馬錢苷通過抑制蛋白磷酸酶2A催化亞基C磷酸化降低tau蛋白過度磷酸化

楊翠翠 李 林 張 麗 李雅莉 張 蘭

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室 北京市神經(jīng)藥物工程研究中心 北京腦重大疾病研究院 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

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· 神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究 ·

馬錢苷通過抑制蛋白磷酸酶2A催化亞基C磷酸化降低tau蛋白過度磷酸化

楊翠翠 李 林 張 麗 李雅莉 張 蘭*

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室 北京市神經(jīng)藥物工程研究中心 北京腦重大疾病研究院 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

目的 探討馬錢苷對tau蛋白過度磷酸化的影響及其作用機制。方法 馬錢苷(500、1 000 μmol/L)與人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SK-N-SH細(xì)胞)預(yù)孵育24 h，之后加入PI3K抑制劑Wortmannin(WT)及PKA抑制劑GF-109203X(GFX)與SK-N-SH細(xì)胞孵育3 h，采用Western blotting方法觀察馬錢苷對tau蛋白在Thr205、Thr217、PHF-1位點的磷酸化，GSK-3β-Ser9、GSK-3β、PP2A催化亞基C(protein phosphatase 2A catalytic subunit C，PP2Ac)磷酸化/甲基化及PP2Ac的表達。結(jié)果 WT/GFX明顯抑制p-GSK-3β-ser9的表達，引起GSK-3β活性增高，從而導(dǎo)致tau蛋白Thr205、Thr217、PHF-1位點高度磷酸化。馬錢苷能夠明顯抑制模型細(xì)胞tau蛋白在Thr205、Thr217、PHF-1位點的過度磷酸化，但是不能增高p-GSK-3β-ser9的表達，提示馬錢苷抑制tau蛋白磷酸化的作用不是通過影響GSK-3β通路實現(xiàn)的。但是實驗顯示馬錢苷能夠抑制PP2A催化亞基C Tyr307位點的磷酸化，但對Leu309位點甲基化無影響。結(jié)論 馬錢苷能夠抑制tau蛋白過度磷酸化，機制可能與其抑制PP2A催化亞基C Tyr307位點的磷酸化，提高PP2A活性有關(guān)，與GSK-3β通路無關(guān)。

馬錢苷； tau蛋白過度磷酸化；糖原合成酶激酶-3β；蛋白磷酸酯酶2A；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又稱老年性癡呆，是老年人中發(fā)病率最高的原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病，且是癡呆的最常見類型，在成人癡呆中約占60%[1-2]。臨床上主要表現(xiàn)為記憶力和其他認(rèn)知功能減退。

近年來研究[3]顯示，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)NFTs 的數(shù)量與其臨床癥狀呈正相關(guān)。異常過度磷酸化的tau蛋白是組成NFTs的主要成分[4]。Tau蛋白的磷酸化主要由蛋白磷酸激酶及蛋白磷酸酯酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)。參與 tau 磷酸化的蛋白磷酸激酶主要包括糖原合成酶激酶-3 (glycogen synthase kinase-3，GSK-3)、周期蛋白依賴性蛋白激酶-5(cyclin-dependent protein kinase 5，Cdk5)，應(yīng)激激活的蛋白激酶和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶Ⅱ(calcium, calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)，cAMP依賴性蛋白激酶 (cyclic AMP-dependent protein kinase， PKA)[5-7]。其中GSK-3是一種導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化的重要的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶。蛋白磷酸酶(protein phosphatases, PPs)可催化tau蛋白脫磷酸基，降低tau的磷酸化水平，使NFTs的結(jié)構(gòu)松解，釋放游離的tau蛋白[8]。蛋白磷酸酶PP2A和PP2B在抑制AD患者腦中tau蛋白過度磷酸化方面起關(guān)鍵作用，PP2A是最具活性的蛋白磷酸酶，其活性占總活性的70%[9]。PP2A的表達量和活性的下降會導(dǎo)致tau 蛋白異常過度磷酸化最終導(dǎo)致 AD 的發(fā)生[10]。目前發(fā)現(xiàn)拮抗tau蛋白磷酸化的有效藥物成為主要的研究方向[11]。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎生髓，腦為髓?！保ㄟ^補腎填髓防治衰老引起的記憶力下降，中醫(yī)臨床應(yīng)用補腎中藥防治癡呆已有數(shù)千年歷史。山茱萸作為傳統(tǒng)補腎中藥，具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，對于AD疾病的治療具有較大優(yōu)勢。馬錢苷為山茱萸有效成分之一，其用于治療AD疾病鮮有報道。本實驗通過tau蛋白過度磷酸化擬AD細(xì)胞模型初步探討馬錢苷對tau蛋白過度磷酸化的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

