產(chǎn)紫杉醇真菌Pestalotiopsismicrospora NK17適合遺傳篩選的培養(yǎng)基優(yōu)化

陳龍飛， 朱項(xiàng)陽(yáng)， 李瑩瑩， 張 倩， 潘 皎， 朱旭東

(南開(kāi)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院微生物系, 天津 300071)

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產(chǎn)紫杉醇真菌PestalotiopsismicrosporaNK17適合遺傳篩選的培養(yǎng)基優(yōu)化

陳龍飛， 朱項(xiàng)陽(yáng)， 李瑩瑩， 張 倩， 潘 皎， 朱旭東*

(南開(kāi)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院微生物系, 天津 300071)

小孢擬盤(pán)多毛孢菌株NK17被證明能夠產(chǎn)生多種具有藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值的紫杉烷類(lèi)似物以及冠心病治療藥物的前導(dǎo)物pestalotiollide B等次級(jí)代謝產(chǎn)物。由于是天然分離的菌株，該菌的營(yíng)養(yǎng)要求未知，特別是缺少合適的全合成基礎(chǔ)培養(yǎng)基，制約了實(shí)驗(yàn)室對(duì)其性狀和基因水平的操作。尤其是在使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，全合成基礎(chǔ)培養(yǎng)基是篩選工作的前提。對(duì)各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選比較，最終確定酵母氮源加乳糖和硫酸銨的全合成基礎(chǔ)培養(yǎng)基最適合NK17菌絲生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選。同時(shí)對(duì)該培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了研究，成功應(yīng)用該培養(yǎng)基進(jìn)行了缺陷型回補(bǔ)篩選，效果較好。

擬盤(pán)多毛孢；基礎(chǔ)培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)缺陷型；酵母氮源；次級(jí)代謝

擬盤(pán)多毛孢屬(Pestalotiopsisspp.)真菌是一種常見(jiàn)的植物內(nèi)共生菌或者病原菌[1]，在自然界中與多種植物有著內(nèi)共生關(guān)系，其中比較有代表性的如小孢擬盤(pán)多毛孢(Pestalotiopsismicropora)。據(jù)報(bào)道，佛羅里達(dá)榧樹(shù)(Torreyataxifolia)、歐洲紅豆杉(Taxusbaccata)、西藏紅豆杉、落羽杉(Taxodiumdistichum)和石斛(Dendrobiumspeciosum)都有共生的擬盤(pán)多毛孢存在[2-4]。該屬的內(nèi)生真菌一直被作為植物病原菌來(lái)研究的[5]。1996年，Strobel等從西藏紅豆杉中分離得到了一株能夠產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇的小孢擬盤(pán)多毛孢[3]，引起了很多研究小組對(duì)擬盤(pán)多毛孢的興趣，1997年Strobel的研究小組又發(fā)現(xiàn)另1株產(chǎn)紫杉醇的擬盤(pán)多毛孢屬(Pestalotiopsisguepinii)真菌[6]。本實(shí)驗(yàn)室的多株產(chǎn)紫杉烷真菌中，就有2株擬盤(pán)多毛孢屬真菌，其中1株小孢擬盤(pán)多毛孢NK17，被證明能夠在發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)到紫杉醇和pestalotiollide B[7-8]。隨后對(duì)其進(jìn)行了全基因組測(cè)序，但是由于擬盤(pán)多毛孢與構(gòu)巢曲霉及粗糙脈孢菌等模式絲狀真菌有著較大的差異，其分子生物學(xué)工具無(wú)法通用，并且還有對(duì)外源轉(zhuǎn)化進(jìn)入的DNA添加端粒重復(fù)序列的特性[9]，因而對(duì)其進(jìn)行基因水平的研究遇到很大障礙。據(jù)我們的研究發(fā)現(xiàn)，常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室抗真菌藥中只有潮霉素對(duì)其有明顯的抑制效果，因此目前實(shí)驗(yàn)室常用的抗性基因中只有潮霉素抗性基因可以用來(lái)作為NK17的篩選標(biāo)記，對(duì)其進(jìn)行基因水平的操作。這使得基因回補(bǔ)和多基因敲除受到了極大地限制，因此嘗試通過(guò)5氟乳清酸(5-FOA)及無(wú)標(biāo)記基因的無(wú)痕敲除方法將其pm-ura3基因無(wú)痕刪除，得到了營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株[10]，再通過(guò)擴(kuò)增野生型種的pm-ura3基因來(lái)回補(bǔ)缺陷型菌株，從而證明此方法的可行性。但是由于NK17在多種絲狀真菌常見(jiàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況非常差，無(wú)法進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的回補(bǔ)篩選，因此本研究系統(tǒng)地篩選比較了各種合成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，得到了最適合用來(lái)培養(yǎng)NK17的YNB乳糖培養(yǎng)基，并成功應(yīng)用該培養(yǎng)基對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型回補(bǔ)菌株進(jìn)行了篩選，比較了NK17在YNB乳糖培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基上發(fā)酵產(chǎn)物的區(qū)別。本研究對(duì)Pestolatiopsisspp.的分子生物研究提供基本培養(yǎng)方法和可參考的發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 小孢擬盤(pán)多毛孢菌株NK17由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存于-80 ℃冰箱中。

