野黃芩素通過PI3K/Nrf2/HO-1途徑減輕LPS誘導的大鼠急性肺損傷

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(南華大學附屬第二醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421001)

·基礎醫(yī)學·

野黃芩素通過PI3K/Nrf2/HO-1途徑減輕LPS誘導的大鼠急性肺損傷

王彪，袁娜*，張永虎，曾良

(南華大學附屬第二醫(yī)院急診科，湖南 衡陽 421001)

目的探討野黃芩素(SCT)對脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷(ALI)大鼠表達血紅素氧合酶-1(HO-1)的機制。方法大鼠靜脈內注射LPS(30 mg/kg)以誘導ALI。1h后分別給予不同濃度的SCT(0.1，0.5和1.0 mmol/kg)靜脈注射。獲肺組織標本，實時定量PCR和Western blot分別檢測血紅素氧合酶-1(HO-1)mRNA及蛋白的表達；比色法檢測HO-1酶活性；HE染色觀察病理學改變情況。提取組織總蛋白和核蛋白，Western blot檢測PI3K磷酸化以及Nrf2核轉位情況，同時觀察SCT處理前后對大鼠血漿中TNF-α，IL-6和IL-10水平的影響。

野黃芩素； 急性肺損傷； 血紅素氧合酶1

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是急診科最常見的危重病之一，其病理學上主要表現(xiàn)為肺泡毛細血管廣泛損傷，導致炎癥相關因子、蛋白酶和活性氧類過度釋放，并引起肺水腫、缺氧和纖維蛋白沉積[1]。ALI發(fā)生的過程中，多種細胞因子與炎癥相關介質參與了本病的發(fā)生與發(fā)展過程，如TNF-α、IL-1和IL-6，高遷移率蛋白(high-mobility mobility group box,HMGB)1、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,iNOS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)等[2]。盡管目前對ALI的治療方法有了較大的提高，但其死亡率依然可高達30%以上。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是催化血紅素分解為Fe2+，膽綠素和CO的限速酶。研究表明，HO-1及其代謝產(chǎn)物對中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞介導的炎癥反應具有一定的抑制作用[3]。體外研究也表明，ALI大鼠給予藥物誘導HO-1表達后，可顯著降低其死亡率。這表明HO-1 對ALI的炎癥反應與氧化應激具有一定的負向調控作用[4]。野黃芩素(Scutellarein，SCT)是從黃芩中分離出的一種黃酮類化合物單體。體外研究表明，SCT具有一定的抗炎與抗氧化活性，并能抑制核轉錄因子NF-κB的激活[5-6]。但SCT對ALI是否也具有保護作用目前仍不明確。本研究旨在探究LPS誘導的ALI動物模型中，SCT能否影響HO-1的表達，并觀察其與細胞因子分泌的關系。

1 材料與方法

1.1主要試劑與材料野黃芩素(SCT，純度98%)，錫原卟啉(SnPP，純度98%)購自Sigma-Aldrich。抗HO-1多克隆抗體、抗Nrf2多克隆抗體、抗鼠β-actin以及抗TATA盒結合蛋白(TBP)多克隆抗體購自Santa Cruz?？筽85α磷酸化和抗總p85α抗體購自Cell Signaling。HRP標記IgG抗體購自Abcam。Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自Bio-Rad。TNF-α，IL-6和IL-10 ELISA檢測試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑購自Roche；cDNA逆轉錄試劑盒購自Applied Biosystems，RNA提取試劑盒購自GIBCO。細胞蛋白提取試劑盒購自Thermo。雄性8～10周齡SPF級Wistar大鼠(動物許可證號：SCXK(湘)2015-0001，體重260～290 g)購自南華大學實驗動物中心。

1.2 ALI模型的建立與實驗分組60只Wistar大鼠于(23±1)℃、(55±5)%濕度環(huán)境下給予正常飼料喂養(yǎng)。本研究符合本校實驗動物倫理委員會批準。大鼠采用1.5 g/kg的烏拉坦腹腔內注射麻醉后，參照參考文獻提供的方法建立體外ALI模型[7]，并根據(jù)不同的實驗目的分為6組(對照組、LPS組、0.1、0.5、1.0 mmol/kg不同濃度SCT干預組、SnPP干預組)，每組10只大鼠。對照組：大鼠頸靜脈滴注9 mL生理鹽水，該過程持續(xù)4 h，并在滴注生理鹽水1 h后再經(jīng)股靜脈注入2 mL林格氏液。LPS組：將LPS(30 mg/kg)溶解于9 mL生理鹽水中，頸靜脈滴入大鼠。在滴注LPS 1h后，大鼠同時給予2 mL林格氏液。4 h后用于下一步研究。SCT干預組： LPS建模開始1 h后，同時滴入不同濃度SCT(0.1，0.5和1.0 mmol/kg，用林格氏液溶解)[8]。 SnPP干預組：在LPS滴入前6 h腹腔注射30 mg/kg SnPP，其他同SCT干預組。

