微生物藥物靶標(biāo)

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所；湖南省特殊病原體防控重點實驗室；湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 衡陽 421001)

·專家論壇·

微生物藥物靶標(biāo)

吳移謀

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所；湖南省特殊病原體防控重點實驗室；湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 衡陽 421001)

微生物； 藥物； 作用靶標(biāo)

微生物耐藥性問題日益嚴(yán)重，很多病原微生物，例如結(jié)核分枝桿菌和惡性瘧原蟲等對人類生命健康造成了極大的威脅，開發(fā)新的抗菌藥物迫在眉睫。微生物作為抗生素的重要來源，在發(fā)掘抗耐藥菌新型抗生素的研究中承擔(dān)了重要角色，許多微生物來源的天然化合物展現(xiàn)了顯著的抗耐藥菌活性。而大量病原微生物基因組的測序完成，又為尋找針對病原微生物的分子藥物靶標(biāo)提供了有利條件。

1 微生物候選藥物靶標(biāo)的選擇

候選藥物靶點(標(biāo))的條件之一是微生物生存或致病所必需。目前微生物的毒力因子和保守基因為主要的藥物靶標(biāo)。細菌毒力因子包括黏附素，侵襲素，內(nèi)、外毒素以及細菌超抗原與革蘭氏陰性(G-)菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)等。

1.1微生物生存相關(guān)的藥物靶標(biāo)目前臨床應(yīng)用的抗生素主要包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、磺胺類等，其作用機制主要包括抑制細菌細胞壁合成和損傷細胞膜功能、影響蛋白質(zhì)合成、抑制核酸合成等過程，這些抗生素的作用點都是細菌生存所必需。

廣譜抗生素的作用靶點為多種細菌中保守的蛋白。在多個物種中高度保守的基因很可能就是生存必需的基因，可通過比較不同物種尤其是進化距離比較遠的物種之間尋找保守基因。

1.2微生物致病和毒力相關(guān)的藥物靶標(biāo)微生物致病和毒力相關(guān)的一些基因產(chǎn)物為微生物非必需，針對這些藥物靶點的藥物可降低微生物的致病力但并不能殺滅它們，例如，結(jié)核分枝桿菌fbpA和sapM基因雙敲除后，其毒力降低。將這兩個基因克隆后發(fā)現(xiàn)它們屬于結(jié)核分枝桿菌的非必需基因[1-2]。

另外，致病性G-菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)主要位于細菌致病島中，編碼其輸送系統(tǒng)的基因高度保守，編碼20多種基因產(chǎn)物。不同的病原菌之所以能夠產(chǎn)生不同的疾病和癥狀，可能是因為它們分泌不同的蛋白質(zhì)，作用于不同的宿主細胞和分子。耶爾森菌可分泌10多種效應(yīng)分子，并將它們分別注入宿主細胞，其中YopE和YopH可修飾巨噬細胞蛋白，破壞細胞的功能，使巨噬細胞不能夠吞噬和殺傷該菌；YopJ/P蛋白抑制MAPK和NF-κB信號通路，抑制促炎細胞因子和趨化因子(TNF-α、IL-8、IL-12和IL-18等)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細胞凋亡[3-4]。

1.3可作為藥物靶標(biāo)的其他分子其他一些分子也可成為潛在的藥物靶點，例如G-菌的外膜蛋白參與黏附侵襲、受體識別、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和防護等功能，在細菌生理活動中發(fā)揮重要作用。RNA分子也能作為藥物靶點，例如大環(huán)內(nèi)酯類藥物的作用靶標(biāo)為rRNA[5]。 氨基糖苷類，大環(huán)內(nèi)酯類，四環(huán)素類，氯霉素類等抗生素可作用于tRNA的前體、修飾及成熟等生物合成環(huán)節(jié)[6]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)細菌生物被膜(bacterial biofilm)可阻擋抗生素的滲入和機體免疫分子的殺傷作用；此外，生物被膜內(nèi)的細菌彼此間還可發(fā)生信號轉(zhuǎn)移、耐藥基因和毒力因子捕獲與轉(zhuǎn)移，也是抗細菌藥物的潛在靶標(biāo)[7]。