1)藥物：馬錢苷購自中國藥品生物制品檢定研究院，實驗中采用干粉劑量，溶解于蒸餾水，制成藥液應(yīng)用。

2)主要試劑：Wortmannin(WT，Enzo Life Sciences公司，美國)；GF-109203X(GFX)、Aprotinin、leupeptin、多聚賴氨酸Poly-D-lysine(PDL)、兔抗-β-tubulin 抗體、Triton X-100(Sigma-Aldrich公司，美國)；Cock tail(Roche公司，美國)；DMEM(1:1)基礎(chǔ)培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco BRL公司，美國)；Opti-MEM(Invitrogen公司，美國)；Alexa Fluor 488結(jié)合的羊抗小鼠IgG熒光二抗(Jackson公司，美國)；RC-DC protein assay(500-0122-MSDS，Bio-Rad公司，美國)；主要抗體詳見表1。

表1 本實驗中的主要抗體

Tab.1 Primary antibodies used in this study

AntibodyTypeSpecificityPhosphorylationsitesSourcepT205Poly?P?tauThr181InvitrogenpS396Poly?P?tauSer396InvitrogenPHF?1Mono?P?tauSer396/404Abcamp?GSK?3βPoly?P?GSK?3βSer9CellsignalingGSK?3βPoly?GSK?3βSantacruzdm?PP2AcMono?DemethylatedPP2AcMilliporep?PP2AcPoly?p?PP2ATyr307SantacruzPP2AcPoly?PP2ASantacruzGAPDHMono?GAPDHZSGB?BIO

3)主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(Tc2323 型，美國SHELL/JB公司)；超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；超低溫冰箱(MDFU5410型，日本三洋公司)；全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Spectrum，法國巴德斯公司)；電子天平(BS210S，北京賽多利斯天平有限公司)；高壓蒸汽滅菌器(YXQ-SG41-280，上海醫(yī)用儀器廠)；低溫高速臺式離心機(Beckman 22R，美國)；旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器(DSHZ-300A，江蘇太蒼市實驗設(shè)備廠)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、垂直型電泳槽、凝膠電泳分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 實驗方法

1)細(xì)胞培養(yǎng)：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SK-N-SH細(xì)胞)在5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)基[90%(體積分?jǐn)?shù))DMEM, 10%(體積分?jǐn)?shù))FBS]用蔡氏濾器真空負(fù)壓過濾除菌。細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長至60%～70%豐度時，傳代或用于實驗。將不同濃度馬錢苷(500、1 000 mmol/L)與人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SK-N-SH細(xì)胞預(yù)孵育24 h后棄去藥液，加入WT及GF-109203X(濃度均為10 μmol/L)處理SK-N-SH細(xì)胞3 h后，收集細(xì)胞進行裂解，備后續(xù)實驗使用。

2)免疫印跡：將12孔板中的培養(yǎng)基吸出，加入PBS將培養(yǎng)基沖洗干凈，加入RIPA裂解液輕輕吹打培養(yǎng)好的SK-N-SH細(xì)胞使其懸浮，吸出細(xì)胞懸液進行裂解，之后采用RC-DC protein assay測定樣品蛋白質(zhì)的量。蛋白經(jīng) SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，與上述一抗、二抗孵育后，在暗室將超級化學(xué)發(fā)光底物A液與B液等量混合，立即加到膜上，0.8 mL/膜，滴勻液體，反應(yīng)2 min，然后用濾紙吸去多余熒光劑，將膜放到化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中曝光10 s～5 min。將圖片存為TIFF格式。選擇曝光度適中，條帶較為清晰的TIFF圖片采用TINA軟件進行分析，計算出各組對應(yīng)條帶整合灰度值同GAPDH的相對百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 馬錢苷對WT/GFX模型細(xì)胞tau蛋白過度磷酸化的影響

