2.2 kb有一條帶，為GS115基因組DNA。pPIC9K－GS115的PCR產(chǎn)物在2.2 kb處產(chǎn)生出一條明顯的條帶，在0.5 kb處也出現(xiàn)有一條明顯的條帶。表明重組酵母中已經(jīng)導(dǎo)進(jìn)了目的基因當(dāng)中。圖3

圖3 重組酵母GS115的PCR鑒定Fig．3 Identification of recombinant P．pastoris GS115 by PCR

2.4 重組β－1，3（4）葡聚糖酶在試管水平下酶活性

將篩選的轉(zhuǎn)化子通過試管進(jìn)行表達(dá)，26個(gè)抗5 mg／mL遺傳霉素G418的克隆都具有葡聚糖酶活性，其中最高的是 120號(hào)，為 0.68 IU／mL。圖4

2.5 重組β－1，3（4）葡聚糖酶在搖瓶水平下酶活性的比較

選取篩選的一株酶活性較高的120號(hào)菌株進(jìn)行搖瓶水平表達(dá)。在36～48 h，隨著時(shí)間的增加，酶活性緩慢上升，在 72～84 h，隨著時(shí)間的增加，酶活性迅速上升，在 84 h之后酶活性開始下降，結(jié)果表明，搖瓶水平重組酵母表達(dá)酶活性在84 h時(shí)達(dá)到最高，為11.26 IU／mL。圖5

圖5 重組β－1，3（4）葡聚糖酶在搖瓶水平下的酶活性Fig．5 The enzyme activity of recombinant β－1，3（4）－dextran in shake flask

2.6 平板剛果紅法鑒定重組β－1，3（4）葡聚糖酶活性

研究表明，畢赤酵母GS115和轉(zhuǎn)化空表達(dá)載體 pPIC9K的酵母菌在連續(xù)培養(yǎng)84 h后沒有產(chǎn)生透明圈，表明培養(yǎng)上清中沒有檢測到葡聚糖酶活性。而轉(zhuǎn)化以后 120號(hào)單克隆重組畢赤酵母菌株，在誘導(dǎo)36 h時(shí)產(chǎn)生了清晰可見的透明圈，36 h時(shí)的透明圈的直徑為17 mm，在連續(xù)培養(yǎng)96 h時(shí)的透明圈直徑為22 mm。重組β－1，3（4）葡聚糖酶基因在畢赤酵母GS115中得到了表達(dá)，并且具有葡聚糖酶活性。圖6

2.7 重組β－1，3（4）葡聚糖酶的純化

研究表明，層析后出現(xiàn)了 2個(gè)比較大的峰。分別將12～24號(hào)試管的酶液和40～71號(hào)試管的酶液收集到一起，用 DNS法測定酶活性，發(fā)現(xiàn)12～24號(hào)試管的酶液有酶活性，而 40～71號(hào)試管的酶液無酶活性，說明12～24號(hào)試管的酶液是純化的酶液。圖7

圖6 平板剛果紅法鑒定重組β－1，3（4）葡聚糖酶活性Fig．6 Activity staining of secreted recombinant β－1，3（4）-dextran on plate observed after induction

圖7 G－75葡聚糖凝膠層析純化中各試管 OD280的吸光值Fig．7 OD280of different tubes when purified by G－75 dextran gel chromatography

2.8 重組β－1，3（4）葡聚糖酶反應(yīng)的最適pH及pH穩(wěn)定性

研究表明，該酶的最適反應(yīng)pH為5.0，在較高pH（6.0～10.5）下也有比較高的活性（70%以上），甚至在pH 9.5以后又有了升高的趨勢，在10.5時(shí)高達(dá)96.90%；而在低pH（2.1～4.0）條件下酶活性很弱。圖8

圖8 重組β－1，3（4）葡聚糖酶反應(yīng)的最適pHFig．8 The optimum pH of recombinant β－1，3（4）－glucanase reaction

研究表明，重組β－1，3（4）葡聚糖酶在pH 5.0～8.0的條件下具有較好的穩(wěn)定性，剩余的活性在70%以上，在更低或更高的pH條件下也有最低40%的剩余酶活，表明該酶具有較強(qiáng)的耐酸堿性。圖9

圖9 重組β－1，3（4）葡聚糖酶反應(yīng)的pH穩(wěn)定性Fig．9 The pH stability of recombinant β－1，3（4）－glucanase reaction

2.9 重組β－1，3（4）葡聚糖酶反應(yīng)的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

研究表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為 50℃，另外在30～40℃也有較高的活性（60%以上）；超過60℃以上則隨溫度的上升酶活性持續(xù)下降。這表明，重組β－1，3（4）葡聚糖酶對溫度較為敏感，中低溫條件下有較高的活性。圖10

