山東地區(qū)男性不育與CFTRCFTR基因M470VM470V多態(tài)性的關(guān)系

胡春風(fēng) 劉紅英

濰坊醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室（濰坊 261053）

山東地區(qū)男性不育與CFTRCFTR基因M470VM470V多態(tài)性的關(guān)系

胡春風(fēng) 劉紅英*

濰坊醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室（濰坊 261053）

目的 研究山東地區(qū)男性不育癥患者和正常男性中的囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CFTR）基因M470V多態(tài)性分布情況，探討CFTR基因M470V多態(tài)性與男性不育的關(guān)系。方法 收集臨床診斷明確的輕度少精子癥患者66例，重度少精子癥患者59例，無精子癥患者51例和生育力正常男性120例。外周血基因組DNA抽提，PCR技術(shù)擴(kuò)增CFTR基因外顯子10特定片段，Hph I限制性內(nèi)切酶酶切方法分析M470V基因型和等位基因分布頻率，DNA測(cè)序檢測(cè)M470V SNP類型，應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05視為有顯著性差異。結(jié)果 4組比較CFTR基因M470V 基因型和等位基因分布頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均＞0.05）。結(jié)論 CFTR基因M470V多態(tài)性與少精子癥及無精子癥無關(guān)。

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子; 不育,男性; 多態(tài)性, 單核苷酸

Key woorrddss cystic fi brosis transmembrane conductance regulator; infertility, male; polymorphism, single nucleotide

囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR）基因的突變可使健康男性出現(xiàn)先天性雙側(cè)輸精管缺如[1]、先天性單側(cè)輸精管缺如和梗阻性無精子癥或精子質(zhì)量下降，以至于造成男性不育[2-4]。M470V多態(tài)性是指CFTR基因外顯子10上1540位點(diǎn)A、G堿基替換導(dǎo)致的氨基酸的改變，為錯(cuò)義突變，其突變等位基因M/V多態(tài)性可影響CFTR蛋白氯離子通道的內(nèi)在活性[5-7]。雖然國(guó)外已有M470V多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道，但我國(guó)人群M470V位點(diǎn)在CFTR基因上的多態(tài)性分布尚不十分清楚。本次研究檢測(cè)精子發(fā)生正常男性人群與少精子癥患者以及無精子癥患者CFTR基因M470V多態(tài)性分布情況，探討山東地區(qū)男性不育與CFTR基因M470V多態(tài)性的關(guān)系。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及濰坊市人民醫(yī)院臨床診斷明確的輕度少精子癥男性患者66例，重度少精子癥男性患者59例，無精子癥男性患者51例以及生育力正常男性120例。所有患者均按照WHO第五版《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》精液常規(guī)分析標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，精液分析連續(xù)3次，精子濃度均在10×106～15×106/mL的患者診斷為輕度少精子癥，精子濃度均＜5×106/mL的患者診斷為重度少精子癥，精液離心沉淀鏡檢未見精子的患者診斷為無精子癥。采集外周血液標(biāo)本2mL，EDTA抗凝，-20℃冰箱冷凍保存。

二、方法

（一）基因組DNA的提取

使用DNA抽提試劑盒（TIANamp Blood DNA Midi Kit中量血液基因組DNA提取試劑盒-離心柱型，北京天根公司）提取基因組DNA，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。利用超微量分光光度計(jì)（Gene Company Limited基因有限公司）測(cè)定DNA的濃度，OD值介于1.8～2.0之間的DNA留用，否則重新抽提。將提取的基因組DNA進(jìn)行編號(hào)并冷凍保存于-80℃冰箱。

（二）引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)引物設(shè)計(jì)一般原則及參考文獻(xiàn)篩選上下游引物。上游引物：5’-TTGTGCATAGC AGAGTACCTGAAA-3’；下游引物：5’-GCTTCT TAAAGCATAGGTCATGTG-3’ 。該擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為539bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成、純化及鑒定。

（三）PCR技術(shù)

