PFOS致SH-SY5Y細胞凋亡及可能機制

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(1.南華大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境醫(yī)學與放射衛(wèi)生研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學后勤服務中心醫(yī)務所)

·基礎醫(yī)學·

PFOS致SH-SY5Y細胞凋亡及可能機制

全小青1,2，李武1，曾懷才2*

(1.南華大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境醫(yī)學與放射衛(wèi)生研究所，湖南 衡陽 421001；2.南華大學后勤服務中心醫(yī)務所)

目的探討全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)對成人神經母瘤細胞(SH-SY5Y)的凋亡效應及可能的機制。

全氟辛烷磺酸鉀鹽； 成人神經母瘤細胞； 氧化應激； 凋亡

全氟辛烷磺酸鹽(Perfluorooctane Sulfonates，PFOS)是近十年出現(xiàn)具有環(huán)境持久性有機污染物，因其疏水疏油的特殊性質而被廣泛的應用于工業(yè)、農業(yè)和日常生活的各種材料如潤濕劑、抗腐蝕制劑、泡沫滅火劑以及皮革、造紙、服裝等產品中[1-2]。研究表明PFOS不但存在于水體、空氣、食品和乳汁等多種環(huán)境介質中，而且也存在于野生動物和人體內[3-4]。PFOS在職業(yè)暴露人群和非職業(yè)人群血液中的平均含量分別是33.46 ng/mL和34.16 ng/mL[5]。由于PFOS在人體通過與血清白蛋白牢固結合并且半衰期長達5.4年[6]，遠大于PFOS在大鼠體內的半衰期(100天)[7]，所以其對人體的健康效應備受關注。研究報道PFOS能夠通過血腦屏障[8]和胎盤屏障[9]，故發(fā)育中的神經系統(tǒng)容易受到PFOS暴露。PFOS在人體內主要蓄積在肝臟、血液和大腦，并且在大腦中的蓄積濃度也可達到血液中PFOS濃度的32%[10]，因此，關于PFOS的神經系統(tǒng)毒性備受關注。

Johansson 等[11]用PFOS處理10天齡新生小鼠后，成年小鼠的認知和行為功能受到了影響，說明PFOS 致新生小鼠學習記憶行為的損傷具有持續(xù)性。Chang和王玉等[10,12]報道，產前和泌乳期暴露PFOS 導致了子代大鼠的運動增加和認知功能的損傷?？傊?，PFOS能導致實驗動物活動增加、記憶功能和認知能力損傷等神經毒性。但是目前對PFOS引起神經毒性的潛在機制尚不清楚。本研究用PFOS處理SH-SY5Y細胞后檢測氧化應激損傷相關指標變化來探討其可能的神經毒性機制。

1 材料與方法

1.1材料人源神經母瘤細胞(SH-SY5Y)購自中國科學院上海細胞庫。PFOS購自美國Sigma公司，溶于二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)中，配置成200 mmol/L的儲存液，再用DMSO分別稀釋成150、100、50、10、1 mmol/L儲存液。實驗中PFOS劑量設置為200、150、100、50、10、1 μmol/L和DMSO(對照組)。

1.2細胞培養(yǎng)和染毒SH-SY5Y細胞生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(內含終濃度為100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素)，于37 ℃恒溫、CO2濃度為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞處于對數(shù)生長期并生長至60%融合度時，開始染毒。染毒時間為24 h和48 h。

1.3主要儀器與試劑細胞培養(yǎng)箱，熒光倒置顯微鏡，ELX-800酶標儀，CCK8細胞活性檢測試劑，AV-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒，總谷胱甘肽檢測試劑盒，脂質氧化產物(Malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒，總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)，活性氧檢測試劑盒。

1.4細胞活性檢測和細胞凋亡檢測細胞活性檢測：細胞活性檢測采用CCK8法。將SH-SY5Y細胞接種于96孔板，每組設5個復孔，接種密度為5.0×103個/孔，經培養(yǎng)、染毒等步驟后，酶標儀450 nm波長處檢測吸光度值，細胞活性計算公式為：細胞活性(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(對照)-A(空白)]×100%；A(加藥)：具有細胞、CCK8溶液和毒物溶液的孔的吸光度；A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A(對照)：具有細胞、CCK8溶液而沒有毒物溶液的孔的吸光度。細胞凋亡檢測：將SH-SY5Y細胞接種于6孔板，接種密度為2×104個/mL，待細胞貼壁并長至50%融合度時開始染毒，染毒48 h后，1×PBS洗滌2～3遍，用0.25%胰蛋白酶消化1～2 min(消化時間不要過長，以免引起假陽性)，用無血清培養(yǎng)基吹打至懸液，室溫離心收集細胞，用PBS洗滌細胞兩次，按照凋亡試劑盒說明書進行操作。將細胞重懸Binding Buffer 500 μL，加入5 μL AV-FITC 混勻后再加入5 μL碘化丙啶(PI)，輕輕混勻，溫室避光反應10 min，在1 h內經流式細胞儀器檢測。