圖10 重組β－1，3（4）葡聚糖酶反應(yīng)的最適溫度Fig．10 The optimum temperature of recombinant β－1，3（4）－glucanase reaction

研究表明，重組β－1，3（4）葡聚糖酶在37℃處理30 min后仍然保留了80%以上的酶活性，但是當(dāng)溫度超過60℃后，剩余酶活性迅速下降。當(dāng)反應(yīng)溫度升高到90℃時(shí)，已基本無剩余活性。這表明，該酶在37～50℃左右的條件下有較好的穩(wěn)定性。圖11

圖11 重組β－1，3（4）葡聚糖酶反應(yīng)的溫度穩(wěn)定性Fig．11 The temperature stability of recombinant β－1，3（4）－glucanase reaction

3 討 論

葡聚糖酶在食品、飼料、能源許多行業(yè)領(lǐng)域都得到了越來越廣泛的應(yīng)用，有著十分重要的應(yīng)用前景。β－葡聚糖可分為β－1，3－1，4－葡聚糖（地衣多糖）、β－1，4－葡聚糖（纖維素）、β－1，3－葡聚糖（昆布多糖）和β－1，3（4）－葡聚糖在面包生產(chǎn)過程中，葡聚糖酶可以水解谷物面粉中的葡聚糖，使得面包的品質(zhì)得到改善和提高［8］。β－葡聚糖酶在釀酒工業(yè)以及飼料工業(yè)當(dāng)中也有很重要的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值，在釀酒工業(yè)中，β－葡聚糖酶能夠提高麥汁的分離速度和麥汁浸出量，從而能夠降低啤酒的渾濁度，達(dá)到提高啤酒的質(zhì)量的目標(biāo)。在飼料當(dāng)中添加β－葡聚糖酶可有助于提高谷物的營養(yǎng)價(jià)值，有利于飼料的轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動(dòng)物快速成長，也可起到減少動(dòng)物腹瀉率的作用，很多廠商都積極使用大麥等禾谷類作物選作優(yōu)質(zhì)的能量飼料來源。

目前，有多種新型葡聚糖酶基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)［9］。在真核表達(dá)體系當(dāng)中，公認(rèn)的最為常用的表達(dá)系統(tǒng)是巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris），其具有易于培養(yǎng)、便于基因工程操作［10－13］。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)不但可以將異源表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到畢赤酵母菌體之外［14］，還可以進(jìn)行進(jìn)一步的高密度發(fā)酵［8］，因而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在葡聚糖酶研究中受到很大的關(guān)注［15］。由于宿主在表達(dá)外源基因時(shí)會(huì)有不同的偏愛性，在對外源基因密碼子優(yōu)化時(shí)，主要應(yīng)考慮稀有密碼子的替換、消除 AT富集區(qū)和G＋C含量的調(diào)整等［16］。為了使基因得到高水平的表達(dá)可以由人工合成或者定點(diǎn)突變宿主高頻使用的密碼子［17］。研究以源于 Paecilomyces sp.FLH30的葡聚糖酶基因?yàn)榛A(chǔ)，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛性對該基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并且在畢赤酵母中得到了表達(dá)。

有報(bào)道認(rèn)為，Mut＋型表達(dá)速率較快，適于小分子蛋白的表達(dá)；流加適宜的碳源是提高外源基因在畢赤酵母中表達(dá)的重要措施之一。汪志浩等［18］（2009）報(bào)道，甘油、山梨醇、乳酸與甲醇的混合添加均可以提高畢赤酵母表達(dá)堿性果膠酶的產(chǎn)量，其中山梨醇與甲醇的混合流加效果最為顯著。通過雙碳源混合流加可以提高細(xì)胞活力，增強(qiáng)醇氧化酶活力，提高畢赤酵母表達(dá)外源蛋白效率。在研究中，流加碳源為甲醇時(shí)，重組內(nèi)切β－1，3（4）葡聚糖酶的活性達(dá)到了11.26 IU／mL。通過進(jìn)一步優(yōu)化流加碳源的組合，來源于Paecilomyces sp.FLH30的內(nèi)切β－1，3（4）葡聚糖酶在畢赤酵母GS115中的表達(dá)水平可能還有繼續(xù)提高的空間。

