葡萄酒中5-羥甲基糠醛含量的測定

劉　青，李志勇，張洋子，龐世琦，潘丙珍

(1.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東廣州510623； 2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東廣州510623)

葡萄酒中5-羥甲基糠醛含量的測定

劉青1，2，李志勇1，2，張洋子1，2，龐世琦1，2，潘丙珍1，2

(1.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，廣東廣州510623； 2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣東廣州510623)

葡萄酒中的5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfura，5-HMF）是生產及儲存過程中由熱降解反應而生成的產物，可以作為衡量葡萄酒是否過度受熱和儲存時間是否過長的指標。研究建立了高效液相色譜測定葡萄酒中5-HMF的方法，方法準確靈敏，重復性好。采用該法對我國河北昌黎、膠東半島、天津和甘肅4個葡萄酒產區(qū)，以及法國、澳洲、葡萄牙和南非等41支國產和進口葡萄酒中的5-羥甲基糠醛含量進行測定，檢出樣品中羥甲基糠醛的含量范圍為1.25～85.5mg/L。實驗結果為我國葡萄酒品質監(jiān)控提供有益的參考。

葡萄酒； 5-羥甲基糠醛； 高效液相色譜

5-羥甲基糠醛（5-HMF），又名5-羥甲基-2-呋喃甲醛，廣泛存在于含糖類物質的食品中，如果汁、啤酒、蜂蜜、牛奶和果酒等[1]。葡萄酒由于生產及儲存過程中不可避免發(fā)生熱降解反應（蔗糖的焦化及還原糖的分解）從而導致5-HMF的產生或含量增加[2-3]。近年來，5-HMF的含量已成為衡量許多食品是否過度受熱和儲存時間是否過長的指標。

研究表明，5-HMF可能會引發(fā)并促進結腸小囊異常生長（ACF），還具有一定程度的基因毒性[4]。一定劑量的5-HMF被機體吸收后，會對眼、黏膜或皮膚有刺激性攝入過多會引起中毒，造成動物橫紋肌麻痹和肝臟、腎臟、心臟等內臟器官損害[2-3，5]。目前國際上對5-HMF的毒副作用仍存有爭議，歐盟食品安全委員會食品添加劑香料、加工助劑及食品接觸材料科學小組認為每人每天攝入HMF的上限為1.6mg[3]，但也有相關文獻報道5-HMF的每日允許攝入量為30～60mg[5]。國外多個食品協會已規(guī)定部分食品中5-HMF的含量，如美國香味料和萃取物質制造者協會規(guī)定5-HMF在酒類中的限量為10.0mg/kg[3]。然而，目前我國大部分食品中5-HMF的含量尚未有明確的限量標準，僅有國家標準GH/T 18796—2012《蜂蜜》規(guī)定了蜂蜜中5-HMF的限量為40mg/kg[6]，其他食品包括葡萄酒均無限量要求。在GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中也并未規(guī)定5-HMF的限量要求，且允許按實際生產需求添加[7]。

食品中5-HMF的測定方法多使用紫外吸光光度法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜法或氣相色譜-質譜法[8-15]，所適用的檢測對象主要是啤酒、黃酒、蜂蜜、乳制品等食品[9-13]。本文通過實驗，建立了葡萄酒中5-羥甲基糠醛的檢測方法，方法操作簡便，準確靈敏，能夠滿足日常進出口葡萄酒該指標的檢測需要。采用所建立的方法對國產和進口的多支葡萄酒進行了檢測，效果滿意。

表1　葡萄酒樣品信息匯總

1　材料與方法

1.1材料及儀器

樣品：由超市購買、產地采樣等方式，收集到我國膠東半島、河北昌黎、天津和甘肅4個葡萄酒產區(qū)及日常進口法定委托檢驗的葡萄酒共計41個樣品。樣品情況匯總見表1。

試劑：5-羥甲基糠醛標準物質（純度≥98%，CAS編號：67-47-0，購自Aldrich公司）；甲醇（色譜純）；水采用GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》[16]中規(guī)定的一級水。水相微孔濾膜：0.45μm。

儀器設備：高效液相色譜儀Waterse2695：配有二極管陣列檢測器，美國Waters公司；水平振蕩器；超聲波水浴；分析天平：感量0.01g。

1.2實驗方法

1.2.1樣品預處理

用移液管準確量取10.0m L的試樣（起泡酒需預先脫氣：將100m L試樣倒入帶排氣塞的瓶中，在室溫下使用水平振蕩器或超聲波水浴脫氣，直至無氣泡逸出）至100m L的容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容到刻度，混合均勻后經濾膜過濾后待測。