2 比較基因組學(xué)在尋找特異性藥物靶標(biāo)方面的特點與優(yōu)勢

比較基因組學(xué)是在基因組圖譜和測序的基礎(chǔ)上,利用某個基因組研究獲得的信息推測其他原核生物、真核生物類群中的基因數(shù)目、位置、功能、表達機制和物種進化的學(xué)科，從而獲得有關(guān)微生物物種進化與分類、相關(guān)毒力因子、藥物靶標(biāo)的信息，并將其及早應(yīng)用于預(yù)防診斷和治療微生物感染性疾病。比較基因組學(xué)通過對不同物種或者不同個體的基因組數(shù)據(jù)進行比較分析,揭示彼此間的相似性和差異性,以了解不同物種間或者不同種群間在功能上、進化上的特征。目前,超過39 000個基因組測序，大約3 000個微生物全基因組測序已經(jīng)完成，每年有500個新種被發(fā)現(xiàn)[8]。

綜合這些信息能夠為進一步探究病原菌的致病機制、生理生化特點、種群多態(tài)性和進化研究提供新的途徑。大約30%～40%藥物實驗的失敗是由于選擇的靶標(biāo)不合適。微生物中的必需基因很多(占10%～15%)，其中許多基因缺乏詳細注釋，給選擇優(yōu)化帶來困難。全基因組測序及生物信息技術(shù)應(yīng)用于微生物基因組信息的研究，為比較基因?qū)W研究提供有力支撐。因此，有必要通過比較基因組學(xué)，選出臨床上主要病原微生物的共有基因作為候選藥物靶標(biāo)，而且確保這些基因是人類基因組中沒有的，這是降低藥物毒性的關(guān)鍵[8-12]。表1列出目前基因組信息研究及生物信息方法相關(guān)數(shù)據(jù)庫。

表1微生物基因組信息研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫及生物信息方法

微生物信息工具或生物信息方法相關(guān)網(wǎng)址BLAST比對工具http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLSATBioEdit序列編輯與分析軟件http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.htmlMHOLline蛋白結(jié)構(gòu)與功能解析程序http://www.mholline.lncc.brClustalX多重序列比對程序http://www.clustal.orgPyMOL分子三維結(jié)構(gòu)顯示軟件http://www.pymol.orgNCBI比對軟件的單機版ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST已完成或進行的微生物基因組測序信息及工具ftp://occams.dfci.harvard.edu/pub/bio/tgi/data/ftp://occams.dfci.harvard.edu/pub/bio/tgi/software/蛋白質(zhì)同源基因族分析http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/蛋白抽提,闡明及分析工具,全基因組序列計算機分析http://pedant.gsf.de蛋白質(zhì)間相互作用數(shù)據(jù)http://mips.helmholtz-muenchen.de/proj/ppi/基因特征及功能分析,合成代謝途徑分析,比較基因組學(xué)http://www.kegg.jp所有大腸埃希菌基因的最新注釋,包括基因DNA序列;所有已知小分子 代謝途徑的闡述,包括其中的各部反應(yīng)及參與的酶http://www.ecocyc.org已經(jīng)測序微生物物種的基因組、蛋白、mRNA序列ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/

3 目前發(fā)現(xiàn)的新藥物靶標(biāo)

人類功能基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)等揭示了更多新型的藥物靶標(biāo)(1 500～4 000個)，這些也為揭示微生物產(chǎn)物更廣范圍的生物活性和為新型微生物藥物的大量研發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。由于大量耐藥菌的出現(xiàn)，尤其是多重及廣泛耐藥結(jié)核桿菌、耐藥革蘭氏陰性菌造成了抗菌藥物治療的嚴(yán)峻形勢，客觀上需要更新、更多的抗生素。資源微生物基因組學(xué)研究，揭示了微生物具有更大的合成天然產(chǎn)物的潛力，也成為研究的熱點之一。一般的放線菌基因組具有20～30個天然產(chǎn)物生物合成基因簇，一般的絲狀真菌基因組具有30～50個天然產(chǎn)物生物合成基因簇和復(fù)雜調(diào)控基因機制以及天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)后修飾酶。約有90%以上的微生物不能在常規(guī)條件下培養(yǎng)。極端環(huán)境(如海洋與植物內(nèi)生菌等特殊生境)中生存的微生物和新型次級代謝產(chǎn)物的大量獲得，為新型抗生素及微生物藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

