旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)結(jié)合GC-MS/MS測定白酒中氨基甲酸乙酯

馮向東，蔡開云，周　丹

(湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司，湖北宜昌443100)

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)結(jié)合GC-MS/MS測定白酒中氨基甲酸乙酯

馮向東，蔡開云，周丹

(湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司，湖北宜昌443100)

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC），是發(fā)酵食物和酒精飲品在發(fā)酵或貯存過程中天然產(chǎn)生的一種致癌性污染物。以D5-氨基甲酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)結(jié)合GC-MS/MS法分析測定白酒中EC含量，完善優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析得到最佳旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為40℃。此條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間約為15min，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.99996,檢出限為0.6μg/L，加標(biāo)回收率在97.5%～100.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均＜5%，能夠滿足白酒中EC檢測分析需要。

白酒； 氨基甲酸乙酯； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；gC-MS/MS

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是發(fā)酵食物和酒精飲品在發(fā)酵或貯存過程中天然產(chǎn)生的污染物[1-2]。不同種類的酒精飲品的EC含量差異很大，例如水果白蘭地中EC含量平均值是啤酒的600倍以上。酒精飲品中的各種物質(zhì)及其分解物經(jīng)發(fā)酵過程后均可產(chǎn)生EC。這些前體物質(zhì)（如尿素、氰酸酯和瓜氨酸）與乙醇發(fā)生化學(xué)作用，在酒精飲品中產(chǎn)生EC，而產(chǎn)生的數(shù)量取決于光線和溫度兩大要素[3]。

食物內(nèi)的EC可能令人類患癌，因而引起公眾的關(guān)注。實(shí)驗(yàn)顯示，EC可令實(shí)驗(yàn)動物患上各類癌癥。2007年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)把EC重新分類為第2A組（“可能令人類患癌的物質(zhì)”）[4-5]。EC潛在的致癌性促使許多國家和機(jī)構(gòu)制定了其在發(fā)酵食品和酒精飲料中的限量標(biāo)準(zhǔn)，加拿大的衛(wèi)生與預(yù)防部門規(guī)定，蒸餾酒中EC含量不得超過150μg/L[6]。

目前國內(nèi)針對EC的測定均采用GB 5009.223— 2014《食品中氨基甲酸乙酯的測定》標(biāo)準(zhǔn)。但檢測過程中發(fā)現(xiàn)以下幾個問題：①樣品前處理過程大量使用易揮發(fā)性有毒有害化學(xué)試劑，給環(huán)境和人體帶來污染和危害，尤其是正己烷和乙醚；②樣品在使用氮?dú)獯蹈傻倪^程中，乙醚揮發(fā)出來，乙醚的蒸汽與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、熱極易爆炸燃燒，給實(shí)驗(yàn)室和測試人員帶來安全隱患；③樣品前處理耗時長，效率不高；④檢測結(jié)果的重現(xiàn)性差。

郭學(xué)武等[7-8]在《GC-MS測定白酒中氨基甲酸乙酯不同預(yù)處理方法的比較》中總結(jié)了前人改進(jìn)后的3種樣品預(yù)處理方法分別是：固相萃?。⊿PE）、固相微萃?。⊿PE）、雙水相萃?。↙LE）。雖然相對于國標(biāo)方法有所改進(jìn)，但操作過程依舊繁瑣、成本高、有機(jī)溶劑用量大。本實(shí)驗(yàn)采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)結(jié)合GC-MS/MS法，以D5-氨基甲酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，建立快速、準(zhǔn)確檢測白酒中EC的方法，避免正己烷和乙醚等有毒有害試劑在測試中的使用，同時縮短樣品前處理時間，提高檢測效率。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

酒樣：市售某白酒樣品。

儀器：Agilent7890A-7000B三重四級桿串聯(lián)氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；無水硫酸鈉小柱（2g,6m L）,ANPEL Laboratory Technology公司。