1.3實時定量PCR檢測HO-1 mRNA表達用Trizol試劑提取大鼠肺組織總RNA并測量其濃度。取2 μg RNA將其逆轉錄為cDNA。設計并合成HO-1與β-actin引物，其中HO-1引物序列分別為：5′-CGTGCAGAGAATTCTGAGTTC -3′(正向)和5′-AGACGCTTTACGTAGTGCTG -3′(反向)；β-actin：5′-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3′(正向)和5′-CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3′。將上述cDNA產(chǎn)物置于實時定量PCR儀器上(Roche,LightCycle 480)，設置反應條件： 95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 10 s、61 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，共35個循環(huán)。通過比較HO-1和β-actin的Ct值，計算其相對倍數(shù)表示(2-ΔΔCt)。

1.4 Western blot檢測蛋白表達與激酶磷酸化將肺組織中加入含蛋白酶抑制劑的Cocktails并制成勻漿，隨后加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液充分裂解。胞漿和核蛋白提取試劑盒嚴格根據(jù)廠家說明書進行。將分別獲得的總蛋白用于檢測HO-1表達或PI3K磷酸化，核蛋白用于Nrf2核轉位分析?？偟鞍谆蚝说鞍子肂radford法于595 nm波長處測定其濃度后，取20 μg蛋白用于12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)。隨后將蛋白凝膠轉至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。隨后分別孵育一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗，ECL發(fā)光、顯影。

1.5 HO-1酶活性測定將大鼠肺組織制成勻漿，離心獲取上清用于HO-1酶活性分析。取400 μL上清建立反應體系(0.8 mmol/L NADPH、2 mmol/L葡糖糖-6-磷酸鹽、0.2 U葡糖糖6磷酸鹽-1脫氫酶、2 mg大鼠肝臟胞漿、100 mmol/L PBS以及10 μmol/L氯化血紅素)。37 ℃避光孵育1 h，以生成的膽紅素量表示HO-1活性，單位為nmol/(mg protein·h)。最后加入1 mL氯仿終止反應。在酶標儀(imark,Bio-Rad)上設置雙波長(463 nm和530 nm)測吸各反應管的吸光度，結果以相對值表示(待測組/對照組)。

1.6細胞因子測定大鼠處理結束后獲取其血清，采用雙抗體夾心ELISA法測定TNF-α，IL-6和IL-10濃度。根據(jù)試劑盒提供的操作步驟，在包被有相應細胞因子抗體的微孔板中加入100 μL待測血清，37 ℃孵育2 h。經(jīng)洗滌后，按照試劑盒的步驟分別加入一抗、二抗孵育。顯色后，測定450 nm處的吸光度值，并根據(jù)標準曲線計算TNF-α，IL-6和IL-10的濃度。

1.7病理組織學分析肺組織用10%福爾馬林固定，用石蠟包埋后制備成厚度為4 μm的切片后用蘇木精和曙紅染色，并根據(jù)組織水腫和中性粒細胞滲出對肺組織的病理損傷進行評分(損傷程度分為0～3級)，最終分數(shù)為水腫和滲出評分之和[7]。

1.8統(tǒng)計學分析所有計量資料以均數(shù)±標準差表示，并使用GraphPad Prizm 6.0統(tǒng)計軟件(San Diego,CA)分析數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SCT促進ALI大鼠肺組織中HO-1 mRNA和HO-1蛋白表達與對照組相比，大鼠注射LPS后肺HO-1 mRNA表達有輕度增高。而給予1.0 mmol/kg SCT處理后HO-1 mRNA表達水平顯著上調(P<0.05，圖1A)，HO-1蛋白表達與qPCR結果類似(圖1B)。

2.2 SCT上調ALI大鼠肺組織中HO-1的酶活性

模型組大鼠肺組織中HO-1酶活性輕微增高。給予0.1～1.0 mmol/kg SCT處理后，大鼠肺組織中HO-1酶活性隨SCT濃度的遞增逐漸增強。其中給予1.0 mmol/kg SCT處理后，HO-1的酶活性是模型組的2.2倍(圖2)。

