兒童喉乳頭狀瘤組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)及相關(guān)性研究

胡彬雅 趙斯君 任基浩 陶禮華 田道法

兒童喉乳頭狀瘤組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)及相關(guān)性研究

胡彬雅1趙斯君1任基浩2陶禮華1田道法3

目的 研究?jī)和砣轭^狀瘤(larynx papilloma，LP)，Toll樣受體4（Toll-like receptor4,TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)蛋白的表達(dá)及其相互關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)42例LP組織中TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)情況，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示42例兒童喉LP組織中TLR4陽(yáng)性表達(dá)率為76.19%,明顯高于聲帶息肉組(P<0.01)和正常黏膜組(P<0.01)；42例LP組織中NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率為78.57%,顯著高于兒童聲帶息肉組和正常喉黏膜組(P<0.01);對(duì)同一組織標(biāo)本連續(xù)性切片觀察發(fā)現(xiàn)TLR4與NF-κB蛋白表達(dá)的區(qū)域分布有呈明顯重疊，進(jìn)而采用Spearman雙變量相關(guān)性分析顯示喉乳頭狀瘤組織中TLR4與NF-κB蛋白表達(dá)水平呈高度正相關(guān)（r=0.623，P0.001）。結(jié)論 TLR4和NF-κB均在LP組織中高表達(dá)，可能在LP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。

喉乳頭狀瘤;TLR4;NF-κB;

喉乳頭狀瘤（laryngeal papilloma，LP）在臨床上比較常見(jiàn),雖然在組織學(xué)上屬于良性腫瘤,但是有復(fù)發(fā)、惡變的潛在危險(xiǎn),近年來(lái)LP的發(fā)病有明顯增高的趨勢(shì),但其易于復(fù)發(fā)的原因不清。在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)中,慢性感染和炎癥被認(rèn)為是最重要的后天性和環(huán)境因素,而其中Toll樣受體 (Toll-like receptors,TLRs)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路可能起到重要作用[1]。TLR4是目前發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)病關(guān)系最密切的TLRs家族成員之一，TLR4活化的信號(hào)傳導(dǎo)屬于經(jīng)典的Toll樣信號(hào)通路,可以啟動(dòng)NF-κB途徑和應(yīng)激激酶途徑(stress kinase pathway),最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[2]。但TLR4和NF-κB在LP組織中是否表達(dá)和具有相關(guān)性,及其在LP的發(fā)病中是否起作用尚有待研究。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TLR4和NF-κB在兒童LP組織、聲帶息肉及正常的喉黏膜組織中的表達(dá)情況，并分析兩者的相互關(guān)系，以進(jìn)一步探討它們?cè)趦和疞P形成、發(fā)展中的作用機(jī)制。

材料與方法

1 材料

選擇湖南省兒童醫(yī)院2010年9月～2015年9月期間行手術(shù)治療并經(jīng)病理檢查證實(shí)的兒童LP患兒42例。其中男性17例，女性25例，年齡2～7歲，平均3.6±1.5歲。另選擇同期25例聲帶息肉患兒病理標(biāo)本和25例正常喉黏膜組織作為對(duì)照。正常對(duì)照組標(biāo)本來(lái)源于因?yàn)楹戆┒腥砬谐g(shù)的喉體標(biāo)本，石蠟切片HE染色后顯微鏡下觀察證實(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)10ml/L的福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm層厚連續(xù)切片。

2 方法

兔抗人TLR4多克隆抗體和兔抗人NF-κB多克隆抗體（活化型）均為北京中杉金橋生物科技公司產(chǎn)品，SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，微波抗原修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷15min，分別滴加TLR4多克隆抗體（1∶100）和NF-κB的多克隆抗體（1∶100），置27℃孵育60min，二抗于37℃孵育30min,三抗37℃孵育30min，DAB顯色4～8min，蘇木精復(fù)染后，脫水、透明、封固后光鏡下觀察。用已知的陽(yáng)性切片染色作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。將染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)合判斷TLR4和NF-κB免疫組化染色結(jié)果。先按染色強(qiáng)度打分：0分為無(wú)色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，染色強(qiáng)度需與背景著色相對(duì)比;再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比打分：0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞≤10%，分為11%～30%，3分為31%～70%，4分為>71%，染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積>3分為免疫反應(yīng)陽(yáng)性(+)[3]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包，率的比較采用兩樣本構(gòu)成比（率）比較的χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TLR4和NF-κB表達(dá)相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié)果

