AIDS患者血液與腦脊液中真菌檢測(cè)及藥敏分析

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(1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)系，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.岳陽(yáng)縣水務(wù)局農(nóng)村飲用水安全水質(zhì)檢測(cè)中心；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

·臨床醫(yī)學(xué)·

AIDS患者血液與腦脊液中真菌檢測(cè)及藥敏分析

歐紫娟1，2，陳勝華3，蔡恒玲3，楊赟1，柏琴琴1，陳麗麗1*

(1.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)系，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.岳陽(yáng)縣水務(wù)局農(nóng)村飲用水安全水質(zhì)檢測(cè)中心；3.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的分析艾滋病(AIDS)患者血液及腦脊液中真菌種類及其耐藥性，為臨床診療AIDS患者機(jī)會(huì)性感染提供參考。方法收集2011～2014年某傳染病醫(yī)院接診AIDS患者的血液和腦脊液標(biāo)本，對(duì)其中病原性真菌進(jìn)行分離、鑒定，并對(duì)新生隱球菌進(jìn)行藥敏分析。結(jié)果共分析AIDS患者血液培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本477份、腦脊液培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本109份，真菌檢出率分別為66.88%(319/477)和66.97%(73/109)，其中血液中以馬內(nèi)菲青霉菌檢出率最高，為53.04%(253/477)，腦脊液中以新生隱球菌檢出率最高，占66.06%(72/109)。新生隱球菌對(duì)兩性霉素B、氟康唑、5-氟胞嘧啶均高度敏感。結(jié)論AIDS患者合并真菌感染率較高，其中常見(jiàn)的是馬內(nèi)菲青霉菌和新生隱球菌。

艾滋??； 馬內(nèi)非青霉菌； 新生隱球菌； 藥物敏感性

艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)，又稱為獲得性免疫缺陷綜合征，是因HIV侵入機(jī)體，破壞CD4+淋巴細(xì)胞，引起細(xì)胞免疫嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致以機(jī)會(huì)性感染、惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)病變?yōu)樘卣鞯呐R床綜合征[1]。自1981年6月發(fā)現(xiàn)首例艾滋病以來(lái)，該疾病迅速蔓延。在全世界死因順位中因AIDS死亡居第四位，敗血癥、菌血癥是艾滋病患者病情加重乃至死亡的重要原因[2-5]。AIDS患者合并感染的病原微生物包括各種細(xì)菌和真菌，而其種類在不同國(guó)家和地區(qū)有所差異[6-8]。由于抗細(xì)菌抗生素的廣泛使用，真菌引起AIDS患者機(jī)會(huì)性感染的地位更為突出，常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染真菌有白假絲酵母菌、馬內(nèi)菲青霉菌、新生隱球菌等[9-12]。因此，研究AIDS患者血液及腦脊液中病原性真菌的種類及其對(duì)抗生素的敏感性，對(duì)臨床治療AIDS合并菌血癥患者有重要意義。

本文擬以某傳染病醫(yī)院2011～2014年收治住院的AIDS確診患者(由疾病預(yù)防與控制中心確診)為研究對(duì)象，檢測(cè)其血液和腦脊液標(biāo)本中的真菌種類，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為臨床合理治療AIDS合并機(jī)會(huì)性感染患者提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料標(biāo)本來(lái)源于某傳染病醫(yī)院2011年1月～2014年12月住院及門(mén)診的已確診的艾滋病患者，其中血液培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本477份、腦脊液培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本109份。

1.2主要試劑ATBTMFUNGUS3真菌藥敏試劑條、ID32GN革蘭陰性桿菌鑒定卡、ID32C酵母菌鑒定卡、ATBTMPSE5非酵母菌藥敏試劑條，均購(gòu)自法國(guó)梅里埃生物公司。成人中和抗生素培養(yǎng)瓶，購(gòu)自美國(guó)BD公司。血瓊脂平板、沙氏培養(yǎng)基、柯瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.3方法