試劑：EC標(biāo)準(zhǔn)品溶液（CAS:51-79-6,濃度100μg/m L，純度99.50%），ChemService公司；D5-氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）,德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇，色譜純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1儀器條件

色譜條件：色譜柱：ZB-WAXplus石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：初始柱溫80℃，保持0m in,以10℃/m in升至180℃，保持0min,再以50℃/m in升至250℃，保持5m in；載氣：氦氣（純度＞99.999%）,流速1m L/m in；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1μL。

質(zhì)譜條件：接口溫度280℃，電離方式：電子轟擊源（EI）；監(jiān)測方式：MRM；EC、D5-EC定量離子分別為m/z：62和m/z：64；電離能量：70 eV；溶劑延時：5m in。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）EC標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/m L的EC標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

（2）D5-EC標(biāo)準(zhǔn)溶液。儲備液：取0.1g D5-EC標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇定容至100m L的容量瓶中，配制成1mg/m L的儲備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液：取1m L D5-EC儲備液用甲醇定容至100m L，即為10mg/L的D5-EC內(nèi)標(biāo)使用液。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的配制：用移液槍分別準(zhǔn)確吸取100μg/m L EC標(biāo)準(zhǔn)溶液0μL、10μL、20μL、30μL、50μL、100μL于6個25m L的容量瓶中，各加入10mg/L的D5-EC內(nèi)標(biāo)使用液250μL，用甲醇定容至刻度。得到0、40μg/L、80μg/L、120μg/L、200μg/L、400μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，每個容量瓶中內(nèi)標(biāo)物D5-EC的濃度均為100μg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液依次進(jìn)行GC-MS/MS分析，對EC-D5EC峰面積比值和EC-D5EC濃度比繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出其回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4樣品的處理與測定

準(zhǔn)確稱取5g（精確至0.01g）白酒樣品，加入50μL 10mg/L D5-EC內(nèi)標(biāo)使用液，搖勻后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以一定溫度濃縮至近干（約0.5m L），加甲醇2m L搖勻后過無水硫酸鈉小柱，收集濾液，供GC-MS/MS分析。

2　結(jié)果與討論

2.1線性關(guān)系及檢出限

按1.2.2的方法繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，其中ECD5EC峰面積比值為Y軸，EC-D5EC濃度比為X軸。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

由圖1可知，其回歸方程為Y=1.300943X，相關(guān)系數(shù)R2=0.99996，可見該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系較好，滿足分析的要求。按信噪比S/N＝3推算，檢出限為0.6μg/L。

2.2樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化及回收率

在1.2.4樣品的處理中的關(guān)鍵點(diǎn)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的溫度控制，需要設(shè)置合適的蒸發(fā)溫度以使白酒中干擾EC測定的物質(zhì)去除，并且溫度不能過高，以防止白酒樣品中氨基甲酸乙酯揮發(fā)而造成測試結(jié)果不準(zhǔn)確。

2.2.1不同蒸發(fā)溫度下測試結(jié)果及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

酒樣Y和加入一定EC標(biāo)準(zhǔn)溶液提高EC濃度后的酒樣Y，分別經(jīng)40℃、50℃、60℃、70℃、80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理，經(jīng)GC-MS/MS分析，測定結(jié)果對比見表1。

表1　不同蒸發(fā)溫度下酒樣Y的EC測試結(jié)果及加標(biāo)后回收率

由表1可知，在40～80℃的5個梯度溫度下，樣品Y（未加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）的EC測試結(jié)果在89.9～93.7μg/L之間，計(jì)算得RSD值為1.58%＜5%?？梢娫跇悠返蜐舛葧r（約＜100μg/L），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度變化對樣品測試的結(jié)果基本無影響。