Golden Fast PCR Kit反應(yīng)體系為40μL，基因組DNA 200ng，上下游引物各2μL，2×Golden Fast Reaction Mix 20μL，Golden Fast DNA Polymerase 0.8μL [天根生化科技（北京）有限公司]，加滅菌去離子水至終體積40μL。反應(yīng)循環(huán)的參數(shù)為：94℃預(yù)變性 2min，94℃ 15 s，55℃ 5 s，72℃ 15 s，33個(gè)循環(huán)，72℃延伸2 min。反應(yīng)結(jié)束后取6μL擴(kuò)增產(chǎn)物，通過Gold ViewⅠ染色， 2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100V，時(shí)間為1h，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

（四）Hph I 限制性內(nèi)切酶酶切鑒定

酶切反應(yīng)體系為20μL：10×NEB緩沖液2μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，Hph1內(nèi)切酶0.5μL（NEB公司），加滅菌去離子水至終體積20μL。37℃溫育4h，8μL酶切產(chǎn)物上樣電泳，2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V，1h。凝膠成像系統(tǒng)分析并記錄、保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鑒定M470V基因分型。

（五）DNA測(cè)序

篩選出基因型為MM型和VV型的DNA樣本，經(jīng)PCR擴(kuò)增后送去南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，以檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目的片段以及擴(kuò)增條帶是否與電泳結(jié)果一致。

結(jié) 果

一、CFTRCFTR基因M470VM470V多態(tài)性位點(diǎn)PCR反應(yīng)結(jié)果

M470V多態(tài)性位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳圖，如圖1，片段長(zhǎng)度為539bp，選用marker為50～500bp。電泳條帶清晰、單一，特異性強(qiáng)。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖注：1～7分別為不同檢測(cè)對(duì)象的M470V位點(diǎn)PCR擴(kuò)增片段

二、CFTRCFTR基因M470VM470V位點(diǎn)Hph I ph I 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)結(jié)果

酶切反應(yīng)結(jié)果見圖2，選用的m a r k e r為50～500bp。單一條帶為純合子MM型，片段長(zhǎng)度為539bp；兩條條帶為純合子VV型，片段長(zhǎng)度分別為351bp和188bp；3條條帶為雜合子MV型，片段長(zhǎng)度分別為539bp，351bp和188bp。

三、DNADNA測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果見圖3，CFTR基因M470V位點(diǎn)堿基為A，編碼的氨基酸為Met；堿基為G，編碼的氨基酸為Val。

圖2 Hph酶切結(jié)果電泳圖注：不同檢測(cè)對(duì)象M470V位點(diǎn)酶切結(jié)果條帶

圖3 CFTR基因外顯子10M470V多態(tài)性測(cè)序圖

四、CFTRCFTR基因M470VM470V多態(tài)性位點(diǎn)基因型與等位基因頻率

分別記錄檢測(cè)結(jié)果（見表1）。該人群中M470V多態(tài)性位點(diǎn)有3種基因分型：MM型、VV型和MV型，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，利用x2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將P＜0.05設(shè)為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性界值。

表1 M470V多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率

五、結(jié)果分析

4 組比較CFTR基因M470V 基因型和等位基因分布頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值分別為0.744和0.422，P值均＞0.05），即CFTR基因M470V多態(tài)性與輕度少精子癥、重度少精子癥及無精子癥無關(guān)。MV基因型為最常見的基因型，在生育力正常男性人群中的基因型頻率為0.467，其次為VV基因型，基因型頻率為0.325，最少見的為MM基因型，基因型頻率為0.208。MM、VV、MV基因型在生育力正常男性人群中的分布符合哈迪-溫伯格平衡定律（x2=0.3472＜x20.05,1=3.84，P＞0.05）。V470等位基因?yàn)樯φＤ行匀巳褐凶畛Ｒ姷牡任换颍涞任换蝾l率為0.558，M470等位基因與V470等位基因在生育力正常的男性人群中是分布比例約為0.8:1，相比歐洲白種人（1:1）偏低。