1.3.1 微生物分離培養(yǎng) (1)血液標(biāo)本：取患者血液標(biāo)本8～10 mL于血培養(yǎng)瓶中，置于BD BACTE 9120全自動(dòng)血液快速培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng)，待儀器報(bào)警顯示陽(yáng)性時(shí)，取出標(biāo)本，用注射器吸取少量標(biāo)本，分區(qū)劃線接種于血瓊脂平板和沙氏培養(yǎng)基，分別置于35 ℃和25 ℃孵育箱中培養(yǎng)。(2)腦脊液標(biāo)本：將收集的腦脊液高速離心，去上清，取少量沉淀涂片，染色鏡檢。臨床疑似流行性腦脊髓膜炎或化膿性腦脊髓膜炎時(shí)，進(jìn)行革蘭染色鏡檢；疑為結(jié)核性腦脊髓膜炎時(shí)，作抗酸染色；疑為真菌性腦膜炎時(shí)，進(jìn)行墨汁負(fù)染色。

1.3.2 微生物鑒定 血瓊脂平板35 ℃培養(yǎng)24～36 h，沙氏培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)48 ～72 h后，取典型菌落，涂片、染色鏡檢進(jìn)行初步鑒定。疑似念珠菌的菌株轉(zhuǎn)種至柯瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)所顯示的顏色進(jìn)行辨別；若有用柯瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基不能鑒定的酵母樣真菌，則用ATB ID32C酵母菌生化鑒定卡對(duì)其進(jìn)行鑒定。

(1)馬內(nèi)菲青霉鑒定。培養(yǎng)特征：25 ℃培養(yǎng)，生長(zhǎng)較快。菌落由最初的淡黃白絨毛狀變?yōu)樽丶t色，有皺褶，可產(chǎn)生玫瑰紅色色素。35 ℃培養(yǎng)時(shí)為酵母相，光滑、圓形或卵圓形菌落，菌落呈膜狀、有細(xì)小褶皺，淡灰白色或奶酪色。鏡檢特征：25 ℃培養(yǎng)物，鏡下可見(jiàn)分隔菌絲，分生孢子梗光滑，分散帚狀枝，雙輪生，稍不對(duì)稱，瓶梗頂端變窄，球形分生孢子，呈鏈狀排列。35 ℃培養(yǎng)物，可見(jiàn)圓形或長(zhǎng)方形的關(guān)節(jié)孢子。(2)新生隱球菌的鑒定。在沙氏或血瓊脂培養(yǎng)基上，25 ℃或35 ℃下均生長(zhǎng)良好。數(shù)天后形成酵母型菌落，初為乳白色細(xì)小菌落，增大后表面黏稠、光滑，后轉(zhuǎn)變?yōu)殚冱S色，最后變成棕褐色。在麥芽汁液體培養(yǎng)基中，25 ℃孵育3 天后渾濁生長(zhǎng)，可有少量沉淀或菌膜。菌體為圓形酵母樣細(xì)胞，菌體外圍有一層肥厚的膠質(zhì)樣莢膜。用墨汁負(fù)染色后鏡檢，可在黑色背景中見(jiàn)到圓形或卵圓形的透亮菌體。(3)其他病原菌的鑒定：挑取單個(gè)菌落制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊牟≡鷳乙海缓髮⒅苽涞膽乙杭尤腓b定卡的杯型器中培養(yǎng)24 h以上，用ATB ExpressionTM微生物鑒定儀自動(dòng)判讀或根據(jù)說(shuō)明書(shū)提供的結(jié)果判讀表進(jìn)行人工判讀。