4 結(jié) 論

經(jīng)密碼子優(yōu)化，來源于Paecilomyces sp. FLH30的葡聚糖酶基因在畢赤酵母細(xì)胞中獲得表達(dá)，在試管水平表達(dá)酶活性為0.68 IU／mL，即該重組酵母菌株的初始酶活可以認(rèn)定為0.68 IU／mL，作為搖瓶表達(dá)的初始酶活性。在搖瓶水平條件下，重組酵母表達(dá)的酶活性在84 h時(shí)達(dá)到最高，為11.26 IU／mL。純化后的葡聚糖酶的最適溫度是50℃，最適pH是5.0。

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［1］張永勤，曾凡偉.β－葡聚糖酶活力測定方法的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2011，32（19）：316－320. ZHANG Yong－qin，ZENG Fan－wei.（2011）.Research progress of determination methods for－Glucanase Activity［J］. Food Science，32（19）：316－320.（in Chinese）

［2］呂麗麗，王瑞賓，王家林，等.高效β－葡聚糖酶對麥汁過濾速度的影響［J］.釀酒科技，2010，（3）：75－77. LV Li－li，WANG Rui－bin，WANG Jia－lin.（2010）. Effects of High－efficiency β－glucanase Addition on Wort Filtration Rate［J］.Liquor－Making Science＆Technology，（3）：75－77.（in Chinese）

［3］佘文熙，曾宇，趙俐娜，等.酵母葡聚糖鯖魚魚丸的研制及其質(zhì)構(gòu)特性和防腐效果的研究［J］.食品工業(yè)，2015，36（9）：133－135. SHE Wen－xi，ZENG Yu，ZHAO Li－na，et al.（2015）. Study on Preparation and quality of yeast fish mackerel texture and antiseptic effect［J］.Food Industry，36（9）：133－135.（in Chinese）

［4］蔡成崗，蔣新龍，蔣昌海.β－葡聚糖結(jié)構(gòu)功能與開發(fā)研究進(jìn)展［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2011，（9）：114－117. CAI Chen－gang，JIANG Xin－long，JIANG Chan－h(huán)ai.（2011）.Progress in research on the structure function and development of β－dextran［J］.Farm Products Processing，（9）：114－117.（in Chinese）

［5］段會(huì)軻，熊善柏，胡筱波.酵母β－1，3－葡聚糖酶解產(chǎn)物體內(nèi)抗腫瘤及抗氧化活性的測定［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（5）：871－874. DUAN Hui－ke，XIONG Shan－bai，HU Xiao－bo.（2007）. Study on Antitumor and Antioxidant Activities of Yeast β－1，3－glucan Hydrolysates in vivo［J］.Journal of Huazhong Agricultural University，26（5）：871－874.（in Chinese）

［6］汪艷，李曉，陳勇，等.來源于瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis木聚糖酶在畢赤酵母中的表達(dá)［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（5）：186－193. WANG Yan，LI Xiao，CHEN Yong，et al.（2015）.Expression of a Xylanase Gene Originated from Rumen Anaerobic Fungi Neocallimastix frontalis inPichia pastoris［J］.Biotechnology Bulletin，31（5）：186－193.（in Chinese）

［7］Bang，M.L.，Villadsen，I.，＆Sandal，T.（1999）.Cloning and characterization of an endo－β－1，3（4）glucanase and an aspartic protease from phaffia rhodozyma，cbs 6938.Applied Microbiology＆Biotechnology，51（2）：215－222.

［8］Zhou，C.Y.，Wang，Y.T.，Wu，M.C.，Wu，W.，＆Li，D.F.（2009）.Heterologous expression of xylanase ii from aspergillus usamii in pichia pastoris.Food Technology＆Biotechnology，47（1）：90－95.

［9］Chen X Y，Meng K，Shi P J，et al.（2012）.High－level expression of a novel Penicillium endo－1，3（4）－β－D－glucanase with high specific activity in Pichia pastoris.Microbiol.Biotechnol，39（5）：869－876.

［10］Luo，H.，Yang，J.，Yang，P.，Li，J.，Huang，H.，＆Shi，P.，et al.（2010）.Gene cloning and expression of a new acidic family 7 endo－β－1，3－1，4－glucanase from the acidophilic fungus bispora，sp.mey－1.Applied Microbiology＆Biotechnology，85（4）：1，015－1，023.