討 論

CFTR基因于1989年被Riordan等[8]首次克隆并鑒定。CFTR基因定位于人類7號(hào)染色體長(zhǎng)臂（7q31.2），有27個(gè)外顯子，編碼一條含1480個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[9,10]。CFTR基因外顯子10上1540位點(diǎn)上堿基為A，編碼氨基酸為甲硫氨酸（Met）；堿基為G，編碼氨基酸為纈氨酸（Val）。M470V多態(tài)性本身與生育能力有關(guān)，歐洲人群Val470相比Met470生育能力更高[11]。為明確山東地區(qū)生育力正常男性人群與不育癥男性患者之間M470V的分布情況，本文檢測(cè)了正常男性人群與輕度少精子癥、重度少精子癥及無精子癥患者CFTR基因M470V多態(tài)性的分布情況。我們的結(jié)果顯示無顯著性差異。這可能是以往的研究M470V位點(diǎn)大多與CFTR基因上其他位點(diǎn)相結(jié)合，而單純的M470V改變?cè)谀行圆挥巳号c正常人群中可能并無差異。目前關(guān)于M470V的研究多與CFTR基因內(nèi)含子8上的TG重復(fù)次數(shù)、polyT相關(guān)，TG重復(fù)次數(shù)增加、polyT縮短與V470的結(jié)合均下調(diào)CFTR蛋白表達(dá)水平，導(dǎo)致先天性雙側(cè)輸精管缺如（CBAVD）發(fā)生增加，甚至睪丸生精功能下降[12]。因此我們下一步的研究還需要大量的拓展到CFTR基因上TG重復(fù)次數(shù)、polyT等基因突變位點(diǎn)，探討它們與M470V位點(diǎn)的作用相關(guān)性，進(jìn)一步分析它們之間與男性不育的關(guān)系[13]，進(jìn)而明確M470V與其他基因位點(diǎn)之間的協(xié)同作用。

目前對(duì)男性不育治療的常用方法是卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子顯微注射[14-16]技術(shù)。在美國(guó)及一些歐洲國(guó)家，CFTR基因多態(tài)性檢測(cè)已應(yīng)用于植入前遺傳學(xué)診斷[17,18]?；蛑委焄19]作為最常見的治療手段，其效果遠(yuǎn)沒有預(yù)期的好，但個(gè)性化治療具有美好的前景。

同時(shí)，我們的結(jié)果表明MM、VV、MV基因型在山東地區(qū)正常男性人群中的分布符合哈迪-溫伯格平衡定律，M470等位基因與V470等位基因在生育力正常的男性人群中分布比例約為0.8:1，相比歐洲白種人（1:1）偏低。M470V位點(diǎn)是否會(huì)有與其他基因位點(diǎn)突變的協(xié)同作用[20]而影響患者生育能力，有待進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究。

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（2016-07-25收稿）

The relationship between CFTR gene M470V polymorphisms and male infertility in Shandong province

Hu Chunfeng, Liu Hongying*
Department of Genetics, Weifang Medical University, Weifang 261053, China Corresponding author: Liu Hongying, E-mail: hongyingwf@163.com

Objectivee To study the distribution of CFTR gene M470V polymorphisms between the male infertility patients and normal fertile male population in Shandong province, and to explore the relationship between CFTR gene M470V polymorphisms and male infertility. Metthhooddss Collecting defi nite diagnosed mild oligozoospermia 66 patients; severe oligozoospermia 59 patients; 51 patients with azoospermia and 120 cases of normal fertile male. Peripheral blood genomic DNA extraction, PCR amplifi ed CFTR gene exon 10 specifi c fragment, Hph I restriction endonuclease digestion method of analysis M470V genotype and allele frequencies, DNA sequencing to detect M470V SNP types, and SPSS17.0 statistical analysis was performed using the chi-square test, P＜0.05 considered to have significant differences. Resullttss Comparing four groups CFTR gene M470V genotype and allele frequency there was no signifi cant difference (P＞0.05). Concluussiioonn There was no relation between CFTR gene M470V polymorphisms and oligozoospermia and azoospermia.

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.08.008

R 698.2

*通訊作者，E-mail: hongyingwf@163.com