凝血因子Ⅻ基因多態(tài)性與急性心肌梗死的關聯(lián)性研究

劉媚娜 金艷慧 程水兵 徐琦煜 劉歡樂 王明山

凝血因子Ⅻ基因多態(tài)性與急性心肌梗死的關聯(lián)性研究

劉媚娜 金艷慧 程水兵 徐琦煜 劉歡樂 王明山

目的 分析急性心肌梗死（AMI）患者凝血因子Ⅻ（FⅫ）基因多態(tài)性和急性發(fā)作時血漿凝血因子Ⅻ活性（FⅫ:C）的變化及意義。方法 收集97例AMI患者治療前及76例對照血液標本，采用直接測序法檢測FⅫ第46位基因多態(tài)性和一期凝固法檢測血漿FⅫ:C，并進行比較分析。結(jié)果 FⅫ基因C46T多態(tài)位點CC、CT、TT 3種基因型以及C、T等位基因頻率在AMI組與對照組中的分布均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。CC、CT和TT 3種基因型分別對應的血漿FⅫ:C水平有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），以CC組活性最高，TT組活性最低。AMI組血漿FⅫ:C顯著低于對照組（P＜0.01）。結(jié)論 FⅫC46T基因多態(tài)性與AMI無關聯(lián)，AMI發(fā)病時血漿FⅫ:C顯著降低，F(xiàn)Ⅻ參與血栓形成。

心肌梗死 凝血因子Ⅻ 基因多態(tài)性

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）屬于冠心病的急癥，血栓性事件是心肌梗死發(fā)生的關鍵。凝血因子Ⅻ（FⅫ）是內(nèi)源凝血途徑的啟動因子，主要由肝臟合成。目前普遍認為FⅫ并不是機體生理性凝血過程及止血機制所必需的凝血因子，F(xiàn)Ⅻ缺乏患者無臨床出血癥狀。血漿FⅫ活性與FⅫC46T基因多態(tài)性有關[1]。關于FⅫC46T基因多態(tài)性及血漿FⅫ活性（FⅫ:C）水平與心肌梗死的相關研究多有報道[2-3]，但結(jié)果不盡相同。最近有研究資料顯示[4]，抑制FⅫ可以阻遏血栓形成，使FⅫ作為靶點的抗栓物質(zhì)成為現(xiàn)代抗栓研究的新熱點。本研究通過觀察AMI患者FⅫC46T基因多態(tài)性的分布和急性發(fā)作時血漿FⅫ:C的變化，以探討FⅫC46T基因多態(tài)性與AMI的關系及血漿FⅫ:C變化對AMI的意義。

1 對象和方法

1.1 對象 AMI組97例為2014年2至7月在我院心內(nèi)科住院患者，其中男63例，女34例，年齡29～87（65.67±12.81）歲。AMI的診斷均按照世界衛(wèi)生組織對心肌梗死的診斷標準。所有患者均行冠脈造影術證實，其中75例患者術中植入支架，所有患者排除肝臟病變。對照組76例，選自2014年4至7月我院健康體檢者，其中男49例，女27例，年齡31～80（64.55±9.45）歲；經(jīng)病史詢問、體格檢查及實驗室檢查均未見異常，并排除心腦血管疾病史和患病家族史。兩組之間均無親緣關系。兩組性別及年齡構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=0.004，t=0.660，均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 AMI患者入院后在做冠脈造影術前，即刻抽取靜脈血，以0.109mol/L枸櫞酸鈉1：9抗凝，3 000r/min離心10min，取上層貧血小板血漿，分裝于eppen-droft管，并保存于-70℃低溫冰箱待測；同時用DNA提取試劑盒（上海賽百盛公司產(chǎn)品）抽提下層單個核細胞的基因組DNA，置-70℃冰箱保存。

1.2.2 FⅫ基因第46位多態(tài)性檢測 采用直接測序法。根據(jù)美國NCBI基因庫所公布的FⅫ基因序列（Gen-Bank AF538691）設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成。上游：5′-CCAGTCCCACTATCTAGAAAAG-3′，下游：5′-CTATCACAGCCATGAGCCAT-3′。聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，PCR擴增如下：95℃預變性5min，然后95℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物大小為594 bp，取PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳觀察結(jié)果，并將PCR產(chǎn)物原液送上海生工生物工程有限公司測序。用Chromas軟件將測序結(jié)果與FⅫ基因序列進行比對，確定第46位堿基多態(tài)性。

1.2.3 血漿FⅫ:C檢測 使用法國STAGO-STA自動血凝儀采用一期凝固法進行檢測（配套試劑由法國STAGO公司提供）。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗?；蛐秃偷任换蝾l數(shù)采用直接計數(shù)法統(tǒng)計，組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組FⅫC46T基因型和等位基因頻數(shù)分布比較 見表1。

表1 兩組FⅫC46T基因型和等位基因頻數(shù)分布比較[例（%）]

由表1可見，F(xiàn)Ⅻ基因C46T多態(tài)位點TT、CT、CC 3種基因型在兩組中的分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.715，P＞0.05），且C、T等位基因頻率在兩組中的分布亦無統(tǒng)計學差異（χ2=0.486，P＞0.05）。