1.1.2 藥品 各種化學(xué)藥品均為分析純和色譜純。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①構(gòu)巢曲霉基礎(chǔ)培養(yǎng)基ANmm(Aspergillusnidulansminimal medium)成分參照文獻(xiàn)[11]；②ANmmC：在ANmm的基礎(chǔ)上加入⑨中的氨基酸和核酸混合物；③粗糙脈孢菌培養(yǎng)基NCmm (Neurosporacrassaminimal medium. Vogel’s)參照文獻(xiàn)[12]；④NCmmC：在NCmm的基礎(chǔ)上加入⑨中的氨基酸和核酸混合物；⑤NCmmP：在NCmm的基礎(chǔ)上加入10 g/L蛋白胨；⑥PLB(Potato lactose broth)培養(yǎng)基:削皮馬鈴薯200 g，加入蒸餾水煮沸30 min，過(guò)濾后取濾液，加乳糖20 g，pH自然,其固體培養(yǎng)基名稱為PLA；⑦YNB (Yeast nitrogen base)培養(yǎng)基:不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮源1.7 g，硫酸銨 5 g，乳糖20 g,調(diào)pH 6.2～6.4；⑧乳糖蛋白胨培養(yǎng)基：乳糖10 g，酵母膏5 g，硫酸鎂 0.2 g，蛋白胨10 g;磷酸二氫鉀 3 g，調(diào)pH 6.2～6.4(以上8種培養(yǎng)基均為1 L液體培養(yǎng)基，固體則加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂粉。其中PLB為天然完全培養(yǎng)基。乳糖蛋白胨和NCmmP為半合成完全培養(yǎng)基，其他5種均為合成基礎(chǔ)培養(yǎng)基。)；⑨氨基酸核苷酸混合物(μg/mL)： 硫酸腺嘌呤20，尿嘧啶20，L-色氨酸20，L-組氨酸20，L-精氨酸20，L-甲硫氨酸20，L-酪氨酸30，L-亮氨酸30，L-異亮氨酸30，L-賴氨酸鹽酸鹽30，L-苯丙氨酸50，L-谷氨酸100，L-天門(mén)冬氨酸100，L-纈氨酸150，L-蘇氨酸200，L-絲氨酸400。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 接種菌絲或孢子的平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種菌絲或孢子的搖瓶置于28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，每個(gè)500 mL搖瓶裝培養(yǎng)基200 mL，轉(zhuǎn)速為180 r/min。

1.2.2 發(fā)酵液獲取與高效液相色譜(HPLC)分析方法 通過(guò)抽濾分離發(fā)酵液與菌絲，再用1倍體積的二氯甲烷或乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，取有機(jī)相通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)相濃縮后，使用70%的甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行HPLC檢測(cè)，具體過(guò)程參照文獻(xiàn)[13]。