馬錢苷500、1 000 μmol/L與SK-N-SH細(xì)胞共同孵育24 h后棄去藥液，之后給予WT/GFX(濃度分別為10 μmol/L)處理3 h后，收集細(xì)胞，采用Western blotting檢測tau蛋白的磷酸化水平。tau蛋白在Thr205、Thr217、PHF-1(特異識別磷酸化的Ser396/404位點)等位點發(fā)生磷酸化增高(P<0.05)。馬錢苷500 μmol/L與細(xì)胞孵育24 h能夠明顯降低模型細(xì)胞內(nèi)tau在Thr217、PHF-1位點的磷酸化水平(P<0.05)；馬錢苷1 000 μmol/L能夠明顯降低模型細(xì)胞tau蛋白在上述位點的磷酸化水平(P<0.05)(圖1)。

圖1 馬錢苷對WT/GFX模型細(xì)胞tau蛋白多個位點磷酸化的影響

Fig.1 Loganin inhibits tau hyperphosphorylationinduced by WT/GFX in SK-N-SH cells

2.2 馬錢苷對WT/GFX模型細(xì)胞GSK-3β磷酸化的影響

與對照組相比，WT/GFX能夠明顯抑制GSK-3β的磷酸化(P<0.01)。馬錢苷與細(xì)胞預(yù)孵育24 h，未能增高WT/GFX模型細(xì)胞AKT/GSK-3β磷酸化水平；提示馬錢苷降低tau蛋白磷酸化并非通過作用GSK-3β-ser9磷酸化而實現(xiàn)(圖2)。

2.3 馬錢苷對WT/GFX模型細(xì)胞PP2A亞基C(PP2Ac)甲基化及磷酸化修飾的影響

SK-N-SH細(xì)胞經(jīng)WT/GFX處理3 h后，細(xì)胞內(nèi)PP2Ac Leu309位點去甲基化無明顯變化，但其磷酸化明顯增加(P<0.05)。馬錢苷500、1 000 μmol/L預(yù)孵育24 h能夠明顯抑制模型細(xì)胞PP2Ac的磷酸化(P<0.05)，但對PP2Ac的甲基化水平無明顯影響(圖3)。

圖2 馬錢苷對WT/GFX模型細(xì)胞GSK-3β表達及其磷酸化的影響

Fig.2 Loganin did not alter the phosphorylation level of GSK-3β in SK-N-SH cells

##P<0.01vscontrol.SK-N-SH cells were pre-treated with Loganin (500、1 000 μmol/L) for 24 h, and then exposed to 10 μmol/L WT/GFX for 3 h after washing out Loganin. A: Western blotting analysis was used for determination of the levels of phosphorylated-GSK-3β at Ser9 and GSK-3β. B: Semi-quantitative analysis of the levels of phosphorylated-GSK-3β at Ser9 and GSK-3β. GAPDH was used as an internal control. Data were expressed as themean±SEof 3 experiments.

圖3 馬錢苷對WT/GFX模型細(xì)胞PP2Ac甲基化及磷酸化修飾的影響

Fig.3 Loganininhibits phosphorylation level of PP2Ac in SK-N-SH cells but not demethylation of PP-2Ac

#P<0.05vscontrol;*P<0.05 vs the WT/GFX model group. A: The representative Western blotting image of phosphorylation (p) of PP-2Ac at Tyr307, demethylation (DM) of PP-2Ac at Leu307 and total PP2Ac. B: Semi-quantitative analysis of the levels of phosphorylation and demethylation of PP-2Ac and total PP2Ac.GAPDH was used as an internal control. Data were expressed as themean±SEof 3 experiments.

3 討論

糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)可促進tau在多個位點的磷酸化[12-13]。GSK-3β的活性主要由Ser9位點的磷酸化調(diào)節(jié)，Ser9為其負(fù)調(diào)節(jié)因子，其磷酸化的降低能夠增加GSK-3β的活性[14-15]。GSK-3β-Ser9位點的磷酸化主要由蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB；又稱為Akt)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、p90Rsk等進行調(diào)節(jié)。Wortmannin(WT；PI3K的抑制劑)與GF-109203X(GFX；PKC的抑制劑)聯(lián)合應(yīng)用造模，可以導(dǎo)致GSK-3β活性增加(>12 h)，引起tau蛋白在ser396/ser404和ser199/ser202等位點的磷酸化增高[16-17]。本實驗顯示W(wǎng)T/GFX能夠明顯抑制GSK-3β-Ser9的磷酸化，與報道[15-16]一致。但是馬錢苷并未逆轉(zhuǎn)WT/GFX引起的GSK-3β-Ser9的磷酸化減少，但是筆者發(fā)現(xiàn)馬錢苷對tau蛋白多個位點的磷酸化水平仍然有明顯的抑制作用。提示馬錢苷抑制tau蛋白磷酸化的作用不是通過影響GSK-3β相關(guān)通路實現(xiàn)的。

