補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合依達(dá)拉奉對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

鐘芳芳 吳承龍 孫新芳 章燕幸

補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合依達(dá)拉奉對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

鐘芳芳 吳承龍 孫新芳 章燕幸

目的 研究補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合依達(dá)拉奉對小鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)的影響。方法 將50只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組、依達(dá)拉奉組和兩藥聯(lián)用組，每組10只，其中缺血再灌注后1d和7d各5只。首先制備小鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型，TUNEL法觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI），免疫組化法觀察小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Bcl、Bax-2和Caspase-3表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組、依達(dá)拉奉組、兩藥聯(lián)用組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞AI值均明顯降低（P＜0.05），Bcl-2/Bax比值明顯升高（P＜0.05），Caspase-3表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），其中又以兩藥聯(lián)用組更為明顯（P＜0.05）。結(jié)論 兩藥聯(lián)用能降低腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，降低促凋亡基因Caspase-3的表達(dá)，協(xié)同發(fā)揮腦保護(hù)作用。

補(bǔ)陽還五湯 依達(dá)拉奉 腦缺血再灌注 細(xì)胞凋亡 Caspase-3 Bcl-2/Bax

【 Key words】 Buyang Huanwu decoction Edaravone Cerebral ischemia reperfusion Cellular apoptosis Caspase-3 Bcl-2/Bax

缺血性腦血管病具有高發(fā)病率、高病死率和高致殘率等特點(diǎn)，其發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多系統(tǒng)反應(yīng)的結(jié)果，而減輕腦缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元凋亡是治療關(guān)鍵[1]。本研究采用補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合依達(dá)拉奉作用于小鼠腦缺血模型，觀察兩藥聯(lián)用對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及Caspase-3、Bcl-2和Bax凋亡蛋白表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8月齡C57BL/6型雄性小鼠，體重25～30g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號：scxk（滬）2008-0016。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)觀察3 d，將造模成功的50只小鼠以隨機(jī)數(shù)字法分成假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組、依達(dá)拉奉組和兩藥聯(lián)用組，每組10只，其中缺血再灌注后1d和7d各5只。

1.2 藥品和試劑 依達(dá)拉奉注射液（南京先聲東元制藥有限公司）；補(bǔ)陽還五湯（紹興市人民醫(yī)院制劑室提供，由黃芪120g、當(dāng)歸6g、川芎3g、地龍3g、赤芍5g、紅花3g和桃仁3g組成，水煎、濃縮后生藥含量為2.0g/ ml）。氯化三苯基四氮唑（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；TUNEL凋亡試劑盒（美國Boehringer Manmbeim公司生產(chǎn)，購自福州邁新生物公司）；免疫組化染色試劑盒：Bcl-2（批號20070223），Bax（批號20070223），Caspase-3（批號20070227），均購自武漢博士德生物工程有限公司；DAB試劑盒（購自北京中山試劑公司）。

1.3 小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型的建立 參照改良的Longa-Zea線栓法[2]制作小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。缺血90min后，拔出線栓再灌注。假手術(shù)組僅分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并離斷右頸外動(dòng)脈，不予栓塞。術(shù)后2 h采用神經(jīng)功能評分驗(yàn)證造模是否成功，即造模動(dòng)物出現(xiàn)右側(cè)Horner征和左側(cè)以上肢為重的偏癱作為動(dòng)物模型成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，剔除不符合標(biāo)準(zhǔn)或死亡的動(dòng)物，并隨機(jī)補(bǔ)充。造模成功率為90%。

1.4 給藥方式 補(bǔ)陽還五湯組于術(shù)后2h灌服補(bǔ)陽還五湯，按10ml/kg給藥；依達(dá)拉奉組于術(shù)后2h尾靜脈注射依達(dá)拉奉，按3mg/kg給藥；兩藥聯(lián)用組于術(shù)后2h分別給予等劑量補(bǔ)陽還五湯灌胃和依達(dá)拉奉尾靜脈注射；模型組和假手術(shù)組均給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃和尾靜脈注射；首次給藥后，每天1次，連續(xù)7d。