1.2.3 營(yíng)養(yǎng)缺陷型轉(zhuǎn)化方法 使用攜帶有標(biāo)記基因T-DNA載體的農(nóng)桿菌LBA4404作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的工具，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上鋪一層纖維素膜，再涂布NK17孢子與農(nóng)桿菌的混合液，36 h后將纖維素膜轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，2 d左右揭開(kāi)纖維素膜，再培養(yǎng)1～2 d即有肉眼可見(jiàn)的轉(zhuǎn)化子，具體請(qǐng)參照文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲狀真菌基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基效果比較

NK17為一種絲狀真菌，首先選用模式絲狀真菌——粗糙脈孢菌和構(gòu)巢曲霉中廣泛使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，并觀察和記錄平板上的菌落生長(zhǎng)情況。結(jié)果如圖1所示，這兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基(NCmm和ANmm)上的NK17菌絲生長(zhǎng)緩慢，并在生長(zhǎng)3 d后就基本不再生長(zhǎng)，而天然培養(yǎng)基PLA上的菌絲則繼續(xù)快速生長(zhǎng)，直到6 cm以上時(shí)由于培養(yǎng)皿本身直徑的制約而開(kāi)始減慢菌絲外擴(kuò)速度。而且從培養(yǎng)基表面菌落狀態(tài)來(lái)看，2 d后這兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)不健康，表面發(fā)干、發(fā)硬，老化現(xiàn)象嚴(yán)重，并產(chǎn)生大量黑色素，停止生長(zhǎng)。另外，嘗試在兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加各種必需氨基酸和核酸混合物，但仍然是完全合成的培養(yǎng)基(NCmmC和ANmmC)，混合物的加入對(duì)菌絲的生長(zhǎng)并沒(méi)有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，反而在NCmm中加入氨基酸和核酸混合物3 d后有輕微抑制生長(zhǎng)的現(xiàn)象(圖1)。因此可以得到結(jié)論，這兩種絲狀真菌常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基并不適合NK17使用。

圖1 NK17在5種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)對(duì)比Fig.1 The growth comparison of NK17 on 5 kinds of medium柱狀圖上字母不同則差異顯著(P<0.05)，圖2同Different letters above bars indicate significant differences(P<0.05),Figure 2 with

2.2 酵母用固體培養(yǎng)基效果比較

NK17是一種子囊菌，除粗糙脈孢菌和構(gòu)巢曲霉等絲狀真菌之外，酵母菌也是子囊菌中研究最為廣泛的生物種類(lèi)，本研究嘗試使用酵母氮源(YNB)中加上硫酸銨和最適合NK17生長(zhǎng)并產(chǎn)孢子的乳糖作為碳源，配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基。同時(shí)以兩種半合成培養(yǎng)基(乳糖蛋白胨培養(yǎng)基、ANmmP)和天然培養(yǎng)基PLA作為對(duì)照。由圖2可知，使用菌絲尖端接種法，NK17的菌絲在YNB上和PLA上保持了相近的生長(zhǎng)速率，且沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)停止現(xiàn)象，菌絲比較健康，但是由于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的營(yíng)養(yǎng)并不豐富，菌絲比較薄，氣生菌絲相對(duì)比較少，生物量也較少，但是卻更適合用來(lái)觀察菌絲生長(zhǎng)情況，而且作為篩選用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，反而可以更容易分辨出單菌落，為其純化提供方便。

圖2 NK17在4種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)對(duì)比Fig.2 The growth comparison of NK17 on four different medium