2.3 SCT誘導ALI大鼠肺組織中PI3K磷酸化的影響未處理組大鼠肺組織中PI3K亞基p85α磷酸化水平較低。用不同濃度SCT干預后，能有效上調磷酸化p85α的水平。在所有處理組中，總p85α水平保持恒定(圖3)。

圖1 SCT對肺HO-1 mRNA和HO-1蛋白表達的影響 A：SCT誘導ALI大鼠表達HO-1 mRNA.與LPS陰性對照組相比，*P<0.05；與0.1和0.5 mmol/kg SCT比較，#P<0.05；B：SCT誘導肺組織HO-1蛋白表達

圖2 SCT上調ALI大鼠肺組織中HO-1酶活性 與LPS陰性對照組相比，*P<0.05；與0.1和0.5 mmol/kg SCT比較，#P<0.05

圖3 SCT對肺組織中PI3K磷酸化的影響 與LPS陰性對照組相比，*P<0.05；與0.1和0.5 mmol/kg SCT比較，#P<0.05

2.4 SCT誘導核轉錄因子Nrf2核轉位與正常對照組相比，ALI模型組大鼠肺組織內細胞核中Nrf2表達水平僅輕微增高。經(jīng)SCT處理后，細胞核中Nrf2水平明顯增多，而胞漿中的Nrf2含量隨之減少，表明SCT能誘導Nrf2從細胞漿轉移至細胞核中(圖4)。

圖4 CPC對肺組織中Nrf2核轉位的影響 與對照組相比，*P<0.05

2.5 SCT對血漿TNF-α，IL-6和IL-10水平的影響

ELISA結果顯示，對照組大鼠血漿中TNF-α，IL-6和IL-10濃度較低。給予LPS注射后，其含量顯著增高。同時給予不同濃度的SCT處理后，TNF-α和IL-6有所降低，而IL-10明顯增高。若給予HO-1抑制劑SnPP處理后，可在一定程度上消除SCT對細胞因子的影響，見表1。

表1不同濃度LE對ALI大鼠血漿細胞因子水平的影響(n=8)

TNF?α(ng/mL)IL?6(ng/mL)IL?10(pg/mL)對照組31．5±11．715．5±8．122．3±5．2LPS858．4±51．3a106．6±12．8a486．8±26．4aSCT 0．1mmol/kg858．4±51．396．5±9．7902．4±44．2bc 0．5mmol/kg476．2±18．2bc62．5±10．7b752．6±36．2bc 1．0mmol/kg465．6±29．4bc45．3±8．2bc978．5±25．6bcSnPP+SCT(1．0mmol/kg)785．4±33．6b78．1±6．5b589．1±37．5b

與對照組相比，a：P<0.05；與LPS組相比，b：P<0.05；與SnPP+ SCT相比，c：P<0.05

2.6 SCT對肺組織病理變化的影響LPS所致的ALI以水腫和炎性細胞浸潤為主要特征。光學顯微鏡結果表明，肺臟正常組織學評分為1。注射LPS后不僅引起肺泡間質彌漫性水腫，同時引起肺泡含氣空間明顯減少，其組織學評分為5。1.0 mmol/kg SCT處理LPS大鼠后，肺組織學評分降低至3分(圖5)。

圖5 SCT對肺組織病理變化的影響(200×)

3 討 論

SCT是從唇形科黃芩屬和菊科飛蓬屬植物中分離出的一種黃酮類成分，藥理學研究表明，它具有擴張血管、抗血小板以及抗氧化應激損傷等效應[5]。本研究采用不同濃度SCT處理ALI大鼠后，發(fā)現(xiàn)它能降低ALI大鼠血漿中TNF-α和IL-6的濃度。IL-6是一種促炎細胞因子，它在啟動炎癥反應和休克早期高凝狀態(tài)發(fā)揮至關重要作用。在ALI發(fā)生的過程中，肺組織水腫和炎性細胞浸潤是其主要特征，本研究也發(fā)現(xiàn)SCT處理后，可顯著減輕肺泡間質彌漫性水腫程度，增加病理學評分，這表明SCT能有效改善ALI大鼠的局部炎癥反應程度。本研究同時也發(fā)現(xiàn)SCT能增加IL-10的水平。IL-10對炎癥具有抑制作用，它能負向調控微生物所致的感染性休克[9-10]。IL-10的另一個重要生物學作用是能上調HO-1的表達。本研究也發(fā)現(xiàn)，SCT處理后，不但能上調其mRNA和蛋白表達水平，也能提高其酶活性。HO-1主要是通過其代謝產(chǎn)物來發(fā)揮作用。CO和膽綠素不僅可抑制巨噬細胞中iNOS的轉錄表達和TNF-α生成，同時也能增加抗炎性細胞因子IL-10的表達，形成正反饋而調控炎癥反應。如有研究顯示給予HO-1誘導劑CoPP能明顯抑制TNF-α和HMGB1的表達，從而緩解LPS所致ALI的病情[11]。此外，HO-1缺陷型小鼠IL-10水平降低，但IL-6產(chǎn)生增加，并且對內毒素的敏感大大增強[12]。這些結果證明HO-1能負向調節(jié)IL-6、正向調節(jié)IL-10的分泌，從而減少內毒素所致器官損傷。本研究也證實，SCT處理后，大鼠肺組織中HO-1的表達水平明顯增高，而采用其抑制劑SnPP處理后，可明顯消除SCT對TNF-α和IL-6分泌的抑制作用，這表明SCT最終可能通過上調HO-1的表達而參與其對ALI的保護作用。

