缺血預(yù)處理在肢體再灌注損傷中的保護作用及一氧化氮、內(nèi)皮素1的變化

閆 斌, 哈斯魯, 買合木提·亞庫甫, 侯彥杰,徐 超, 伊力哈木·托合提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830063)

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缺血預(yù)處理在肢體再灌注損傷中的保護作用及一氧化氮、內(nèi)皮素1的變化

閆 斌, 哈斯魯, 買合木提·亞庫甫, 侯彥杰,徐 超, 伊力哈木·托合提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830063)

目的 分析無創(chuàng)性肢體缺血預(yù)處理(IPC)對肢體缺血再灌注損傷的干預(yù)效果以及NO和ET-1的變化。方法 30只大鼠隨機均分為對照組和實驗組，對照組未經(jīng)過缺血預(yù)處理，直接止血2、3、4 h; 實驗組經(jīng)過缺血預(yù)處理后，于第2天分別止血2、3、4 h。依次于恢復(fù)肢體血流(再灌注)后1、3、7、14 d時抽取血液檢測ET-1、NO的水平。結(jié)果 大鼠體內(nèi)NO和ET-1在第1、3、7、14天內(nèi)呈先遞增后遞減的趨勢，實驗組NO在第3天缺血4 h時達最大值，對照組NO在第7天缺血2 h時達高峰；實驗組ET-1在第7天缺血3h時達最大值，對照組ET-1在第3天4 h時達最大值，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組NO在大鼠血液中第1、3、7天的含量在缺血2 h和3 h時均顯著低于對照組(P<0.01); 第14天時，僅缺血2 h時顯著低于對照組(P<0.01); 實驗組ET-1在大鼠血液中第1、3、7天的含量在缺血各時間段時均顯著低于對照組(P<0.01); 第14天時，僅缺血3 h時顯著低于對照組(P<0.01)。結(jié)論 缺血預(yù)處理改變了缺血再灌注損傷后血清NO與ET-1的水平。

缺血預(yù)處理; 再灌注損傷; 肢體; 一氧化氮、內(nèi)皮素-1

缺血再灌注可引起全身器官及局部不良反應(yīng)，即肢體缺血再灌注(LIR)損傷，這種損傷包括缺血期原發(fā)性損傷和再灌注期繼發(fā)性損傷，自由基在再灌注損傷中起著重要作用。缺血預(yù)處理是短期缺血應(yīng)激使機體對隨后長時間的缺血再灌注損傷產(chǎn)生明顯保護作用的一種適應(yīng)性機制[1], 可以影響體內(nèi)的自由基代謝，增強組織對缺血的耐受性。內(nèi)皮素(ET)和一氧化氮(NO)是血管內(nèi)皮分泌的血管活性因子，ET是最強烈的縮血管因子，對人體各臟器都有明顯的縮血管作用[2]; NO為一種血管舒張因子，在調(diào)節(jié)血管張力、改善血液循環(huán)等方面有著獨特的作用[3]。研究[4]顯示，大鼠缺血再灌注后發(fā)生骨骼肌損傷與機體活性氧產(chǎn)生增多及清除酶活性下降有關(guān)，且以再灌注4 h左右為重，NO在再灌注后減輕了LIR損傷，對骨骼肌有保護作用，ET可能通過促進氧自由基的生成和引起中性粒細胞的聚集參與了缺血再灌注后的骨骼肌損傷。本文觀察ET和NO在大鼠肢體不同缺血時間的變化以及缺血預(yù)處理后的變化，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Rat白細胞介素6 ELisa Kit試劑盒(貨號: 201411; 批號: E-30644), Rat 白細胞介素8 ELisa Kit試劑盒(貨號: 201411; 批號: E-30581)均購自abcam公司。