1 三組間TLR4和NF-κB的表達(dá)情況比較

TLR4表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜有棕黃色或棕褐色顆粒沉淀。42例兒童LP組織中有32例TLR4為陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為76.19%，明顯高于兒童聲帶息肉組（P<0.01，表1）和正常對(duì)照組（P< 0.01，表1）；而兒童聲帶息肉組和正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

NF-κB表達(dá)主要表現(xiàn)為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中有棕褐色或棕黃色顆粒沉淀。42例LP組織中有33例陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為78.57%，與兒童聲帶息肉組和正常對(duì)照組兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，表1）；而兒童聲帶息肉組和正常對(duì)照組的NF-κB陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 TLR4、NF-κB在三組中的陽(yáng)性表達(dá)情況[n(%)]

2 兒童喉乳頭狀瘤組中TLR4和NF-κB表達(dá)關(guān)系分析

免疫組化結(jié)果顯示兒童LP組織中TLR4陽(yáng)性表達(dá)率為76.19%，NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率為78.57%，對(duì)同一組織標(biāo)本連續(xù)性切片觀察發(fā)現(xiàn)TLR4與NF-κB蛋白表達(dá)的區(qū)域分布有呈明顯重疊，進(jìn)而采用Spearman雙變量相關(guān)性分析顯示LP組織中TLR4與NF-κB蛋白表達(dá)水平呈高度正相關(guān)（r=0.623，P＜0.001）。

討論

Toll樣受體自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，作為連接天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的重要橋梁，在免疫系統(tǒng)中有著極為特殊的地位。近來(lái)的部分研究表明，它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能有著較為重要的作用。首先，從腫瘤的“危險(xiǎn)模式”理論來(lái)看，腫瘤組織生長(zhǎng)侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中可降解細(xì)胞外基質(zhì)，產(chǎn)生活性氧物質(zhì)和某些應(yīng)激保護(hù)性因子(如HSP)，以及細(xì)胞壞死，所有的這些因素包括腫瘤抗原都為“危險(xiǎn)因子”并可以成為TLR的內(nèi)源性配體，從而激活TLR信號(hào)途徑，促進(jìn)APC的成熟(與其他免疫相關(guān)分子共同作用)，進(jìn)而活化T細(xì)胞引起特異性抗腫瘤免疫；另一方面，如果腫瘤無(wú)法產(chǎn)生足夠的內(nèi)源性配體，如在腫瘤的早期，或腫瘤細(xì)胞因缺乏足夠血供發(fā)生凋亡而不是能產(chǎn)生危險(xiǎn)信號(hào)的壞死等因素，TLRs信號(hào)途徑不能有效的激活或者TLRs的表達(dá)下調(diào)，則可能出現(xiàn)腫瘤的免疫耐受或免疫逃逸。近來(lái)在肺癌、喉癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)在癌細(xì)胞或浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞上的表達(dá)可能與腫瘤的免疫逃逸密切相關(guān)。而TLR4信號(hào)途徑的持續(xù)激活在某些研究中被認(rèn)為是慢性炎癥持續(xù)存在進(jìn)而發(fā)展為腫瘤的重要原因[2]。TLR4是發(fā)現(xiàn)最早的Toll樣受體家族的重要成員之一,是有效識(shí)別革蘭陰性菌脂多糖(lipopolysacchide,LPS)的關(guān)鍵受體,通過(guò)識(shí)別病原體成分及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在天然免疫中發(fā)揮著重要作用。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factorkappa B,NF-κB)是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,能與多種基因啟動(dòng)子中含有的κB序列結(jié)合,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用,激活多種與細(xì)胞生長(zhǎng)或凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄。許多腫瘤細(xì)胞株及腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)有NF-κB的高表達(dá)與持續(xù)性激活。我們的研究發(fā)現(xiàn)TLR4在兒童LP組的陽(yáng)性率顯著高于兒童聲帶息肉組和正常喉黏膜組。提示TLR4、NF-κB在兒童LP組織中的高表達(dá)，在兒童LP組織的發(fā)生發(fā)展中可能起重要的作用。

