甲狀腺素對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠ANGPTL3表達(dá)的影響

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(1.華潤(rùn)武鋼總醫(yī)院干保中心，湖北 武漢 430080；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科；3.隆回縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

甲狀腺素對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠ANGPTL3表達(dá)的影響

程靜屏1，傅念*2，羅艷云3，馬娜2，陽(yáng)學(xué)風(fēng)2

(1.華潤(rùn)武鋼總醫(yī)院干保中心，湖北 武漢 430080；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院消化內(nèi)科；3.隆回縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科)

目的探討甲狀腺激素(TH)對(duì)非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠血管生成素樣蛋白3(ANGPTL3)表達(dá)的影響，明確TH是否通過ANGPTL3途徑影響NAFLD大鼠肝臟脂肪變性。方法健康3周初斷乳SD雄性大鼠30只，隨機(jī)分為5組：正常組、高脂組、甲狀腺素預(yù)防組、甲狀腺素治療組、吉非羅齊組；所有大鼠除正常組外均以高脂飲食喂養(yǎng)，分別于0、4、8、12周斷尾取血，12周末處死大鼠，取肝臟。蘇木精-伊紅法(HE)染色，進(jìn)行肝脂肪變性程度評(píng)分，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA法)檢測(cè)血清ANGPTL3含量，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)肝臟中ANGPTL3 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果甲狀腺素預(yù)防組及吉非羅齊組大鼠肝組織脂肪變性程度均低于高脂組及甲狀腺素治療組(P<0.01)。高脂組血清ANGPTL3水平在第8周后出現(xiàn)增高，呈時(shí)間依賴性，其肝組織中的ANGPTL3 mRNA表達(dá)亦較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。甲狀腺預(yù)防組大鼠在8、12周均出現(xiàn)血清ANGPTL3濃度降低，并可下調(diào)肝臟ANGPTL3 mRNA水平，與高脂組及甲狀腺素治療組相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甲狀腺素治療組與吉非羅齊組亦可一定程度下調(diào)血清ANGPTL3水平及肝組織中ANGPTL3 mRNA 表達(dá)(P<0.05)，但其降低的程度少于甲狀腺素預(yù)防組(P<0.05)。結(jié)論NAFLD形成過程中伴有ANGPTL3進(jìn)行性增高，早期給予小劑量TH可通過ANGPTL3途徑而改善NAFLD大鼠肝脂肪變性程度。

非酒精性脂肪肝； 血管生成素樣蛋白3； 甲狀腺激素

甲狀腺激素(thyroid hormones,TH)是人體重要的激素之一，可以促進(jìn)人體正常的生長(zhǎng)發(fā)育，在脂代謝和葡萄糖代謝過程中起重要作用，體內(nèi)血清甲狀腺激素水平變化可引起脂代謝及糖代謝改變，與非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的關(guān)系密切[1-3]。

本文作者前期研究發(fā)現(xiàn)，早期給予外源性甲狀腺素可有效防止NAFLD大鼠肝臟脂肪變性。血管生成素樣蛋白3(angiopoietin-like protein 3,ANGPTL3) 是一種主要在肝臟表達(dá)的分泌蛋白,與脂質(zhì)代謝關(guān)系密切，可抑制脂蛋白脂肪酶 (lipoprotein lipase,LPL)的活性，減少血液中三酰甘油的清除，并能與脂肪組織直接結(jié)合促進(jìn)脂肪分解[4]，有學(xué)者將其作為治療肥胖、代謝綜合癥的靶標(biāo)[5-6]。本研究以NAFLD大鼠為研究對(duì)象，從生物水平研究TH對(duì)NAFLD大鼠ANGPTL3表達(dá)的影響，探討TH是否通過ANGPTL3途徑影響NAFLD大鼠肝臟脂肪變性。

1 料材與方法

1.1材料健康3周初斷乳SD雄性大鼠30只，購(gòu)自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重53±6 g，動(dòng)物合格證編號(hào)為DK0503-0062。高脂飼料配方：88%普通飼料+2%膽固醇+10%豬油；普通飼料及高脂飼料由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部制備。甲狀腺素片：濟(jì)南維爾康生化制藥有限公司；吉非羅齊膠囊：山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；膽固醇純品購(gòu)自上海藍(lán)季試劑公司。TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA marker購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；ELISA試劑盒均購(gòu)自北京方程生物科技有限公司；引物設(shè)計(jì)合成由生工生物工程(上海)有限公司完成； T-cadherin一抗購(gòu)自美國(guó)BioWorld公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純品。