1.3.3 新生隱球菌藥物敏感性分析 將新生隱球菌菌液無(wú)菌加入藥敏板中，抗菌藥物為：5-氟胞嘧啶、氟康唑、兩性霉素B，將藥敏板置于溫箱中35 ℃孵育24 ～48 h，再用1525型梅里埃微生物鑒定系統(tǒng)檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。在含有抗菌藥物的培養(yǎng)基中，濁度的增加提示細(xì)菌生長(zhǎng)，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)2010～2013版判斷標(biāo)準(zhǔn)，以敏感或耐藥報(bào)告結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 AIDS患者血液及腦脊液標(biāo)本中病原菌檢出情況 本文檢測(cè)2011～2014年該醫(yī)院收治的艾滋病患者血液陽(yáng)性標(biāo)本和腦脊液陽(yáng)性標(biāo)本合計(jì)586份，其中血液標(biāo)本477份、腦脊液標(biāo)本109份，培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)均為單一菌種。結(jié)果顯示，血液和腦脊液標(biāo)本中真菌檢出率高于細(xì)菌(P<0.01)。2011～2014年間，血液標(biāo)本中，真菌所占比率依次為72.41%、66.38%、72.17%、60.38%，平均為66.88%；腦脊液標(biāo)本中，真菌所占比率依次為60.00%、77.27%、75.00%、57.89%，平均為66.97% (表1)。

表12011～2014年AIDS患者血液和腦脊液標(biāo)本中病原菌檢出情況

年份血液(例,%)真菌細(xì)菌合計(jì)腦脊液(例,%)真菌細(xì)菌合計(jì)201163(72.41%)24(27.59%)8716(60.00%)9(40.00%)25201277(66.38%)39(33.62%)11617(77.27%)5(22.73%)22201383(72.17%)32(27.83%)11518(75.00%)6(25.00%)24201496(60.38%)63(39.62%)15922(57.89%)16(42.11%)38合計(jì)319(66.88%)158(33.12%)477χ2=131.089,P=0.00073(66.97%)36(33.03%)109χ2=23.564,P=0.000

2.2 AIDS患者血液及腦脊液標(biāo)本中真菌種類的構(gòu)成

2.2.1 血液中真菌種類的構(gòu)成情況 477份血液培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中，共檢出真菌319株，真菌檢出率為66.88%，其中馬內(nèi)非青霉菌檢出率最高，共檢出253株，占79.31%，其次為新生隱球菌，共檢出63株，占19.75%，其它真菌3株，占0.94%(表2)。

2.2.2 腦脊液中真菌種類的構(gòu)成情況 109份腦脊液培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中，共檢出真菌73株，真菌檢出率為66.97%(73/109)，其中新生隱球菌72株，占98.63%，腐殖隱球菌1株，占1.37%。

表22011年～2014年AIDS患者血液標(biāo)本中病原性真菌檢出情況

菌種株數(shù)構(gòu)成比(%)馬內(nèi)菲青霉菌25379.31新生隱球菌6319.75其他真菌30.94合計(jì)319100.00

2.3新生隱球菌藥敏分析檢測(cè)新生隱球菌對(duì)3種常用抗真菌藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)新生隱球菌對(duì)兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑均高度敏感，敏感度達(dá)100%，只有氟康唑檢出少數(shù)耐藥菌株(表3)。

表3新生隱球菌的藥物敏感性(株，%)

年份菌株數(shù)5-氟胞嘧啶氟康唑兩性霉素B20111515(100.00)15(100.00)15(100.00)20121717(100.00)16(94.12)17(100.00)20131818(100.00)18(100.00)18(100.00)20142222(100.00)21(95.45)22(100.00)合計(jì)7272(100.00)70(97.22)72(100.00)

3 討 論

目前我國(guó)面臨艾滋病發(fā)病和死亡的高峰期，合并感染病原菌是艾滋病患者病情加重乃至死亡的重要原因。真菌也是AIDS合并感染的常見(jiàn)病原體，了解AIDS患者機(jī)會(huì)性感染病原性真菌的種類分布及其對(duì)抗菌藥物的敏感性，能為臨床合理用藥提供依據(jù)，進(jìn)而提高AIDS合并感染患者的生存質(zhì)量。