近年來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn),多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)TLR4,后者通過(guò)對(duì)病原相關(guān)分子模式PAMPs進(jìn)行模式識(shí)別,經(jīng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子最終激活NF-κB,刺激細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化,抑制凋亡并導(dǎo)致炎性反應(yīng)因子大量釋放,致使腫瘤微環(huán)境形成,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。TLR4主要表達(dá)于免疫細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面,在氣管上皮細(xì)胞上也有表達(dá)。TLR4過(guò)TLR4信號(hào)通路激活NF-κB,誘導(dǎo)炎性反應(yīng)細(xì)胞因子大量釋放,導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境形成,從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和進(jìn)展[4]。TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路激活,可活化NF-κB轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核,導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子IL-6和促腫瘤生長(zhǎng)因子TNF-α等大量分泌,最終促腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和抵抗抗腫瘤藥物紫杉醇誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[5]。有研究表明TLR4/MyD88信號(hào)通路可能是機(jī)體內(nèi)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)的機(jī)制之一[6]。本研究顯示，TLR4與NF-κB表達(dá)在LP組織中具有顯著正相性，提示該信號(hào)傳導(dǎo)通路激活且導(dǎo)致下游炎癥因子的釋放可能是喉乳頭狀瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，但其具體分子靶點(diǎn)尚有待于進(jìn)一步深入研究。

1 Chen R,Alvero AB,Silasi DA.Inflammation,cancer and chemoresistance:taking advantage of the toll-like receptor signaling pathway.Am J Reprod Immunol.2007,57(2): 93-107.

2 HUANG B,ZHAO J,UNKELESS J C,et al.TLR signaling by tumor and immune cells:a double edged sword[J].Oncogene,2008,27(2):218-224.

3 Wang JX,Zheng S.caspase-3 and survivin expression in pediatricn eumblastoma and their roles in apoptosis[J]. Chin M ed J(Eng1),2004,117(12):1821-1824.

4 Semlali A,Reddy ParineN,Arafah M,et al.Expression and Polymorphism of Toll-Like Receptor 4 and Effect on NF-κB Mediated Inflammation in ColonCancer Patients. PLoS One.2016,11(1):1-19.

5 Ran S.The Role of TLR4 in Chemotherapy-Driven Metastasis.Cancer Res.2015,75(12):2405-2410.

6 Kim KH,Jo MS,Suh DS,Expression and significance of the TLR4/MyD88 signaling pathway in ovarian epithelial cancers.World J Surg Oncol.World Journal of Surgical Oncology 2012,10:193-2000.

（收稿:2016-09-18）

Correlation of the expression of TLR4 and NF-κB proteins in juvenile laryngeal papilloma

HU Binya,ZHAO Sijun,REN Jihao,ZHU Yimin,TIAN Daofa
Departmento of Otorhinolaryngology,Hunan child’hospital,Changsha,Hunan,China,410007

Objective To investigate correlation between the expression of TLR4 and NF-κB proteins in juvenile laryngeal papilloma.Methods The expression of TLR4 and NF-κB proteins were detected ith immunohisto chemial method in 42 cases of juvenile laryngeal papilloma，Analysis of the correlation of the expression.Results The positive rates of TLR4 protein in juvenile laryngeal papilloma were 76.19%and higher than that in polyp of vocal cord(P<0.01)and the normal laryngeal moeusa(P<0.01). And the NF-κB protein positive rate was 78.57%in juvenile laryngeal papilloma and higher than that in polyp of vocal cord and the normal laryngeal mucosa(P<0.01).On the same tissue samples continuity slice observation found that TLR4 and nf-kappa B protein expression of regional distribution has obvious overlap，Then use Spearman bivariate correlation analysis showed that there was a significant positive correlation between the expression of TLR4 and NF-κB in juvenile laryngeal papilloma.Conclusion The abnormal expression of TLR4 and NF-κB may play important role in the pathogenesis of juvenile laryngeal papilloma.

Juvenile laryngealpapilloma;Toll-like receptor4;nuclear factor-kappa B

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.05.005

1湖南省兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科（長(zhǎng)沙，410007）

2中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（長(zhǎng)沙）

3湖南中醫(yī)藥大學(xué)耳鼻咽喉科（長(zhǎng)沙）

胡彬雅，副主任醫(yī)師.Email:zhzi628@126.com