1.2方法

1.2.1 動(dòng)物分組 所有SD大鼠購(gòu)回后普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組：正常組、高脂組、甲狀腺素預(yù)防組、甲狀腺素治療組、吉非羅齊組，每組6只。除正常組以普通飼料喂養(yǎng)外，其他各組均以高脂飼料喂養(yǎng)；高脂組：僅以高脂飼料喂養(yǎng)，不加其他干預(yù)因素；甲狀腺素預(yù)防組：高脂喂養(yǎng)第4周后給予甲狀腺素片混懸液每天4 mg/kg 灌胃；甲狀腺素治療組：高脂喂養(yǎng)第8周后給予甲狀腺素片混懸液每天4 mg/kg灌胃；吉非羅齊組：高脂喂養(yǎng)第4周后給予吉非羅齊混懸液每天150 mg/kg灌胃。所有大鼠均在喂養(yǎng)后0、4、8、12周斷尾取血，12周采用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后，處死大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，取肝臟。

1.2.2 標(biāo)本收集 處死大鼠后，迅速取下肝臟，觀察其顏色、質(zhì)地；剪取肝右葉組織放入去除RNA酶的EP管內(nèi)，液氮保存。血液標(biāo)本室溫條件下靜置15 min，4 ℃離心25 min(3 000 rpm)，上清液保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 血清ANGPTL3含量檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)血清ANGPTL3含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明執(zhí)行。

1.2.4 肝組織病理學(xué)檢查 處死大鼠后，分離肝臟，觀察大體形態(tài)及表面色澤。稱重后取肝右葉小塊肝組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色，于光鏡下觀察。脂肪變性程度評(píng)分可參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年12月修訂)[7]。按肝細(xì)胞脂肪變性細(xì)胞數(shù)占總肝細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)算，共分為4度：F0<5%肝細(xì)胞脂肪變性；F15%～33%肝細(xì)胞脂肪變性；F2 33%～66%肝細(xì)胞脂肪變性；F3 66%～75%肝細(xì)胞脂肪變性；F4 75%以上肝細(xì)胞脂肪變性。

1.2.5 引物設(shè)計(jì) GAPDH：上游引物：5′-caaggtcatccatgacaactttg-3′，下游引物：5′-gtccaccaccctgttgctgtag-3′，退火溫度：56 ℃，擴(kuò)增片段：496 bp；ANGPTL3：上游引物：5′-aaatgggctgtggaaatgtaac-3′，下游引物：5′-tcccttctaactctcgctctgt-3′，退火溫度：58 ℃，擴(kuò)增片段：404 bp。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)肝臟中ANGPTL3 mRNA的表達(dá)水平 處死大鼠后，迅速取下肝臟，觀察其顏色、質(zhì)地；剪取肝右葉組織放入去除RNA酶的EP管內(nèi)，液氮保存。按TRIzol法抽提肝組織總RNA，以分光光度計(jì)測(cè)定總RNA量，取總RNA 5 μg在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，按RT-PCR試劑盒的說明書按標(biāo)準(zhǔn)步驟操作來合成cDNA并擴(kuò)增產(chǎn)物；產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，AlphaImager 2200紫外分析儀觀察和掃描分析。根據(jù)灰度值/GAPDH的比值，對(duì)受體mRNA進(jìn)行半定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)全部采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，多組比較采用方差分析，采用方差齊性檢驗(yàn)查看組間差異，兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況觀察實(shí)驗(yàn)過程中，正常組所有大鼠精神良好，毛發(fā)光澤，活躍，反應(yīng)敏銳，食欲佳。高脂組大鼠隨著動(dòng)物造模時(shí)間的延長(zhǎng)，毛發(fā)漸失去光澤，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，食欲欠佳，甚至有個(gè)別大鼠變得易激惹，富于攻擊性。12周時(shí)，甲狀腺素預(yù)防組和吉非羅齊組大鼠與高脂組比較，毛發(fā)、精神、反應(yīng)和食欲等方面癥狀明顯減輕；甲狀腺素治療組大鼠毛發(fā)漸失去光澤，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍。

2.2 12周時(shí)各組大鼠脂肪變性程度各組大鼠肝組織脂肪變性程度評(píng)分為正常組0.00±0.00，高脂組3.60±0.22；甲狀腺素預(yù)防組1.80±0.16；甲狀腺素治療組3.50±0.14；吉非羅齊組1.95±0.10。根據(jù)HE染色示，所有高脂喂養(yǎng)組大鼠肝組織脂肪變性均較正常組升高，差異具有顯著性(F=1361.67，P<0.01)；甲狀腺素預(yù)防組及吉非羅齊組大鼠肝組織脂肪變性程度均低于高脂組及甲狀腺素治療組，均P<0.01。