HO-1受多重機制調控，包括絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C、活性氧、PI3K和核轉錄因子Nrf2等[13-14]。PI3K是由p85、p55和p110等亞基組成的一種復合體。其中p85α亞基為調節(jié)亞基，其磷酸化后可激活下游蛋白激酶B(即Akt)而發(fā)揮多種生物學效應。本研究證實SCT處理后能明顯誘導p85磷酸化，表明SCT能激活PI3K?；罨腜I3K的另一作用就是激活核轉錄因子Nrf2。細胞在靜息條件下，Nrf2與其抑制因子keap1結合并定位于細胞漿內。多種外源性刺激可誘導keap1降解，Nrf2隨之轉位至細胞核內，并能與HO-1的啟動子上游結合而誘導其表達[15-17]。本研究也證實SCT處理可誘導Nrf2核轉位，與肺組織中HO-1蛋白表達的趨勢一致，這表明Nrf2的激活是誘導HO-1表達的機制。總之，本研究證實SCT能有效改善LPS所致的ALI，其細胞保護作用可能歸因于其影響細胞因子的分泌，并激活PI3K/Nrf2通路并誘導HO-1表達有關。

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ScutellareinReducesLPS-inducedAcuteLungInjuryviaRegulationofPI3K/Nrf2/HO-1inEndotoxemicRats

WANG Biao,YUAN Na,ZHANG Yonghu,et al
(DepartmentofEmergency，theSecondAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China))

ObjectiveTo observe the molecular mechanism of Scutellarein-induced heme oxygenase 1 (HO-1) expression in endotoxemic acute lung injury rat.MethodsRats were administered LPS (30 mg/kg) by intravenous infusion to induce ALI.Scutellarein (0.1,0.5 and 1.0 mmol/kg) was given 1 h after LPS initiation.Expression of HO-1 mRNA and protein in lungs were detected by real time PCR and Western blot,respectively.The enzymic activity of HO-1 was detected by colorimetric method;The tissue injury was analyzed by histopathology.Phosphorylation of PI3K and nuclear translocation of Nrf2 were measured by Western blot.The content of TNF-α,IL-6 and IL-10 were measured by ELISA in serum.ResultsLPS caused a slight HO-1 induction both at the mRNA and protein level,whereas administration of Scutellarein significantly induced higher HO-1 expression and enzymic activity,as compared with the LPS group.In addition,Scutellarein could also induce PI3K phosphorylation and Nrf2 nuclear translocation.Furthermore,0.5 and 1.0 mmol/kg of Scutellarein could attenuate plasma levels of TNF-α and IL-6,and further increased IL-10 levels compared with the LPS group.However,the beneficial effects of Scutellarein on cytokines expression were reversed by HO-1 inhibitor SnPP.ConclusionsScutellarein induces acute lung injury of endotoxemic rat expression of heme oxygenase-1 by activation of PI3K/Nrf2 pathway.

Scutellarein; acute lung injury; hemeoxygenase-1

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.012

2016-03-28；

2016-06-27

*通訊作者，E-mail：359503318@qq.com.

結果LPS注射后肺組織中HO-1 mRNA和蛋白表達水平有所增加，而SCT處理后能進一步上調HO-1表達水平，并能增強其酶活性。同時，SCT也可促進PI3K磷酸化，并能誘導轉錄因子Nrf2核轉位。此外，0.5和1.0 mmol/kg的SCT能減少大鼠血漿中TNF-α和IL-6含量，并能進一步增加IL-10水平。HO-1抑制劑SnPP處理后可消除SCT對細胞因子的影響。結論SCT可能通過激活PI3K/Nrf2誘導HO-1表達來減輕LPS所致炎癥反應。

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蔣湘蓮)