近年來研究[18]顯示，GSK-3β與PP2A之間存在交互作用。馬錢苷是否通過作用于PP2A而降低tau蛋白的過度磷酸化呢？本實驗進一步探討馬錢苷對PP2A活性及表達的影響。PP2A活性主要受PP2A催化亞基C(PP2Ac)翻譯后修飾調(diào)節(jié)。催化亞基C的翻譯后修飾主要包括其Leu309位點的去甲基化及Tyr307位點的磷酸化，二者表達上調(diào)均能降低PP2A的活性[19-20]。已有研究[20-21]表明，GSK-3β活性的增加能夠下調(diào)PP2A活性。因此，在WT/GFX損傷細(xì)胞模型上，筆者發(fā)現(xiàn)PP2Ac磷酸化明顯增加，去甲基化水平?jīng)]有明顯變化，因此推斷GSK-3β可能通過增加PP2Ac的磷酸化抑制PP2A活性。馬錢苷能夠明顯抑制PP2Ac在Tyr307位點的磷酸化水平，對其Leu309位點的甲基化無明顯影響，因此，馬錢苷抑制tau蛋白過度磷酸化，可能是通過抑制PP2A催化亞基C的磷酸化，提高PP2A活性而實現(xiàn)，與GSK-3β活性及表達的調(diào)節(jié)無關(guān)。本實驗初步明確了馬錢苷對PP2A催化亞基C的調(diào)節(jié)作用及在降低tau蛋白過度磷酸化中的作用，這為進一步探討馬錢苷拮抗tau蛋白磷酸化機制奠定了基礎(chǔ)，也為研發(fā)治療AD的藥物提供了可靠的臨床前實驗數(shù)據(jù)。

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編輯 陳瑞芳

Loganin attenuates tau hyper-phosphorylation by inhibiting phosphorylation of PP2A catalytic subunit C

Yang Cuicui, Li Lin, Zhang Li, Li Yali, Zhang Lan*

(DepartmentofPharmacology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingEngineeringResearchCenterforNerveSystemDrugs,BeijingInstituteforBrainDisorders,KeyLaboratoryforNeurodegenerativeDiseasesofMinistryofEducation,Beijing100053,China)

Objective To investigate the effects and mechanisms of Loganin on tau phosphorylation.Methods Human neuroblastoma SK-N-SH cells were pre-incubated with Loganin (500 μmol/L,1 000 μmol/L, respectively) for 24 h, and then exposed to 10 μmol/L WT and 10 μmol/L GFX for 3 h after washing out Loganin. Western blotting was used to measure the phosphorylation level of tau protein at Thr205, Thr217, PHF-1 sites, glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β), protein phosphatase 2A catalytic subunit C (PP2Ac) and the related proteins in the signaling pathway. Results WT/GFX inhibited the phosphorylation of GSK-3β-ser9, increased tau phosphorylation in SK-N-SH cells. Pre-incubation with Loganin significantly attenuated hyperphosphorylation of tau at Thr205，Thr217，PHF-1 sites in the model cells. Loganin did not reverse the decrease in p-GSK3β-ser9 induced by WT/GFX, suggesting that the effect of Loganin’s inhibiting tau hyperphosphorylation may be independent of GSK-3β pathway. However, Loganin reduced the phosphorylation of PP2Ac at Tyr307, but not demethylation of PP2Ac at Leu309 in the WT/GFX-treated cells. Conclusion Loganin attenuated the hyperphosphorylation of tau at multiple sites by reducing the phosphorylation of PP2Ac in Alzheimer’s disease-like cell model, independent of regulating GSK-3β.

Loganin; tau hyperphosphorylation; glycogen synthase kinase-3β; protein phosphatase 2A; Alzheimer’s disease

國家自然科學(xué)基金項目(81473373),北京市自然科學(xué)基金項目(7164315),北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才(2014-2-014),北京市新世紀(jì)百千萬人才工程(008-0014)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81473373), Natural Science Foundation of Beijing (7164315), Beijing Health and Technical Personal of High-Level Plan (2014-2-014), Beijing New Century Talented Person Project(008-0014).

時間：2016-12-14 20∶13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20161214.2013.020.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.06.014]

R 749.1

2016-10-14)

*Corresponding author， E-mail：lanizhg@126.com