1.2.2標準品配制

標準儲備液：準確稱取適量的5-羥甲基糠醛的標準物質，用10%甲醇水溶液配制成濃度為200mg/L的標準儲備溶液。該溶液在密封的棕色瓶中于0～4℃下可保存2～3個月。

標準中間溶液：準確量取標準儲備溶液10.0m L于100m L容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，配成濃度為20.0mg/L的標準中間溶液。該溶液在密封的棕色瓶中于0～4℃下可保存2～3個月。

標準工作溶液：分別準確量取標準中間溶液0.05m L、0.1m L、0.25m L、0.5m L、1.0m L、2.5m L于10m L容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，分別配成0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L的標準工作溶液，現配現用。

1.2.3液相色譜條件

色譜柱：Welch Ulitimate C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：甲醇+水（1+9，v/v）；檢測波長：284 nm；進樣量：10μL；流速：1.0m L/m in。

1.2.4結果的計算

在上述的色譜條件（1.2.3）下，標準工作溶液和樣品試液中的5-羥甲基糠醛經反相液相色譜柱分離后，在二極管陣列檢測器284 nm處進行檢測，以保留時間對樣品，結合光譜圖進行定性，標準曲線外標法對樣品進行定量。5-羥甲基糠醛的參考保留時間為10.6m in。在相同實驗條件下，樣品與標準品工作溶液中待測物質的色譜峰相對保留時間的偏差應在2.5%以內。同時進行空白對照實驗，除不添加樣品試液外，其余步驟相同。

試樣中5-羥甲基糠醛的含量由色譜數據處理軟件或按式(1)計算獲得，計算結果應扣除空白值。

式中：X——試樣中5-羥甲基糠醛的含量，mg/L；

C——從工作曲線求得的試樣溶液中5-羥甲基糠醛的含量（扣除空白），mg/L；

V——試樣最終的定容體積，m L；

L——試樣的取樣體積，m L。

計算結果用平行測定的算數平均值表示，保留2位有效數字。

2　結果與討論

2.1方法的驗證

2.1.1檢出限和定量限

方法的檢出限采用添加法進行實際測定得到?；诟怕式y計學的原理，即通過檢測目標物質5-HMF在葡萄酒典型代表基質——紅葡萄酒、白葡萄酒和起泡酒中被有效檢出的概率達到95%時的濃度水平來確定。對于葡萄酒的3種典型基質，以剛好能被有效檢出的濃度水平作為參考濃度，以1～2倍該濃度水平作為參考檢出限LODR獨立檢測6個以上，計算出其標準偏差SD值；以LODR-3SD、LODR、LODR+3SD 3個濃度水平分別檢測20個標準物質，剛好有19個樣品能被有效檢出的濃度即為該方法的檢出限。

綜合3種基質檢出限的驗證試驗，該方法葡萄酒中5-HMF的檢出限為0.3mg/L。根據定量限須滿足“≥3倍檢出限”或其信噪比≥10，初步得出定量限為1.0mg/L。

2.1.2方法線性范圍和回歸方程

選擇0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L共7個不同濃度標準溶液，通過平行測定6次來進行驗證，以5-HMF濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性回歸方程為y=6.62e+ 004X-1.80e+003，相關系數0.9997，該結果表明，在0.05～5.0mg/L濃度范圍內，峰面積與5-HMF濃度呈現出良好的線性關系。

2.1.3正確度（回收率）和重復性

本方法的正確度是通過在空白基質中加標測定回收率來進行驗證。分別選擇以定量限、5倍定量限、10倍定量限、20倍定量限4個水平進行回收率試驗，每個水平重復進行6次平行單獨測定，測定結果詳見表2。結果表明，該方法測定3種典型葡萄酒基質中5-HMF含量的總體平均回收率為88.4%～105.3%，方法的相對標準偏差為0.268%～3.74%，能夠滿足日常檢測需要。

表2　3種典型葡萄酒基質中5-HMF回收率和重復性結果

2.1.4穩(wěn)健性

為了驗證方法的穩(wěn)健性，選取了本次實驗過程中的主要變量因素，每個變量取2個不同的水平，采用8種組合方式，分別對紅葡萄酒和起泡葡萄酒進行分析方法的穩(wěn)健性實驗，實驗結果分別見表3、表4。