1.2 實驗動物

健康SD大鼠30只，體質(zhì)量150～200 g, 雌雄不限；隨機分為缺血實驗組(實驗組)和對照組各15只，每組再分為缺血2、3、4 h小組，每小組5只。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗組缺血預(yù)處理：左后腿脫毛，在大腿根部應(yīng)用特制的氣囊止血帶(長12 cm, 寬2 cm), 充氣壓力為40 kPa, 妥善固定10 min, 造成肢體缺血。充氣止血帶放氣10 min, 形成肢體缺血再灌注預(yù)處理過程后，反復(fù)3次，于次日再分別持續(xù)缺血2、3、4 h; 對照組分別直接持續(xù)缺血2、3、4 h。1.3.2 雙下肢缺血再灌注模型的制作: 25 mg/kg的戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，大鼠仰臥，腹部硫化鋇脫毛，消毒鋪巾，進行無菌手術(shù)操作。取下腹正中切口，長約2～3 cm, 切開皮膚、皮下，自中線切開腹部肌肉和腹膜，鹽水紗布將腸推向兩側(cè)，縱行剪開后腹膜，暴露出腹主動脈和后腔靜脈。在腹主動脈分出雙側(cè)髂總動脈處以近約1 cm范圍內(nèi)，10倍手術(shù)顯微鏡下仔細分離開腹主動脈和下腔靜脈[5]。用顯微血管夾阻斷腹主動脈血流，可用手指捫及其遠端撥動情況予以證實，關(guān)腹。4 h后開腹取出血管夾，恢復(fù)血流2或24 h。1.3.3 血清NO和ET-1的檢測：缺血后放松止血帶恢復(fù)肢體血流，依次于恢復(fù)肢體血流(再灌注)后1、3、7、14 d時抽取血液，取血清標(biāo)本進行血清NO和ET-1檢測，標(biāo)本置于4℃下, 4 000 r/min離心10 min, 分離血清并置于-80℃冰箱中保存。應(yīng)用酶聯(lián)免疫原理檢測標(biāo)本檢測NO和ET-1, 嚴格按照說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 不同時間段2組不同處理時間NO和ET-1的變化

無論止血時間長短，大鼠體內(nèi)NO和ET-1在第1、3、7、14天內(nèi)呈先遞增、后遞減的趨勢，實驗組NO在第3天缺血4 h時達最大值，對照組NO在第7天缺血2 h時達高峰；實驗組ET-1在第7天缺血3 h時達最大值，對照組ET-1在第3天4 h時達最大值，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

2.2 2組NO水平和ET-1水平的比較

實驗組大鼠血液中NO在第1、3、7天缺血2 h和3 h時的含量均顯著低于對照組(P<0.01); 第14天時，僅缺血2 h時顯著低于對照組(P<0.01); 其他時點缺血時間各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。實驗組大鼠血液中ET-1在第1、3、7天缺血各時間的含量段時均顯著低于對照組(P<0.01); 第14天時，僅缺血3 h時顯著低于對照組(P<0.01); 缺血2 h和4 h時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表1 實驗組不同處理時間大鼠炎性因子的變化情況

表2 對照組不同處理時間大鼠炎性因子的變化情況

表3 相同時間段預(yù)處理組和對照組NO水平的比較

與對照組比較, **P<0.01。

表4 相同時間段預(yù)處理組和對照組ET-1水平比較

與對照組比較, **P<0.01。

3 討 論

及時恢復(fù)充足的血液供應(yīng)是肢體缺血組織成活的關(guān)鍵，但是缺血組織再灌注又可導(dǎo)致缺血組織的進一步損傷，這即是缺血再灌注損傷(IR損傷)。大量研究[6]表明，氧自由基產(chǎn)生的增加及其誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是引起骨骼肌缺血再灌注損傷的重要原因。研究表明，機體多種細胞在多種應(yīng)激因素作用下既可以上調(diào)對誘導(dǎo)型NOS的表達，使NO產(chǎn)生增多，又可以上調(diào)對誘導(dǎo)型HO的表達，并產(chǎn)生大量NO, NO是中藥氣體信使分子，又是很強的自由基。研究[7]表明它既具有抑制炎性和氧化應(yīng)激性損傷的作用，又具有介導(dǎo)此類損傷的作用。目前，對NO在骨骼肌缺血再灌注中的作用仍有爭論。有研究認為作為一種自由基, NO具有氧化還原特性, NO可加重骨骼肌缺血再灌注損傷；也有研究[8]顯示，左旋精氨酸源性NO可減輕骨骼肌、腎、肝、心、腦缺血再灌注損傷。孫永新等[9]研究缺血預(yù)處理(IPC)對大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷的保護作用及一氧化氮(NO)是否參與此保護作用，采用Wistar雌性大鼠，在左后肢跟部止血，同時使用血流監(jiān)測儀測股四頭肌的血流量，調(diào)整止血帶的松緊程度，使血流量控制在上止血帶前的30%，缺血再灌注組出現(xiàn)明顯肌纖維破裂溶解，許多白細胞浸潤，電鏡下線粒體中含有大量空泡變性、肌纖維斷裂、溶解和“Z線”排列整齊膜脂質(zhì)過氧化物的增加。與缺血再灌注組相比，缺血預(yù)處理組顯示了輕微的損害，正常的纖維和血管變形少，股四頭肌各型肌纖維橫截面積降低，細胞膜Ca2+-ATPase數(shù)量增加。實驗認為缺血預(yù)處理對大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷有明顯保護作用，NO參與這一保護作用。