1.5氧化應激相關指標檢測細胞總活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、總超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和細胞中總谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量的測定嚴格按照試劑盒說明書提供的操作步驟進行測定。

2 結 果

2.1 PFOS暴露對SH-SY5Y細胞活性和細胞形態(tài)的影響SH-SY5Y細胞暴露于不同的PFOS劑量組和DMSO(對照組)24 h和48 h后，相對于對照組，SH-SY5Y細胞分別在50 μmol/L和10 μmol/L劑量組出現(xiàn)細胞活性顯著降低(圖1A)；同時將PFOS處理時間和PFOS處理濃度對SH-SY5Y細胞活性的影響進行雙因素方差分析，發(fā)現(xiàn)PFOS處理濃度(F=10.69,P<0.05)和PFOS處理時間(F=6.96,P<0.05)都能顯著降低了SH-SY5Y細胞活性，且差異具有統(tǒng)計學意義。由于SH-SY5Y細胞倍增時間為48 h，故余下實驗中均用48 h作為處理時間點。

PFOS處理SH-SY5Y細胞48 h后，在10 μmol/L劑量組時，SH-SY5Y細胞形態(tài)和對照組尚無區(qū)別，然而隨著PFOS劑量增加至50 μmol/L時，SH-SY5Y細胞胞體萎縮、細胞輪廓模糊、神經突起逐漸減少并且不規(guī)則形態(tài)細胞和漂浮在培養(yǎng)基中的死亡細胞逐漸增多，見圖1B。由于SH-SY5Y在PFOS劑量為100 μmol/L時細胞活性已經低于60%，故余下實驗用100 μmol/L作為余下實驗的PFOS最高劑量組。

圖1 PFOS暴露對SH-SY5Y細胞活性和細胞形態(tài)的影響 A：不同濃度PFOS暴露24h和48h對SH-SY5Y細胞活性的影響.與對照組比較，*:P<0.05；B：不同濃度PFOS暴露48 h對SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響

2.2 PFOS對SH-SY5Y細胞凋亡的影響PFOS處理SH-SY5Y細胞48 h后用Annexin-V FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測，結果顯示PFOS處理明顯的誘導SH-SY5Y細胞發(fā)生了凋亡，并且隨著染毒劑量的上升，發(fā)生凋亡的細胞比例越來越大(圖2A)。對流式結果進一步比較分析發(fā)現(xiàn)，在低濃度10 μmol/L的PFOS處理時，SH-SY5Y細胞凋亡即有增加，隨著PFOS染毒濃度逐漸增加，SH-SY5Y細胞發(fā)生凋亡逐漸增多，特別在高濃度時(50 μmol/L和100 μmol/L)，細胞凋亡更為明顯，見圖2B，PFOS主要引起SH-SY5Y細胞發(fā)生晚期凋亡為主，而早期凋亡細胞比例并沒有發(fā)生明顯變化，并且隨著染毒劑量的增加，PFOS引起SH-SY5Y細胞發(fā)生壞死的比例也逐漸增加。

圖2 PFOS暴露對SH-SY5Y細胞的凋亡影響 A：流式細胞儀檢測圖，a：對照組，b：PFOS 10 μmol/L組，c：PFOS 50 μmol/L組，d：PFOS 100 μmol/L組；B：不同狀態(tài)細胞的分布情況，a：晚期凋亡細胞；b：早期凋亡細胞；c：壞死細胞；d：正常細胞