表3　紅葡萄酒穩(wěn)健性實驗結果

表4　起泡酒穩(wěn)健性實驗結果

對以上數據進行差值檢驗，將8個測定值按因素字母的順序分成2組，計算各個因素的影響，如第一個因素柱溫變化的影響可由1/4（s+t+u+v）和1/4（w+x+y+z）之間的差值di給出，其他幾個因素依次類推。再根據公式計算環(huán)境等因素引起的標準偏差，對紅葡萄酒的5種因素2個水平和起泡葡萄酒的7種因素2個水平進行數據統計，結果分別見表5和表6。通過將差值di與該分析方法在相同條件下重復測定的2倍標準偏差相比較，差值di均遠遠小于2倍方法標準偏差，說明該方法穩(wěn)健性良好，各因素對該方法及其結果不會造成顯著影響，即檢測中某個因素參數產生微小變動后仍能獲得較為一致、穩(wěn)定的實驗結果。

表5　紅葡萄酒穩(wěn)健性驗證試驗的數據統計

表6　起泡酒穩(wěn)健性驗證試驗的數據統計

2.2葡萄酒樣品中5-HMF含量的測定

使用本方法對收集的41個葡萄酒樣品進行了檢測，檢測結果見表7。

表7　葡萄酒樣品中5-HMF含量分析結果

由表7可知，有11個葡萄酒樣品中檢出5-HMF，多為半干白葡萄酒和冰葡萄酒，含量范圍為1.25～85.5mg/L，其中甘肅冰葡萄酒中5-HMF含量高達85.5mg/L。結合葡萄酒樣品中總糖含量檢測結果和瓶標酒精度值分析，三者存在一定的相關性，即總糖含量高且酒精度相對較低的樣品，如半干白葡萄酒和冰葡萄酒中5-HMF含量偏高。這可能與葡萄酒釀造工藝有關系，如使用熱浸提法釀造葡萄酒或添加葡萄濃縮汁生產的葡萄酒可能會產生5-HMF或使其含量升高[17]。樣品中檢出5-羥基甲糠醛的色譜圖和與標準的光譜比較圖分別見圖1和圖2。

圖1　冰葡萄酒中檢出5-HMF的色譜圖

圖2　冰葡萄酒中檢出5-HMF與標準的光譜比較圖

3　結論

本實驗經研究建立了葡萄酒中5-HMF的高效液相色譜檢測方法，方法操作簡單，靈敏度高，穩(wěn)健性好。采用該方法對41個進口和國產不同類型的葡萄酒樣品進行檢測，結果表明，葡萄酒中酒精度偏低、總糖含量高的半干白葡萄酒和冰葡萄酒中，5-HMF含量相對較高。日常對葡萄酒中5-HMF的監(jiān)控，應將半干的白葡萄酒和冰葡萄酒作為重點關注對象。

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Determ ination of 5-HydroxymethylfurfuralContent inW ine

LIU Qing1,2,LIZhiyong1,2,ZHANG Yangzi1,2,PANG Shiqi1,2and PAN Bingzhen1,2
(1.TechnicalCenterofguangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou,Guangdong 510623;2.Guangdong Key Lab of Importand ExportTechnicalMeasuresof Animal,Plantand Food,Guangzhou,Guangdong 510623,China)

5-hydroxymethylfurfural isa productderived from the thermaldegradation reaction during the production and the storage ofw ine.It is an indicator to judgewhether thew ine is overheated/the storage time is too long.In this study,themethod of detecting 5-HMF content in w ine by HPLC had been developed.Such method had the advantages including high accuracy,good sensitivity andgood reproducibility.5-HMF content in 41 domestic and imported w ine samples(from Changli,Shandong,Tianjing andgansu/from French,Australia,Portugal,etc.) was detected in the experimentsand the contentof 5-HMF of all detected sampleswas in the range of 1.25～85.5mg/L.The experimental results provided useful references formonitoringgrapew ine quality.

grapew ine;5-hydroxymethylfurfural;HPLC

TS262.6；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286(2016)11-0107-05

10.13746/j.njkj.2016220

廣東省科技廳國際合作項目（2013B051000068）；廣東省科技廳公益項目（2014A04041065）；廣東檢驗檢疫局科技項目（2015GDK36）。

2016-07-06

劉青（1971-），碩士，主要研究方向為食品質量安全檢測，色譜、色譜質譜等檢測技術應用等，E-mail：gdciqlq@163.com。

優(yōu)先數字出版時間：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.0937.004.htm l。