1.5 標(biāo)本制作 小鼠在腦缺血再灌注1d和7d后，經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉（600mg/kg），迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，于心尖部剪開左心室，插管至主動(dòng)脈，快速注入150ml甲醛灌注固定，斷頭取腦，沿視交叉后緣做冠狀切片，常規(guī)石蠟包埋，做5μm連續(xù)切片用于凋亡與免疫組化檢測。

1.6 凋亡細(xì)胞檢測 采用TUNEL法檢測凋亡神經(jīng)細(xì)胞。（1）切片常規(guī)脫蠟至水，滴加蛋白酶K室溫消化20min；（2）微波修復(fù)抗原5min后自然冷卻；（3）滴加TUNEL反應(yīng)液，37℃孵育1h；（4）滴加辣根過氧化物酶標(biāo)抗熒光素抗體工作液，37℃孵育30min；（5）用DAB顯色劑呈色；（6）常規(guī)脫水、透明、封片。在光鏡下觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。計(jì)算凋亡指數(shù)（AI），AI＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 免疫組化染色 切片常規(guī)脫蠟至水，滴加3% H2O2孵育10min；微波修復(fù)抗原10min自然冷卻至室溫；滴加10%正常山羊血清，室溫封閉30min；分別滴加兔抗Bcl-2、兔抗Bax和兔抗Caspase-3抗血清，4℃孵育24h；滴加二抗工作液（山羊抗兔）室溫反應(yīng)15min；滴加辣根酶標(biāo)記卵白素工作液，室溫反應(yīng)15min；DAB顯色劑呈色；梯度脫水、中型樹脂封片。在光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞；并計(jì)算陽性染色神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目。

1.8 圖像處理 取每只小鼠2張切片，置于光鏡下，隨機(jī)選擇梗死灶周邊區(qū)5個(gè)視野，分別分析神經(jīng)細(xì)胞AI、Bcl-2/Bax和Caspase-3陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腦缺血再灌注1d和7d后神經(jīng)細(xì)胞AI值 腦缺血再灌注1d和7d后，模型組和各用藥組神經(jīng)細(xì)胞AI值均高于假手術(shù)組（P＜0.01）。同一時(shí)間點(diǎn)，各用藥組神經(jīng)細(xì)胞AI值均明顯低于模型組（P＜0.05），兩藥聯(lián)用組均低于其他用藥組（P＜0.05），依達(dá)拉奉組與補(bǔ)陽還五湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠腦缺血再灌注1d和7d后的神經(jīng)細(xì)胞AI值

2.2 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后Bcl-2/Bax 各組小鼠腦缺血再灌注損傷1d和7d后的Bcl-2/Bax比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.90、5.34，均P＜0.01），2個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為兩藥聯(lián)用組高于其他各組（P＜0.05），見表2。

2.3 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元Caspase-3的表達(dá) 腦缺血再灌注1d和7d后，模型組和各用藥組神經(jīng)元Casepase-3表達(dá)均高于假手術(shù)組（P＜0.01）。同一時(shí)間點(diǎn)，各用藥組神經(jīng)元Casepase-3表達(dá)均低于模型組（P＜0.01），兩藥聯(lián)用組低于其他用藥組（P＜0.05），但依達(dá)拉奉組與補(bǔ)陽還五湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷主要包括壞死和凋亡。缺血中心區(qū)細(xì)胞迅速壞死，而周邊缺血半暗帶區(qū)發(fā)生以凋亡為主的遲發(fā)性死亡[3]。因此，搶救半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡，能減輕腦缺血再灌注損傷的程度和范圍[4]。細(xì)胞凋亡受到多基因、多系統(tǒng)調(diào)控，Bcl-2、Bax是與神經(jīng)元凋亡關(guān)系密切的調(diào)控基因。前者抑制細(xì)胞凋亡，后者促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2與Bax蛋白可形成結(jié)合體，過度表達(dá)Bax蛋白能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制Bcl-2的抗凋亡作用。Bcl-2/Bax比值越低，細(xì)胞凋亡率越高[5-7]。此外，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的敏感指標(biāo)，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)最關(guān)鍵的執(zhí)行者，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用[8]，阻抑Caspase-3表達(dá)，對防止腦損傷惡化和改善神經(jīng)功能具有重要意義。