2.3 PFOS對SH-SY5Y細胞中氧化應激指標變化的影響

2.3.1 PFOS對GSH、SOD和MDA含量的影響 用濃度為0、10、50、100、150、200 μmol/L PFOS作用SH-SY5Y細胞48 h后，分別采用顯色法、WST-8法、比色法對SH-SY5Y細胞中的總谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量進行檢測；結果顯示：隨著PFOS染毒劑量的逐漸增加，SH-SY5Y細胞中的SOD和GSH水平逐漸降低，而SH-SY5Y細胞中的MDA水平隨著PFOS染毒劑量的增加而顯著升高，說明PFOS降低了SH-SY5Y細胞中的抗氧化物質(GSH和SOD)的含量，升高了SH-SY5Y細胞中氧化物質(MDA)的含量，因此PFOS對SH-SY5Y細胞產生了氧化損傷(見表1)。

表1PFOS暴露對SH-SY5Y細胞SOD、MDA和GSH蛋白含量的影響(n=3)

PFOS(μmol/L)SOD(U/g)GSH(nmol/mg)MDA(nmol/mg)08．50±0．848．00±0．121．92±0．17104．67±0．72a7．45±0．21a2．19±0．06504．28±0．49a6．95±0．37a2．18±0．17a1003．79±0．50a7．00±0．19a3．13±0．10a1503．50±1．02a6．56±0．29a3．41±0．12a2001．19±0．63a5．89±0．90a6．95±0．26a

與對照組0 μmol/L PFOS組相比，a：P<0.05

2.3.2 PFOS對SH-SY5Y細胞ROS含量的影響 用濃度為0、10、50、100、150、200 μmol/L PFOS作用SH-SY5Y細胞48 h后，采用DCFH-DA熒光探針法對SH-SY5Y細胞中總活性氧(ROS)進行檢測；實驗結果顯示：與對照組相比，隨著PFOS染毒劑量的逐漸增加，SH-SY5Y細胞中ROS水平逐漸升高，活性氧產生的熒光值從對照組的141.8±12.9上升至最高劑量組的643.9±20.5，兩者的差異具有統(tǒng)計學意義；說明PFOS顯著促進了SH-SY5Y細胞中活性氧的產生(見表2)。

表2PFOS暴露對SH-SY5Y細胞ROS含量的影響(n=3)

PFOS(μmol/L)ROS(熒光強度)0141．8±12．910182．1±19．950213．1±6．4a100240．9±11．1a150290．7±29．2a200643．9±20．5a

與對照組0 μmol/L PFOS組相比，a：P<0.05

3 討 論

人類在日常生產生活中都會接觸到PFOS；因其在生物體內不易發(fā)生代謝降解故具有明顯的生物蓄積性。由于大腦、血液和肝臟作為PFOS在哺乳動物體內蓄積的三大蓄積器官，所以PFOS對神經系統(tǒng)的毒性作用一直受到廣泛關注。王玉等[12]發(fā)現(xiàn)通過飲水使妊娠大鼠接觸PFOS，觀察發(fā)現(xiàn)仔鼠學習記憶能力隨著PFOS染毒濃度的增加而下降，且胚胎期染毒PFOS對新生小鼠的學習能力影響更加明顯。Zeng等[13]的研究發(fā)現(xiàn)孕期雌鼠進行0.1、0.6和2.0 mg/kg PFOS暴露即可誘導仔鼠海馬和皮層的膠質纖維酸性蛋白和酸性鈣結合蛋白S100B的表達[13]。一項流行病學研究發(fā)現(xiàn)孕期PFOS暴露將會影響神經發(fā)育，特別是對2周歲時的運動行為發(fā)育[14]。本研究以SH-SY5Y為體外受試對象，經不同濃度的PFOS處理后檢測SH-SY5Y細胞活性、凋亡效應和氧化應激相關指標的水平變化。

本文結果發(fā)現(xiàn)PFOS顯著的降低了細胞活性，呈明顯時間劑量效應關系，并隨著染毒劑量的逐漸增加細胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則，神經突起逐漸消失等形態(tài)變化。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)PFOS引起了細胞發(fā)生凋亡，細胞凋亡以晚期凋亡為主。說明PFOS對SH-SY5Y細胞產生體外毒性，并引起SH-SY5Y細胞發(fā)生凋亡和壞死。

過去對PFOS神經毒性機制研究主要集中在PFOS對神經元Ca2+穩(wěn)態(tài)、神經遞質、甲狀腺激素和神經元miRNA水平的影響[15-16]。大量研究發(fā)現(xiàn)氧化應激也廣泛地參與了外源性化合物引起的神經毒性效應。例如銀納米顆粒和金屬鉛離子導致的神經毒性都與氧化應激有關[17-18]。而氧化應激指標主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、還原性谷胱甘肽(GSH)、活性氧族(ROS)和丙二醛(MDA)，其中GSH通過谷胱甘肽過氧化物酶的催化作用以清除ROS，SOD是清除體內自由基的首要物質；而MDA是指不飽和脂肪酸過氧化產物，其含量的多少可反映氧化應激損傷的程度。