表2　40℃蒸發(fā)溫度下酒樣Y不同濃度的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

樣品Y在加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后，使其理論濃度提高120μg/L（＞200μg/L），再分別經(jīng)過40～80℃的5個梯度溫度旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，經(jīng)GC-MS/MS分析測試。結(jié)果顯示，加標(biāo)回收率在40℃較好，為95.6%；50℃回收率較低，僅為74.5%；隨著溫度升高，加標(biāo)回收率降低，80℃僅為67.8%。由此得出，樣品高濃度條件（＞200μg/L）時，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度對測試結(jié)果準(zhǔn)確度影響較大，分析原因可能是EC沸點(diǎn)為182～184℃，隨著溫度升高，樣品中一部分EC揮發(fā)出去，造成測試結(jié)果偏低。

由上述實(shí)驗(yàn)初步得出，最佳的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度應(yīng)設(shè)置為40℃，此時樣品EC測試的準(zhǔn)確度較好。

2.2.240℃下不同濃度加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

酒樣Y加入一定梯度EC標(biāo)準(zhǔn)溶液提高EC濃度后，分別經(jīng)40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理，經(jīng)GC-MS/MS分析，測定結(jié)果對比見表2。

由表2可知，在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度下，酒樣Y不同濃度的加標(biāo)回收率在97.5%～100.5%之間，計(jì)算得RSD值為1.35%?；厥章屎芎?，能滿足不同濃度的樣品EC測試要求。所以選定該方案的關(guān)鍵條件旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為40℃，此時旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間約為15m in。

2.3精密度

取2種白酒樣品按照上述方法進(jìn)行樣品處理（旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度40℃）和分析檢測，每個樣品做6次平行試驗(yàn)，計(jì)算該方法的精密度，結(jié)果見表3。

表3　測試方法的精密度　(μg/L)

由表3可知，實(shí)驗(yàn)中測試2種酒樣EC含量的RSD值分別為1.0%和2.4%（＜5%,差異極不顯著）。說明分析方法具有良好的重現(xiàn)性，可以滿足白酒中EC的檢測分析。

3　結(jié)論

以D5-氨基甲酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)結(jié)合GC-MS/MS法分析測定白酒中EC含量，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析得到最佳旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為40℃，此條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時間約為15m in，加標(biāo)回收率在97.5%～100.5%之間。2種酒樣EC精密度實(shí)驗(yàn)RSD均＜5%，具有較好的重現(xiàn)性，能夠滿足白酒中EC檢測的分析需要。

該方法對白酒蒸餾技術(shù)改進(jìn)及自動化生產(chǎn)也提供了一種新思路。如果白酒中EC含量偏高，有給人體健康帶來危害的風(fēng)險，則可以采取控壓、控溫蒸餾的辦法，使低沸點(diǎn)的乙醇等香味物質(zhì)餾出，讓高沸點(diǎn)的EC殘留在原液中達(dá)到降低蒸餾酒中EC含量的目的，減少對人體健康危害的風(fēng)險。

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Detection of EC Content in Baijiu by Rotary Evaporation Coup led w ithgC-MS/MS

FENG Xiangdong,CAIKaiyun and ZHOU Dan
(Daohuaxiang Distillery Co.Ltd.,Yichang,Hubei443100,China)

EC is a kind of carcinogenic pollutants produced naturally in the fermentation/storage process of fermented food/alcoholic beverages.In this study,D5-EC used as the internal standard,rotary evaporation coupled w ithgC-MS/MSwasadopted formeasuring EC content in Baijiu.The optimum detection conditionswere summed up as follows:rotary evaporation temperaturewas at40℃,evaporation timewas 15 m in,R2=0.99996,the detection lim itwas 0.6μg/L,the recovery ratewasw ithin 97.5%～100.5%,and RSD＜5%.Suchmethod was suitable for the detection of EC content in Baijiu.(Trans.By YUEYang)

Baijiu;ethyl carbamate(EC);rotary evaporation;GC-MS/MS

TS262.3；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286(2016)11-0120-03

10.13746/j.njkj.2016201

2016-06-15

馮向東(1972-)，男，高級質(zhì)量工程師，一級食品檢驗(yàn)師，一級品酒師。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1025.004.htm l。