2.3血清ANGPTL3含量檢測(cè)結(jié)果高脂組血清中的ANGPTL3水平在第8周后開始較正常組明顯增高(q=10.076,P<0.01)，且呈時(shí)間依賴性。甲狀腺預(yù)防組大鼠在8、12周均出現(xiàn)血清中的ANGPTL3濃度降低，與高脂組及甲狀腺素治療組比較，差異均有顯著性(P<0.05)。甲狀腺素治療組與吉非羅齊組亦可在一定程度上下調(diào)血清ANGPTL3水平，12周時(shí)與高脂組比較差異具有顯著性(P<0.05)，但其降低的程度少于甲狀腺素預(yù)防組，12周時(shí)甲狀腺治療組與吉非羅齊組之間，血清ANGPTL3水平組間比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1各組SD大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清ANGPTL3含量的變化(n=6，μg/mL)

組別0周4周8周12周正常組240.24±23.22288.25±25.23419.64±45.23b438.24±46.14b高脂組235.55±21.42309.83±30.29627.04±41.72a712.52±20.66a甲狀腺素預(yù)防組236.78±30.76325.05±33.07a439.45±21.05bc435.96±35.65bc甲狀腺素治療組245.09±14.93316.89±24.67652.94±32.59a502.49±31.63ab吉非羅齊組247.99±21.47326.77±35.46474.12±32.62ab544.38±39.05ab

與正常組相比，a:P<0.05；與高脂組相比，b:P<0.05；與甲狀腺素治療組比較，c：P<0.05

2.4各組SD大鼠肝臟組織中ANGPTL3 mRNA的表達(dá)各組ANGPTL3 mRNA的表達(dá)分別為：正常組0.860±0.016；高脂組：0.980±0.047；甲狀腺素預(yù)防組0.773±0.036；甲狀腺素治療組0.873±0.029；吉非羅齊組0.890±0.029。高脂組大鼠肝組織中的ANGPTL3 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組明顯升高(q=5.139，P<0.05)。甲狀腺素預(yù)防組、治療組及吉非羅齊組均可下調(diào)SD大鼠肝臟組織中ANGPTL3 mRNA表達(dá)，與高脂組比較差異均有顯著性(P<0.01)，其中甲狀腺素預(yù)防組下調(diào)尤為明顯，甲狀腺素預(yù)防組與甲狀腺素治療組、吉非羅齊組進(jìn)行組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖1)。

3 討 論

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，TH強(qiáng)大的分解代謝作用，可使血脂降低，游離脂肪酸明顯增高，外周脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，引起肝脂沉積，從而導(dǎo)致肝脂肪變性，故不認(rèn)為對(duì)NAFLD的治療有價(jià)值[8]。但本文作者的前期研究發(fā)現(xiàn)，早期給予小劑量外源性甲狀腺素可有效防止NAFLD大鼠肝臟脂肪變性[9]。臨床上甲狀腺激素在NAFLD中的利用停滯不前，主要原因在于甲狀腺激素在生物體內(nèi)過多或過少均可敏感的引起機(jī)體糖、脂質(zhì)代謝紊亂，其與NAFLD發(fā)病機(jī)制不確定、藥物劑量的不確定、用藥之后可影響NAFLD進(jìn)程中的哪些具體靶器官及作用途徑等問題尚未明確。故甲狀腺激素在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展過程中有大量的問題尚等進(jìn)一步研究。

圖1 各組SD大鼠肝臟組織中ANGPTL3 mRNA表達(dá)電泳圖 A：正常組；B：高脂組；C：甲狀腺素預(yù)防組；D：甲狀腺素治療組；E：吉非羅齊組

既往在Fugier C[10]的研究中發(fā)現(xiàn)，甲狀腺素可以反向調(diào)節(jié)ANGPTL3表達(dá)，大鼠在給予T3后ANGPTL3 mRNA明顯下調(diào)，但在甲狀腺素受體(THR)缺乏大鼠中ANGPTL3的表達(dá)無變化，也就是說T3反向調(diào)節(jié)ANGPTL3的作用呈甲狀腺素受體依賴性。ANGPTL3是1999年Conklin等[11]發(fā)現(xiàn)的一種多功能分泌因子，因其具有血管生成素家族的特征性結(jié)構(gòu)而得名，但在功能上與血管生成素家族(Ang)又有明顯的不同，沒有Ang所具有的特征性鈣結(jié)合模序，不與血管生成素受體相結(jié)合。其由Angptl3編碼，約7×103bp，主要在人和鼠的肝臟表達(dá)。ANGPTL3具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和促進(jìn)血管生成的作用，尤以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用最為突出[4,12-13]。ANGPTL3可通過抑制LPL的活性，減少血液中三脂酰甘油的清除，提高血漿三脂酰甘油水平，并能與脂肪組織直接結(jié)合，激活脂肪細(xì)胞的脂解作用，從而導(dǎo)致游離脂肪酸(FFA)和甘油從脂肪細(xì)胞釋放增多，引起血漿FFA和甘油水平升高，但其對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝及沉積的作用及關(guān)系研究尚不明確。