在本研究中，與對照組相比，PFOS處理SH-SY5Y細胞48 h后引起全部實驗組SH-SY5Y細胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽還原酶(GSH)水平顯著性下降；同時10 μmol/L以上劑量PFOS染毒引起SH-SY5Y細胞總活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平顯著性上升。本實驗中PFOS引起細胞中抗氧化物質SOD和GSH含量的減少可降低細胞的抗氧化能力和自我保護能力；而PFOS引起SH-SY5Y細胞中的ROS水平的上升將會加重細胞的氧化應激損傷。另外，PFOS還引起了細胞中脂質過氧化產物MDA含量的上升，這可能是抗氧化物質減少和活性氧大量產生繼而產生氧化損傷的后果。PFOS暴露對SH-SY5Y細胞產生了嚴重的氧化應激損傷，并且PFOS也正可能通過產生氧化應激損傷進而對SH-SY5Y細胞產生毒性和促進細胞發(fā)生凋亡。

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TheStudyofSH-SY5YCellsApoptosisInducedbyPFOSandItsMechanism

QUAN Xiaoqin，LI Wu，ZENG Huaicai
(InstituteofEnvironmentalMedicineandRadiationHealth,SchoolofPublicHealth,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveExplore the apoptosis effects of PFOS on SH-SY5Y cells and its mechanism.MethodsThe experiment was divided into seven groups,the control (DMSO) and the PFOS groups (1,10,50,100,150,200 μmol/L).The cell viability and time-efficiency of SH-SY5Y were determined by CCK8,the apoptosis rate were detected by Annexin-V FITC/PI double-staining,respectively.The effects of PFOS on oxidative stress damage in SH-SY5Y cells were detected by UV spectrophotometry and fluorescence methods.ResultsPFOS treatment significantly decreased SH-SY5Y cell viability in a dose dependent manner.The apoptosis effects were observed in SH-SY5Y cells obviously after PFOS exposure 48 h;The results of UV and fluorescence spectrophotometry showed that PFOS induced SH-SY5Y cell superoxide dismutase (SOD) and glutathione reductase (GSH) decreased,compared with the control,and the highest group of PFOS decreased GSH from 8±0.12 nmol/mg protein to 5.89±0.9 nmol/mg protein.While the total reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) levels increased,compared with the control,the highest group of PFOS elevated MDA from 1.92±0.17 nmol/mg protein to 6.95±0.26 nmol/mg protein.ConclusionPFOS produced oxidative stress damage in SH-SY5Y cells,which may be the mechanisms of neurotoxicity induced by PFOS.

PFOS; SH-SY5Y cells; oxidative stress; apoptosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.009

2016-03-03；

2016-06-28

國家自然科學基金(81273026)，湖南省衛(wèi)生廳(B2011-044)，衡陽市科技局(2011KS9).

*通訊作者，E-mail：zenghuaicai@126.com

方法實驗中PFOS劑量設置為200、150、100、50、10、1 μmol/L和DMSO(對照組)。體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，以不同濃度PFOS(1、10、50、100、150、200 μmol/L)處理細胞。染毒24 h和48 h后用CCK8法檢測SH-SY5Y細胞活性，應用Annexin-V FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測細胞凋亡，紫外和熒光分光光度法檢測SH-SY5Y細胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GSH)、總活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的影響。結果PFOS暴露降低了SH-SY5Y細胞活性，并呈明顯的劑量效應關系；PFOS導致SH-SY5Y細胞凋亡；紫外和熒光分光光度法結果顯示PFOS引起SH-SY5Y細胞中SOD和GSH水平下降，與對照組相比，最高劑量組PFOS引起GSH含量從8.00±0.12 nmol/mg蛋白降至5.89±0.90 nmol/mg蛋白；同時引起總活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平上升，與對照組相比，最高劑量組PFOS引起MDA含量從1.92±0.17 nmol/mg蛋白顯著上升至6.95±0.26 nmol/mg蛋白。結論PFOS可能通過對SH-SY5Y細胞產生氧化應激損傷從而對SH-SY5Y細胞產生毒性效應。

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