表2 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后Bcl-2/Bax

表3 各組小鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元Caspase-3的表達(dá)

補(bǔ)陽還五湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，是補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)的方藥，能多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[9-10]，減少腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡[11]。腦缺血再灌注時(shí)體內(nèi)氧自由基大量產(chǎn)生，可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[12]。ED具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的作用，可抑制神經(jīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞的過氧化和遲發(fā)性死亡，減輕腦水腫及組織損傷，且促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子產(chǎn)生[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型組腦組織凋亡細(xì)胞明顯增多，藥物治療后凋亡細(xì)胞明顯減少，尤以兩藥聯(lián)用組減少最顯著，這提示腦缺血再灌注損傷可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生，補(bǔ)陽還五湯和依達(dá)拉奉對神經(jīng)細(xì)胞凋亡均有抑制作用，兩藥聯(lián)用效果尤為顯著。

同時(shí)，小鼠腦缺血再灌注后缺血區(qū)細(xì)胞的Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)明顯增多，說明Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)參與腦缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷過程，小鼠腦缺血再灌注后啟動(dòng)了凋亡機(jī)制。腦缺血再灌注1d和7d后，各用藥組小鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax比值均高于模型組，Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)少于模型組，尤以兩藥聯(lián)用最顯著。這表明補(bǔ)陽還五湯與依達(dá)拉奉均可增高Bcl-2/Bax比值，抑制凋亡誘導(dǎo)基因Caspase-3的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，兩藥聯(lián)用可協(xié)同發(fā)揮腦保護(hù)作用，效果更佳。

本文從分子水平闡明了兩藥聯(lián)用治療急性缺血性腦血管病的優(yōu)勢，為臨床推廣應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，開辟了缺血性腦血管病治療的新途徑。

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（本文編輯：陳丹）

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本刊編輯部

Neuroprotective effect of Chinese medicine Buyang Huanwu Decoction combined with edaravone on cerebral ischemia/reperfusion injury in mice

ZHONG Fangfang，WU Chenglong，SUN Xinfang，et al.Department of Neurology,Shaoxing People's Hospital，Shaoxing 312000,China

Objective To investigate the effects of Chinese medicine Buyang Huanwu Decoction(BYHWD)combined with edaravone（ED）on cerebral ischemia/reperfusion injury in mice. Methods Fifty mice were randomly divided into sham operation group，model group，BYHWD group,ED group and BYHWD+ED group.Each group were further randomly divided into 1d and 7d group.The middle cerebral artery occlusion/reperfusion model was established by the improved intraluminal filament technique in mice.The animals were sacrificed on d1 (n=5)and d7 (n=5)after ischemic/reperfusion was induced in each group. Immunohistochemistry method was used to analyze the expression of Bcl,Bax-2 and Caspase-3 protein in neurons,and TUNEL method was used to evaluate the apoptosis of neuron. Results Compared with model group,the apoptosis index was reduced (P＜0.05),ratio of Bcl-2/Bax was increased (P＜0.05),and Caspase-3-postive cells were decreased (P＜0.01)in BYHWD,ED and BYHWD+ED groups,and those in BYHWD+ED group were changed most significantly. Conclusion Chinese medicine Buyang Huanwu decoction has a synergistic effect with edaravone in protection ofthe brain from ischemic/reperfusion injury.

2015-10-14）

浙江省紹興市公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2013B70076）

312000 紹興市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

鐘芳芳，E-mail：yangmum@126.com