2.2 兩組不同基因型血漿FⅫ:C水平比較 見表2。

表2 兩組不同基因型血漿FⅫ:C水平比較（%）

由表2可見，AMI患者血漿FⅫ:C水平TT基因組明顯低于CT組和CC組（P＜0.01），且CT組活性低于CC組（P＜0.01）。對照組不同基因組間血漿FⅫ:C水平類似AMI組。AMI組血漿FⅫ:C水平顯著低于對照組（P＜0.01）。

3 討論

心肌梗死是炎癥參與的斑塊破裂和血栓形成導致的急性心肌缺血壞死。目前國內(nèi)研究FⅫC46T多態(tài)性與AMI之間相關性報道極少，國外主要集中于歐洲各國，且結(jié)論各不相同。本研究對FⅫ因子啟動區(qū)的第46位堿基多態(tài)性進行直接測序，發(fā)現(xiàn)AMI組和對照組均以TT基因型為主，且T等位基因頻率較高，與國內(nèi)云南漢族人群分布情況類似[5]，但與歐洲人群分布截然不同[3]，提示FⅫ基因46位多態(tài)性分布存在種族地域差異。FⅫC46T3種基因型和等位基因C、T在AMI組和對照組間的分布差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），表明AMI與FⅫC46T基因型并無關聯(lián)。而Roldan等[2]則認為FⅫ46 T等位基因?qū)⒃黾踊荚绨l(fā)性MI風險，特別是高膽固醇血癥人群。本研究中血漿FⅫ:C檢測結(jié)果顯示：不論正常人群還是AMI患者，CC、CT和TT 3種基因型對應的血漿FⅫ:C水平均有統(tǒng)計學差異，以CC組活性最高，TT組活性最低，表明T等位基因與低水平血漿FⅫ:C相關聯(lián)。其原因為T等位基因創(chuàng)造了一個新的甲硫氨酸起始密碼子，破壞了啟動子區(qū)域的一個Kozak共有序列，導致FⅫ翻譯效率下降[1]。

本實驗結(jié)果亦顯示：AMI患者總體血漿FⅫ:C水平（80.08%）顯著低于正常對照（91.03%），但T等位基因頻率在AMI組（73.7%）和對照組（77.0%）的分布并無顯著差異，提示AMI患者血漿FⅫ:C水平下降并非是T等位基因所致，原因可能為消耗性降低。瑞典一研究報道ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者發(fā)病6h內(nèi)體內(nèi)FⅫa/AT復合物水平顯著高于正常對照，1～3d趨于正常，但兩者水平均明顯高于3個月后的自身水平，這一結(jié)果證實STEMI發(fā)病即血栓形成和FⅫ參與密切相關[6]。與此同時，在最近幾年中，大量的動物實驗或是運用寡反義核苷酸（ASO）技術下調(diào)FⅫ表達或通過阻遏FⅫ的激活物或應用抗體直接抑制FⅫa的催化活性均能不同程度地抑制動、靜脈血栓形成[4，7-8]。由此可見，F(xiàn)Ⅻ在病理性血栓形成中起重要作用，F(xiàn)Ⅻ缺乏可能是預防血栓形成的保護性因素。盡管目前大部分研究都局限于動物實驗,但對將來研發(fā)新的、更安全的抗血栓治療藥物具有重大意義。

綜上所述，F(xiàn)ⅫC46T基因多態(tài)性與AMI無關聯(lián)，AMI急性發(fā)作時血漿FⅫ:C顯著降低，F(xiàn)Ⅻ水平與血栓形成密切相關。FⅫ缺乏可能是預防血栓形成的保護性因素，此觀點有待進一步研究證實。

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[2]Roldan V,CorralJ,Marin F,et al.Synergistic association between hypercholesterolemia and the C46T factorⅫ polymorphism for developing premature myocardial infarction[J].Thromb Haemost, 2005,94(6):1294-1299.

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Association between coagulation factorⅫ gene polymorphisms and acute myocardial infarction

LIU Meina,JIN Yanhui,CHENG Shuibing，et al.Laboratory Medicine Center，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325015，China

【 Abstract】 Objective To investigate the association between genetic polymorphisms of coagulation factorⅫ (FXII)with acute myocardial infarction(AMI). Methods The blood samples of 97 cases of AMI patients before treatment and 76 healthy subjects were obtained.The FⅫC46T Polymorphism was analyzed by direct sequencing.Plasma coagulation factorⅫactivity(FⅫ:C)was measured by one-stage recalcification clotting time assay.The association between FXII gene polymorphism and susceptibility of AMI was analyzed. Results There were no significant differences in FXII C46T genotype CC,CT,TT distribution and C,T allele frequency between two groups(P＞0.05).Subjects with homozygous T allele showed significantly lower plasma FⅫ:C compared to subjects with homozygous C allele or those with heterozygous C/T allele(P＜0.01).Compared with control group,Plasma FⅫ:C in AMI group was significantly lower(P＜0.01). Conclusion The FⅫC46T polymorphism may be not related to AMI,while AMI is associated with reduced plasma FⅫactivities.

Myocardial infarction FactorⅫ Gene polymorphism

2016-05-03）

（本文編輯：沈昱平）

溫州市科技計劃項目（Y20140407）

325015 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心（劉媚娜、金艷慧、徐琦煜、劉歡樂、王明山），創(chuàng)傷外科（程水兵）

王明山，E-mail:wywms@126.com