2.3 YNB培養(yǎng)基和PLA培養(yǎng)基對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)效果比較

通過(guò)無(wú)痕敲除方法得到的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株Δura-1失去了pm-ura3基因，從而失去合成尿嘧啶的能力[10]。因?yàn)閅NB乳糖培養(yǎng)基中不含尿嘧啶，所以Δura-1在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基上應(yīng)該無(wú)法生長(zhǎng)，結(jié)果也符合預(yù)期。如圖3A所示，YNB培養(yǎng)基中心處接種黑色的Δura-1孢子4 d后仍然無(wú)法萌發(fā)，沒(méi)有觀察到明顯的菌絲。同樣的培養(yǎng)基上接種野生型的菌株在接種的第2天時(shí)就可以觀察到明顯的菌絲，隨后的生長(zhǎng)也十分良好(圖3B)。而將YNB中添加200 μg/mL的尿嘧啶后，Δura-1生長(zhǎng)基本恢復(fù)，只是孢子的萌發(fā)時(shí)間會(huì)稍微延遲(圖3C)。YNB培養(yǎng)基上培養(yǎng)的野生型NK17菌絲生長(zhǎng)良好，但并不適合產(chǎn)生孢子。如圖3D所示，7 d后仍然沒(méi)有明顯的黑色孢子，而3～4 d左右時(shí)PLA上的NK17便開(kāi)始逐漸產(chǎn)生大量黑色孢子，最終整個(gè)培養(yǎng)基表面都呈黑色(圖3E、F)。綜上可知，YNB培養(yǎng)基適合用于缺陷型標(biāo)記篩選及菌絲形態(tài)觀察，也有可能作為一種誘導(dǎo)孢子產(chǎn)生的初始培養(yǎng)基使用。

圖3 NK17野生型和營(yíng)養(yǎng)缺陷型在YNB和PLA上的生長(zhǎng)對(duì)比Fig.3 The growth comparison of wild type strain of NK17 and its auxotrophic strain on YNB and PLA

A：接種營(yíng)養(yǎng)缺陷型Δura-1孢子在YNB培養(yǎng)基上4 d未萌發(fā)；B：接種野生型NK17孢子到Y(jié)NB培養(yǎng)基上3 d的生長(zhǎng)情況;C:含200 μg/mL尿嘧啶的YNB培養(yǎng)基上Δura-1孢子3 d時(shí)的生長(zhǎng)情況;D:接種野生型NK17孢子在YNB培養(yǎng)基上7 d的生長(zhǎng)情況;E:接種野生型NK17孢子在PLA培養(yǎng)基上3 d的生長(zhǎng)情況;F: 接種野生型NK17孢子在PLA培養(yǎng)基上7 d的生長(zhǎng)情況

A:The conidia of auxotrophic strainΔura-1 can’t germinate on YNB even after being plated for 4 days;B:The growth of wild type strain on YNB after 3 days;C:The growth ofΔura-1 after 3 days on YNB,added with uracil of 200 μg/mL;D: The growth of wild type strain on YNB after 7 days;E:The growth of wild type strain on PLA after 3 days;F:The growth of wild type strain on PLA after 7 days

2.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基YNB與天然完全培養(yǎng)基PLB發(fā)酵液比較

在使用1.2.2中描述的方法處理培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液后，使用70%的甲醇作為流動(dòng)相檢測(cè)發(fā)酵液中萃取出來(lái)的物質(zhì)，可以從圖4中看到，使用YNB培養(yǎng)基與PLB培養(yǎng)基產(chǎn)生的可檢測(cè)到的次級(jí)代謝產(chǎn)物出峰時(shí)間基本一致，但總體每個(gè)物質(zhì)濃度都會(huì)低很多。另外，圖4中箭頭所指的物質(zhì)在YNB中的產(chǎn)量比PLB中產(chǎn)量高。由此可見(jiàn)，YNB能夠保證NK17的基本生長(zhǎng)和次級(jí)代謝，但是由于營(yíng)養(yǎng)不夠豐富，產(chǎn)生的絕大部分次級(jí)代謝產(chǎn)物濃度會(huì)比天然培養(yǎng)基PLB少很多。因此建議在獲得轉(zhuǎn)化子之后的其他發(fā)酵產(chǎn)物研究中,使用合適的豐富培養(yǎng)基如PLB。

2.5 YNB篩選效果驗(yàn)證

根據(jù)NK17在各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況，最終選擇YNB作為營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株回補(bǔ)的篩選培養(yǎng)基。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化需要足夠的孢子萌發(fā)率才能保證轉(zhuǎn)化效率，為了提高營(yíng)養(yǎng)缺陷型的NK17的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率，對(duì)1.2.3中描述的野生型NK17的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法做了一些細(xì)節(jié)上的修改，向誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM中添加50 μg/mL的尿嘧啶來(lái)增加孢子萌發(fā)效率[10]，最終的篩選培養(yǎng)基使用結(jié)果如圖5所示，重新獲得pm-ura3基因的菌株在纖維素膜被揭去1～2 d內(nèi)就會(huì)形成明顯的單菌落，而未成功導(dǎo)入pm-ura3基因的孢子則完全無(wú)法生長(zhǎng)，大大減少了菌落間混合的可能性，方便了分離純化。