本文針對(duì)某傳染病醫(yī)院2011年1月～2014年12月收治的AIDS確診患者，收集血液培養(yǎng)陽(yáng)性及腦脊液培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本，對(duì)真菌分布及藥物敏感性特點(diǎn)進(jìn)行分析。血液和腦脊液標(biāo)本中真菌檢出率均較高，檢出率最高的分別為馬內(nèi)菲青霉菌和新生隱球菌，與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者報(bào)道一致[12-14]。

馬內(nèi)菲青霉菌最初通過(guò)吸入而致肺部感染，隨后入血引起菌血癥，并隨血流播散引起其他部位感染，通常侵犯淋巴系統(tǒng)、肝臟、脾和骨骼。馬內(nèi)菲青霉菌在AIDS患者血液中的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他病原菌，說(shuō)明馬內(nèi)菲青霉菌是引起艾滋病患者感染的常見(jiàn)機(jī)會(huì)性致病菌之一，國(guó)內(nèi)外均有類似報(bào)道，并且馬內(nèi)菲青霉菌感染被確認(rèn)為是艾滋病指征之一，為艾滋病患者特有的感染病原體[15-18]。

新生隱球菌性腦膜炎是艾滋病患者常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體之一，在發(fā)展中國(guó)家，新生隱球菌具有較高的流行率。本研究中，艾滋病患者的腦脊液培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中，新生隱球菌檢出率達(dá)66.06%(72/109)。

由于馬內(nèi)菲青霉菌很少產(chǎn)生耐藥性變異，臨床上一般做經(jīng)驗(yàn)治療。因此，本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)檢出的新生隱球菌進(jìn)行了藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，新生隱球菌對(duì)臨床常用的抗真菌藥物5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的敏感性達(dá)100%，72株中有2株對(duì)氟康唑耐藥，這與易璨珺等報(bào)道一致[19]。目前公認(rèn)抗真菌感染的最佳藥物是兩性霉素B，因其能選擇性地與真菌細(xì)胞膜的麥角甾醇結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞質(zhì)往外滲出，進(jìn)而使真菌死亡，對(duì)絕大多數(shù)致病真菌有抗菌活性。

綜上所述，本文分析了某傳染病醫(yī)院AIDS并發(fā)感染的患者血液和腦脊液中的主要真菌種類，并檢測(cè)了新生隱球菌的藥物敏感性，對(duì)AIDS病人的預(yù)見(jiàn)性護(hù)理及并發(fā)感染的治療具有參考意義。

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AnalysisofPathogenicFungusIsolatedfromBloodandCerebrospinalFluidofAIDSPatients

OU Zijuan,CHEN Shenghua,CAI Hengling,et al

(DepartmentofSanitaryInspection,SchoolofPublicHealth,UniversityofSouthChina，Hengyang，Hunan421001，China)

ObjectiveTo investigate the species and drug-resistance of pathogenic fungus isolated from blood and cerebrospinal fluid (CSF) of AIDS patients，so as to provide reference for clinical diagnosis and treatment.MethodsThe blood and CSF samples were collected from AIDS patients from a hospital for infectious diseases during 2011 to 2014.The pathogenic fungus were isolated and identified,then the drug sensitivity was analyzed.ResultsTotally 477 blood and 109 CSF specimens were analyzed,and the fungi positive rate were 66.88% (319/477)and 66.97% (73/109).Among the 477 blood samples,319 fungi strains were isolated and Penicillium marneffei was the main pathogens which positive rate was 53.04% (253/477).In the 109 CSF samples,73 fungi strains were isolated and the most common member was Cryptococcus neoformans whose positive rate was 66.06% (72/109).Cryptococcus neoformans exihibited high sensitive to Amphotericin B,Fluconazole and 5-flucytosine.ConclusionAIDS patients have a high opportunity to co-infect with fungus,and the most isolates are P.marneffei and C.neoformans.

AIDS; Penicillium marneffei; Cryptococcus neoformans; drug sensitive

R512.91

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.008

2015-09-21；

2015-12-01

南華大學(xué)博士啟動(dòng)基金(2014XQD42).

*通訊作者，E-mail：chlili720612@163.com.

蔣湘蓮)