本研究中發(fā)現(xiàn)在NAFLD發(fā)生、發(fā)展過程中伴有血清ANGPTL3進(jìn)行性增高，其肝組織中的ANGPTL3 mRNA表達(dá)亦較正常對(duì)照組明顯升高，ANGPTL3的增高與NAFLD的形成密切相關(guān)。在早期給予小劑量外源性甲狀腺素可以反向調(diào)節(jié)ANGPTL3表達(dá)，從而改善NAFLD大鼠肝脂肪變性程度，且相比吉非羅齊組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吉非羅齊是臨床上常用的降脂藥物，其降血脂的作用機(jī)制尚未完全明了，本次研究應(yīng)用吉非羅齊作為陽(yáng)性對(duì)照，研究結(jié)果顯示吉非羅齊與甲狀腺素預(yù)防組改善高脂誘導(dǎo)的SD大鼠肝臟脂肪變性的作用相當(dāng)，但甲狀腺素預(yù)防組下調(diào)血清ANGPTL3水平及肝組織中的ANGPTL3 mRNA表達(dá)的作用優(yōu)于吉非羅齊組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明TH可能是通過ANGPTL3途徑而改善NAFLD。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)僅在早期給予小劑量外源性甲狀腺素可以下調(diào)ANGPTL3，改善NAFLD大鼠肝脂肪變性程度，而在疾病進(jìn)展到一定階段后再給予外源性甲狀腺素僅可部分下調(diào)ANGPTL3，而對(duì)NAFLD大鼠肝脂肪變性程度改善不明顯。分析原因可能為：(1)TH下調(diào)ANGPTL3的作用呈甲狀腺素受體依賴性，NAFLD在疾病的中晚期可能存在TH受體抑制；(2)TH藥物劑量療效及毒副作用的平衡點(diǎn)有待進(jìn)一步研究；(3)TH及ANGPTL3對(duì)NAFLD疾病形成的干預(yù)可能更強(qiáng)于對(duì)于疾病的逆轉(zhuǎn)；故對(duì)TH受體、藥物劑量、安全性、用藥時(shí)間點(diǎn)等諸多問題仍需進(jìn)一步深入研究。

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EffectsofThyroidHormoneontheExpressionofANGPTL3inNonalcoholicFattyLiverinRats

CHENG Jingping,FU Nian,LUO Yanyun,et al

(HuarunWISCOGeneralHospital,Hubei，Wuhan,Hubei430080,China)

ObjectiveTo investigate the effects of TH on the expression of ANGPTL3 of NAFLD rats,and the effect of TH on hepatic steatosis in NAFLD rats by ANGPTL3 pathway.Methods30 SD male rats,were randomly divided into 5 groups:normal control group,high fat group,thyroxine prevention group,treatment group,gemfibrozil group;All rats were fed with high fat diet except the normal group,blood was taken out from the tail of rat at 0,4,8,12 weeks,All of them were killed at the end of 12 weeks,the degree of hepatic steatosis score was observed by HE staining of Liver pathological section.Serum ANGPTL3 content was detected by ELISA method,and the mRNA expression of ANGPTL3 in liver tissue was measured with RT-PCR.ResultsRat liver steatosis degree in thyroxine prevention group and gemfibrozil group was lower than the high fat group and thyroxine treatment(P<0.05).In the high fat group,the serum level of ANGPTL3 was increased at 8W,the expression of ANGPTL3 mRNA in liver tissue was significantly higher than the normal control(P<0.01).Thyroxine prevention group rats showed the decrease in serum concentration of ANGPTL3 at 8 weeks,12 weeks，and lower hepatic ANGPTL3 mRNA level,compared with high cholesterol group,gemfibrozil group and thyroxine treatment groups,was statistically significant(P<0.05).Thyroxine treatment group and gemfibrozil group can also in a certain degree decreasing serum ANGPTL3 level and expression of ANGPTL3 mRNA in liver tissue(P<0.05),but the extent of reduction is less than thyroxine prevention group(P<0.05).ConclusionThe formation process of NAFLD increased with ANGPTL3,ans early administration of small dose of TH hepatic adipose degeneration in NAFLD rats improved through ANGPTL3 pathway.

nonalcoholic fatty liver disease；angiopoietin-like protein 3；thyroid hormones

R575.5

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.006

2015-10-23；

2015-12-30

本項(xiàng)目由2012年武漢市衛(wèi)生計(jì)生委科研基金支持(編號(hào)WX12B07).

*通訊作者，E-mail:2002funian@163.com.

蔣湘蓮)