圖4 NK17在PLB和YNB中的發(fā)酵產(chǎn)物HPLC檢測(cè)對(duì)比Fig.4 The comparison of secondary metabolites produced by NK17 in PLB and YNBA：PLB中的發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果;B:YNB中的發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果A:The HPLC analysis of secondary metabolites in PLB;B:The HPLC analysis of secondary metabolites in YNB

圖5 YNB作為尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型NK17的篩選培養(yǎng)基Fig.5 The utilization of YNB as selection medium for uracil deficient NK17

3 討 論

通常情況下絲狀真菌由于生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)比酵母菌苛刻，需要配置含有豐富無(wú)機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)保證其生長(zhǎng)，如模式絲狀真菌構(gòu)巢曲霉和粗糙脈孢菌等的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中包含了一系列的微量元素。但適合這些容易培養(yǎng)的絲狀真菌的條件并不都適合于從自然環(huán)境中分離得到的其他種屬。對(duì)于一些有應(yīng)用價(jià)值的種屬，常用條件往往并不合適，例如NK17就在這些培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況較差，必須通過(guò)一系列的條件摸索得到適合其生長(zhǎng)和研究的培養(yǎng)條件。本研究發(fā)現(xiàn)，NK17更適合生長(zhǎng)在通常用來(lái)配置酵母用基礎(chǔ)培養(yǎng)基的YNB上，再加上乳糖和硫酸銨就構(gòu)成了適合NK17的完全合成基礎(chǔ)培養(yǎng)基，這與粗糙脈孢菌和構(gòu)巢曲霉等不一致。作為一種完全合成培養(yǎng)基，YNB乳糖培養(yǎng)基可以滿足NK17菌絲生長(zhǎng)基本需求，而且配置簡(jiǎn)單，有商業(yè)化的產(chǎn)品使用，可以節(jié)省配置組分復(fù)雜的NCmm和ANmm所耗費(fèi)的時(shí)間。而且由于其成分簡(jiǎn)單，在添加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后又可以讓營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)，從而得以方便地對(duì)NK17進(jìn)行遺傳改造。

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Medium Optimization Suitable for Genetic Screening of Taxol-Producing Fungus Pestalotiopsis microspora NK17

CHEN Long-fei, ZHU Xiang-yang, LI Ying-ying, ZHANG Qian, PAN Jiao, ZHU Xu-dong

(Dept.ofMicrobiol.,Coll.ofLifeSci.,NankaiUni.,NankaiDist.Tianjin300071)

PestalotiopsismicrosporaNK17 has been proved could produce many useful secondary metabolites that possesses values in medicine development, including parallel of yew alkane as well as preceding substance for coronary treatment, paclitaxel and pestalotiollide B etc. Since the nutritional requirement of the strain remains unknown, and the lack of an appropriate totally synthetic minimal medium, these have limited the genetic manipulation in its characters and genetic levels. Especially a totally synthetic basic medium is the key prerequisite for screening works when using auxotrophic strains to carry out genetic transformation. In this study, the growth of NK17 on several minimal media and their improved versions were screened and compared. A totally synthetic minimal medium with yeast nitrogen source plus lactose and (NH4)2SO4was finally confirmed to be the most suitable for NK17 mycelial growth and screening for auxotroph. At the same time, the fermentation products of were studied, and successfully retro-mend screened the auxotroph using the medium with fairly good effects.

Pestalotiopsismicrospora; minimal medium; auxotroph; YNB; secondary metabolite

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”(2012AA022105)

陳龍飛 男，博士研究生。研究方向?yàn)榉肿诱婢鷮W(xué)。E-mail:flydream0417@126.com

* 通訊作者。男，教授,博士，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)榉肿诱婢鷮W(xué)。Tel:022-23506510，E-mail: xudong82@nankai.edu.cn

2015-04-28；

2015-06-11

Q933

A

1005-7021(2016)01-0006-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.01.002