3.1抗真菌藥物靶標(biāo)現(xiàn)有抗真菌藥物(氮唑類、多烯類、棘白菌素類和氟胞嘧啶類)普遍存在如抗菌譜窄、副作用大等局限性，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限。因此，研究與開發(fā)新型抗真菌藥物無疑將成為解決此類難題的重要希望[13]。

3.1.1 抑制真菌細胞壁合成的藥物 真菌細胞壁中，β-1，6-葡聚糖與幾丁質(zhì)通過β-1，3-葡聚糖還原末端連接形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，此外，某些β-1，6-葡聚糖也可直接與幾丁質(zhì)相連。細胞壁蛋白中，糖基磷脂酰肌醇(GPI) 錨定蛋白與內(nèi)部重復(fù)蛋白(Pir蛋白) 分別通過β-1，6-葡聚糖及β-1，3-葡聚糖共價連接于真菌細胞壁多糖骨架上。(1)以Gwt1p為靶標(biāo)的E1210：小分子化合物E1210通過抑制Gwt1p (GPI 錨定蛋白合成過程中參與肌醇?；磻?yīng)的酶) 活性，抑制GPI 錨定蛋白合成，進而減少GPI 錨定蛋白含量，抑制細胞壁甘露糖蛋白層對多糖骨架的附著，最終抑制真菌生長。(2)以Kre6p為靶標(biāo)的D11-2040：小分子化合物D11-2040可通過抑制β-1，6-葡聚糖合成酶Kre6p的活性，抑制β-1，6-葡聚糖合成，直接破壞真菌細胞壁結(jié)構(gòu)，降低真菌致病力。

3.1.2 抑制蛋白激酶或蛋白磷酸酶信號通路的藥物 真菌擁有類似哺乳動物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可通過抑制真菌蛋白激酶或蛋白磷酸酶信號通路的化合物抑制真菌生長。(1)以Pkh1/2激酶為靶標(biāo)的KP-372-1：抗癌化合物KP-372-1 (哺乳動物細胞PDK1/Akt 抑制劑) 可抑制真菌Pkh1/2 激酶活性，產(chǎn)生抗真菌作用。Pkh1/2 激酶被KP-372-1抑制后，真菌細胞壁損傷、CWI 信號通路阻斷，真菌死亡。(2)以Hsp90 為靶標(biāo)的17-AAG：抗腫瘤化合物17-AAG可抑制真菌Hsp90 活性。17-AAG 競爭性結(jié)合Hsp90N-末端ATP 結(jié)合位點，抑制Hsp90 的分子伴侶功能，阻斷真菌耐藥信號通路，產(chǎn)生抗真菌作用。

3.1.3 靶向真菌毒力因子的單克隆抗體 單克隆抗體C7 通過抑制Als3p活性產(chǎn)生抗白色念珠菌作用。與真菌黏附和毒力密切相關(guān)的一類細胞壁蛋白為Als蛋白。C7 可與真菌Als3p N端特異性結(jié)合，阻礙Als3p與鐵蛋白結(jié)合，進而抑制鐵離子的攝取，產(chǎn)生殺菌作用。

3.2抗細菌藥靶數(shù)以百計的細菌關(guān)鍵蛋白被確定為抗菌藥物的潛在靶標(biāo)，然而只有少數(shù)作為臨床藥物的有效靶標(biāo)。這些靶標(biāo)包括:青霉素結(jié)合蛋白，D-Ala-D-Ala 連接酶，MruA，十一異戊烯焦磷酸酶，細胞壁上的丙氨酸消旋酶，30S和50S核糖體蛋白，延伸因子G，參與蛋白質(zhì)合成的Ile-tRNA合成酶，參與RNA合成的RNA聚合酶，參與脂肪酸合成的InhA (FabI) ，參與DNA合成的DNA促旋酶和撲拓異構(gòu)酶IV，參與細胞代謝的二氫葉酸還原酶(FolA)和p-氨基苯甲酸合成酶。最近還有一些新的抗菌靶標(biāo)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如合成細菌活性關(guān)鍵物質(zhì)lipidA所必須的鋅依賴脫乙酰酶LpxC[14]，G+菌表面的蛋白質(zhì)錨定酶Sortase[15]等。