［11］Daly，R.，＆Hearn，M.T.W.（2005）.Expression of heter-ologous proteins in pichia pastoris：a useful experimental tool in protein engineering and production.Journal of Molecular Recognition，18（2）：119－138.（in Chinese）

［12］蔡紅英.青霉來源的半纖維素酶基因的克隆與表達(dá)［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文，2011. CAI Hong－ying.（2011）.Cloning and expression of the semi cellulose gene from the source of the strain［D］.Master Dissertation.Chinese Academy of Agicultural Sciences，Beijing.（in Chinese）

［13］張桂敏.木聚糖酶基因的克隆、表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2006. ZHANG Gui－min.（2006）.Cloning，expression and characterization of xylanase gene［D］.PhD Dissertation.Huazhong Agricultural University，Wuhan.（in Chinese）

［14］江正強(qiáng).微生物木聚糖酶的生產(chǎn)及其在食品工業(yè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2005，5（1）：1－9. JIANG Zheng－qiang.（2005）.Advance in Microorganism Xylanases and Their Application in Food Industry［J］.Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，5（1）：1－9.（in Chinese）

［15］韓學(xué)易，李治國，陳惠.飼用木聚糖酶基因的克隆及序列分析［J］.中國飼料，2013，（4）：16－21. HAN Xue－yi，LI Zhi－guo，CHEN Hui.（2013）.Cloning and sequence analysis of feed xylanase enzyme gene［J］.China Feed，（4）：16－21.（in Chinese）

［16］Shumiao Z，Huang J，Zhang C，Deng L，Hu N，＆Liang Y.（2010）.High－level expression of an aspergillus niger endobeta－1，4－glucanase in pichia pastoris through gene codon optimization and synthesis.Journal of Microbiology＆Biotechnology，20（3）：467－473.（in Chinese）

［17］Zhao Shumiao，Jun Huang，Zhang Changyi，et al.（2010）. High－level expression of an Aspergillus niger endo－β－1，4－glucanase in Pichia pastoris through gene codon optimization and synthesis［J］.Joumal of Microbiology and Biotechnology，20（3）：467－473.（in Chinese）

［18］汪志浩，張東旭，李江華，等.混合碳源流加對重組畢赤酵母生產(chǎn)堿性果膠酶的影響［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2009，25（12）：1 955－1 961. Zhihao Wang，Dongxu Zhang，Jianghua Li，et al.（2009）. Mixed carbon sources and influence of recombinantPichia pastoris producing alkaline pectinase［J］.Journal of biological engineering，25（12）：1，955－1，961.

Expression of the Paecilomyces sp．FLH30 endo β－1，3（4）Glucanase Gene in Pichia pastoris

HU Wei1，2，ZHANG Hui－ling1，WEI Huan1，F(xiàn)U Ting－ting1，CHEN Yong1，WU Yun2
（1．Xinjiang Key Laboratory of Herbivore Nutrition for Meat＆Milk Production，College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2．College of Food and Pharmaceutical Sciences，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

【Objective】β－1，3（4）glucanase is an important industrial enzyme，which is widely used in feed industry，brewing industry and textile industry.【Method】This study takes the Paecilomyces sp.FLH30 β－1，3（4）Glucanase Gene as the research object.According to the preference of the codon of Pichia pastoris GS115，from the Paecilomyces sp.FLH30 β－1，3（4）glucanase gene was optimized，full－length gene GLUnm was synthesized by full gene technique and the recombinant yeast expression vector pPIC9K－GLUnm was constructed，linearized recombinant plasmid pPIC9K－GLUnm with Sac I，electroporation was transformed into Pichia pastoris GS115 for expression.【Result】The hygromycin resistance phenotype screening，genetic screening，identified by PCR showed that the glucanase gene was integrated into yeast chromosome DNA.The expression was induced by methanol in the test tube，and the activity of the enzyme was determined.The enzyme activity was 0.68 IU／mL，which could be considered as the initial enzyme activity of 0.68 IU／mL.The expression of 84 h was highest and the enzyme activity was 0.68 IU／mL.【Conclusion】The results of enzymatic properties showed that the optimum pH was 5.0，the optimum reaction temperature was 50℃.The enzymatic properties was more stable at the temperature of 37－50℃ in pH 5.0－8.0.

β－1，3（4）－glucanase；Pichia pastoris；expression；enzymatic properties

Q939.97

A

1001－4330（2016）09－1715－11

10.6048／j.issn.1001－4330.2016.09.020

2016－04－26

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究項(xiàng)目（201211104）；2015年新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（XJAUGRI2015011）

胡瑋（1988－），女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)，（E－mail）huwei0709＠163.com

（Cotresponding author）：陳勇（1972－），男，四川德陽人，教授，博士，研究方向?yàn)槊傅幕蚬こ?，（E－mail）xjaucy＠hotmail.com武運(yùn)（1965－），女，重慶人，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)，（E－mail）wuyunster＠sina.com

Fund project：Xinjiang Uygur Autonomous Region high technology research project（No.201211104）and Xinjiang Augricultural University Postgraduate Innovative Research Project（XJAUGRI2015011）