內(nèi)皮內(nèi)素(ET)作為調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，在局部通過特異性受體參與調(diào)節(jié)機體的許多生理活動及炎癥反應(yīng)，對維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)有重要作用。其中內(nèi)皮素-1(ET-1)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的作用最強的縮血管物質(zhì)[10], 其引起的血管收縮、代謝紊亂和細胞增殖是與血管損傷有關(guān)疾病的共同致病因素。臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)ET-1可能參與心肌缺血再灌注損傷，心肌缺血再灌注時，可引起心肌細胞膜上ET-1結(jié)合點密度增加。ET-1促進心臟缺血再灌注損傷的機制與心肌膜上 ET-1 受體上調(diào)、促進胞內(nèi)鈣超載、PMN 聚集、黏附、氧自由基釋放及內(nèi)皮細胞自穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。高洪波等[11]觀察肢體缺血預(yù)適應(yīng)對大鼠肢體缺血再灌注后血漿和肺組織NO/ET-1比值的影響，結(jié)果顯示LIR組血漿及肺組織的NO/ET-1比值明顯減小；與LIP組比較，IPC組血漿及肺組織的NO/ET-1比值明顯增大。說明缺血預(yù)適應(yīng)可以調(diào)節(jié)肢體缺血再灌注后NO/ET-1比值失平衡而使組織損傷減輕。梁瑛琦等[12]實驗觀察一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)在家兔肝缺血/再灌注損傷過程中的變化，認為缺血/再灌注導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂，即NO水平下降和ET水平升高，其在肝缺血/再灌注發(fā)生發(fā)展中起介導(dǎo)作用。

缺血預(yù)處理可以使肢體再缺血前經(jīng)歷短暫預(yù)適應(yīng)過程能明顯減輕長時間缺血后的再灌注損傷，這種保護作用不僅局限于肢體，對遠程內(nèi)臟器官再灌注損傷亦有很大作用[13]。本研究顯示，經(jīng)過缺血預(yù)處理后，大鼠血液中ET-1和NO均顯著降低，基本隨著缺血時間的時間增加而增加，在第1、3、7天的含量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而14 d時，差異較小。實驗認為，通過缺血預(yù)處理的方式可調(diào)節(jié)血液中的ET-1及NO含量，進而減輕缺血再灌注損傷，但預(yù)處理的最佳間隔時間和處理適應(yīng)次數(shù)尚有待于進一步研究。

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Protective effect of ischemic preconditioning on reperfusion injury of limbs and changes of nitric oxide and endothelin 1

YAN Bin, Hasilu, Maihemuti·Yakufu, HOU Yanjie, XU Chao, Yilihamu·Tuoheti

(SecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang, 830063)

Objective To analyze the interventional effect of non-invasive limb ischemic preconditioning (IPC) on ischemia reperfusion injury and the changes of endothelin-1 and NO. Methods A total of 30 rats were randomly divided into control group and experimental group. The control group was not treated with ischemic preconditioning but with direct hemostasis at 2, 3 and 4 h. The experimental group was treated with ischemic preconditioning and hemostasis at 2, 3 and 4 h on the second day. ET-1, NO levels at 1, 3, 7, 14 days after restore the blood flow (reperfusion) were detected. Results NO in vivo in rats and ET-1 in the first 1, 3, 7, 14 days increased and then decreased. NO in the experimental group at 4 h after ischemia on the third day reached a maximum value, and NO in the control group 2 h after ischemia on 7thday reached a peak value. In the experimental group, ET-1 3 h after ischemic on the 7thday reached the maximum value, and in the control group ET-1 reached the maximum 4 h after ischemic on the third day (P<0.05). NO in the blood of rats in the experimental group 2 h and 3 h after ischemic on the first, third and seventh days were significantly lower than those in the control group (P<0.01). On 14thday, NO 2 h after ischemia was significantly lower than the control group (P<0.01). In the experimental group, ET-1 in the blood on 1st, 3rd, 7thdays in each ischemia time were significantly lower than those in the control group (P<0.01), and on the 14thday, ET-1 3 h after ischemic was significantly lower than the control group (P<0.01). Conclusion Ischemic preconditioning can change serum NO and ET-1 levels after ischemia-reperfusion injury.

ischemic preconditioning; reperfusion injury; limb; nitric oxide; endothelin-1

2016-10-10

新疆醫(yī)科大學(xué)2013年科研創(chuàng)新基金項目(XJC201368)

伊力哈木·托合提

R 541

A

1672-2353(2016)24-032-04

10.7619/jcmp.201624009