從微生物中發(fā)現(xiàn)的活性天然產(chǎn)物已達22 500種之多，應(yīng)用于臨床的微生物藥物有150余種。因此，從微生物中尋找藥物先導(dǎo)化合物是目前創(chuàng)新藥物研究最活躍的領(lǐng)域之一。抗耐藥菌活性天然產(chǎn)物可分為甾體和萜類、黃酮類和醌類化合物、生物堿類化合物、多肽類化合物、大環(huán)內(nèi)脂類化合物等[16]。另外，從海洋鏈霉菌新種星海鏈霉菌中分離出的新型亞砜類抗耐藥菌活性物質(zhì)星海霉素(Xinhaiamine)[17]；從源于南非納馬夸蘭土壤樣品的游動放線菌(Actinoplanes philippinensis) 菌株MA7347 中提取到新的噻唑肽苷化合物Philipimycin[18]；從海洋細菌Pseudoalteromonas phenolica O-BC30T中分離出MC21-A和MC21-B[19]。這些抗菌藥物均具有抗MRSA活性。

在過去50年中，從陸生放線菌中共收獲了100 000種化合物，其中70%為天然抗生素。放線菌仍是新活性物質(zhì)的最主要生產(chǎn)菌，在新抗生素開發(fā)中地位依然十分重要，但陸生菌來源的抗生素已不能滿足人類健康的需要。海洋微生物種類豐富，生存環(huán)境特殊，產(chǎn)生化合物種類繁多、結(jié)構(gòu)新穎，且開發(fā)程度尚低。因此，海洋微生物已成為人類尋找、開發(fā)新型抗生素的重點和熱點。

3.3抗病毒藥物靶標(biāo)病毒的復(fù)制周期分為吸附與穿入、脫殼、生物合成、裝配與釋放四個階段。抗病毒藥物阻斷其中任何一個環(huán)節(jié)，即可抑制病毒的增殖，控制感染的發(fā)生。目前的抗病毒藥物是針對病毒復(fù)制周期的不同環(huán)節(jié)而設(shè)計的，主要為化學(xué)合成藥物。目前其藥物作用靶點的研究主要集中在以流感病毒RNA聚合酶與核蛋白[20]，皰疹病毒衣殼的組裝與DNA的包裝[21]，HIV-1型衣殼[22]，丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白[23]，乙型肝炎病毒核心蛋白[24]等為靶點的抗病毒藥物篩選。甲型流感病毒的核蛋白高度保守，是一個潛在的抗病毒藥物的靶點。基于核蛋白的抗病毒靶點研究包括阻止病毒核蛋白的入核，從而抑制病毒的復(fù)制；誘導(dǎo)高階核蛋白寡聚體形成，阻止核蛋白入核，從而抑制病毒的復(fù)制；干擾核蛋白與RNA結(jié)合，抑制病毒的復(fù)制；干擾核蛋白與RNA依賴的RNA聚合酶結(jié)合，抑制病毒復(fù)制。

[1] Saikolappan S,Estrella J,Sasindran SJ,et al.The fbpA/sapM double knock out strain of Mycobacterium tuberculosis is highly attenuated and immunogenic in macrophages[J].PLoS One,2012,7(5):e36198.

[2] Armitige LY1,Jagannath C,Wanger AR,et al.Disruption of the genes encoding antigen 85A and antigen 85B of Mycobacterium tuberculosis H37Rv:effect on growth in culture and in macrophages[J].Infect Immun,2000,68(2):767-778.

[3] Bliska JB,Wang X,Viboud GI,et al.Modulation of innate immune responses by Yersinia type Ⅲ secretion system translocators and effectors[J].Cell Microbiol,2013,15(10):1622-1631

[4] Matsumoto H,Young GM.Translocated effectors of Yersinia[J].Curr Opin Microbiol,2009,12(1):94-100.

[5] Hong W,Zeng J,Xie J.Antibiotic drugs targeting bacterial RNAs[J].Acta Pharm Sin B,2014,4(4):258-265.

[6] Chopra S,Reader J.tRNAs as antibiotic targets[J].Int J Mol Sci,2014,16(1):321-49.

[7] De la Fuente-Núez C,Reffuveille F,Fernández L,et al.Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation:antibiotic resistance and new therapeutic strategies[J].Curr Opin Microbiol,2013,16(5):580-589.

[8] Punina NV,Makridakis NM,Remnev MA,et al.Whole-genome sequencing targets drug-resistant bacterial infections [J].Hum Genomics,2015,9:19.

[9] Chawley P,Samal HB,Prava J,et al.Comparative genomics study for identification of drug and vaccine targets in Vibrio cholerae:MurA ligase as a case study [J].Genomics,2014,103(1):83-93.

[10] 池水晶，寶福凱，柳愛華.結(jié)核分枝桿菌比較基因組研究進展[J].科學(xué)通報，2013,29(9):40-45.

[11] Butt AM,Nasrullah I,Tahir S,et al.Comparative genomics analysis of Mycobacterium ulcerans for the identification of putative essential genes and therapeutic candidates [J].PLoS One,2012,7(8):e43080.

[12] Malipatil V,Madagi S,Bhattacharjee B.Sexually transmitted diseases putative drug target database:a comprehensive database of putative drug targets of pathogens identified by comparative genomics [J].Indian J Pharmacol,2013,45(5):434-438.

[13] 黃鑫,劉穎,陳思敏,等.基于新靶點的抗真菌藥物研究進展[J].中國真菌學(xué)雜志,2015,10(3):175-181.

[14] Liang X,Lee CJ,Zhao J,et al.Synthesis,structure,and antibiotic activity of aryl-substituted LpxC inhibitors[J].J Med Chem,2013,56(17):6954-6966.

[15] Bradshaw WJ,Davies AH,Chambers CJ,et al.Molecular features of the sortase enzyme family[J].FEBS J,2015,282(11):2097-2114.

[16] 褚福鑫,白志強,朱紅惠.微生物中抗耐藥菌活性天然產(chǎn)物的研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2015,27(8):1466-1482.

[17] Jiao W,Zhang F,Zhao X,et al.A novel alkaloid from marine-derived actinomycete Streptomyces xinghaiensis with broad-spectrum antibacterial and cytotoxic activities[J].PLoS One,2013,8(10):e75994.

[18] Sunada A,Ikeda Y,Kondo S,et al.Acetylation of aminoglycoside antibiotics with 6′-methylamino group,istamycin B and micronomicin,by a novel aminoglycoside 6′-acetyltransferase of actinomycete origin[J].J Antibiot (Tokyo),2000,53(12):1416-1419.

[19] Zhang C,Occi J,Masurekar P,et al.Isolation,structure,and antibacterial activity of philipimycin,a thiazolyl peptide discovered from Actinoplanes philippinensis MA7347[J].J Am Chem Soc,2008,130(36):12102-12110.

[20] Chenavas S,Crépin T,Delmas B,et al.Influenza virus nucleoprotein:structure,RNA binding,oligomerization and antiviral drug target[J].Future Microbiol.2013,8(12):1537-1545.

[21] Baines JD.Herpes simplex virus capsid assembly and DNA packaging:a present and future antiviral drug target[J].Trends Microbiol，2011,19(12):606-613.

[22] Neira JL.Biophysical and structural studies on the capsid protein of the human immunodeficiency virus type 1:a new drug target？ [J].ScientificWorld Journal,2009,9:404-419.

[23] Frick DN.The hepatitis C virus NS3 protein:a model RNA helicase and potential drug target[J].Curr Issues Mol Biol,2007,9(1):1-20.

[24] 赫曉林,黃建煒,許瑞安,等.HBV病毒復(fù)制機制及慢性乙型肝炎藥物靶點[J].中國藥理學(xué)通報,2015,31(2):152-156.

吳移謀 教授

專家簡介： 吳移謀，教授，博士研究生導(dǎo)師，特殊病原體防控湖南省重點實驗室主任，南華大學(xué)病原生物學(xué)學(xué)科帶頭人，中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所客座教授。曾為亞洲支原體學(xué)組織(AOM)理事長，現(xiàn)為中華醫(yī)學(xué)會微生物學(xué)與免疫學(xué)分會特殊病原體學(xué)組主任委員、中國微生物學(xué)會人獸共患病原學(xué)專業(yè)委員會副主任委員、湖南省微生物學(xué)會副理事長。湖南省中青年優(yōu)秀專家、跨世紀(jì)學(xué)科帶頭人后備人才、首批高校學(xué)科帶頭人、享受國務(wù)院特殊津貼專家。

R372

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.001

2015-12-01；

2016-1-5

湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(湘教通[2014]405號、湘教通[2015]351號).

蔣湘蓮)