RASSF1A基因啟動子甲基化狀態(tài)與喉癌關(guān)系的實驗研究

別遠志 孫敬武 李萬舉

RASSF1A基因啟動子甲基化狀態(tài)與喉癌關(guān)系的實驗研究

別遠志1孫敬武1李萬舉1

目的 檢測喉癌組織的抑制基因RAS相關(guān)區(qū)域家族1A(Ras associationdomain family 1,isoform A,RASSF1A)甲基化狀態(tài)，并探討RASSF1A啟動子甲基化與喉癌的關(guān)系。方法 應(yīng)用甲基化特異性PCR技術(shù)技術(shù)檢測52例喉癌組織，52例相應(yīng)癌旁組織及24例對照組織中RASSFIA基因啟動子甲基化狀態(tài)。按年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤分期進行分組，分析RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化情況與各組臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 ①喉癌組織、癌旁組織及對照組織中RASSFIA基因啟動子區(qū)甲基化的例數(shù)分別65.4%、7.7%、0%。喉癌組甲基化發(fā)生率顯著高于癌旁組和對照組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而癌旁組甲基化發(fā)生率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。②RASSF1A基因啟動子甲基化情況與喉癌患者的年齡、性別及腫瘤的分化程度、及分期情況關(guān)系不明顯，按上述臨床病理特征分組，各組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論①喉癌組織中RASSF1A基因啟動子區(qū)的甲基化，提示其與喉癌發(fā)生關(guān)系密切，可能喉癌發(fā)生過程中一個重要的分子機制。②不同腫瘤的分化及分期間甲基化程度無明顯差異，提示RASSF1A基因發(fā)生甲基化可能是喉癌發(fā)生中的早期事件。③RASSF1A啟動子甲基化有望成為早期診斷喉癌的一個分子標志。甲基化特異性PCR方法是一種快而靈敏的基因甲基化檢測方法，有望應(yīng)用于臨床。

喉癌；RASSF1A基因；甲基化；甲基化特異性PCR

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤之一，占全身腫瘤的1%～5%[1]，近年發(fā)病率有明顯的增長趨勢，僅2005年就新增病例16萬，嚴重危害著人類的健康[2]。目前，研究喉癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機制及腫瘤標志物，對于喉癌的預(yù)防、診斷、預(yù)后評價和化療藥物選擇將有重大的意義，成為未來喉癌研究的熱點。癌基因激活和抑癌基因的失活是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要遺傳學(xué)機制，但其中以腫瘤抑制基因的失活是腫瘤發(fā)生的重要原因，抑癌基因RASSFlA是目前研究的熱點。RASSF1A失活主要包括三種機制：RASSF1A啟動子的甲基化、純合子缺失和雜合子的丟失（loss of heterozygosity, LOH），大量文獻研究表明，RASSFIA基因啟動子區(qū)異常高甲基化是導(dǎo)致該基因失活的主要機制。目前多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了RASSFlA的啟動子甲基化，如乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌、胃癌等，但是喉癌的相對報道十分有限，為了進一步研究RASSFlA基因的甲基化與喉癌的發(fā)生密切相關(guān)，所以設(shè)計本次實驗研究。

本實驗采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Methylation specific polymerase Chain reaction,MSP)技術(shù)，應(yīng)用甲基化特異性PCR技術(shù)檢測52例喉癌組織及相應(yīng)癌旁組織、24例對照組織中RASSFIA基因啟動子甲基化狀態(tài)。按年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤分期進行分組，分析RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化情況與各組臨床病理特征的關(guān)系。探討RASSF1A啟動子甲基化與喉癌的關(guān)系。

材料與方法

1 研究對象

52例喉癌標本來自以2009年10月～2011年7月安徽省立醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院治療的病人，其中男性48例，女性4例，年齡42～78歲，平均60歲，所有患者術(shù)前均未接受化療或放療。喉癌組織、相應(yīng)癌旁組織經(jīng)病理檢驗證實，并確認手術(shù)標本切緣為陰性。所有喉癌均經(jīng)組織病理學(xué)明確診斷，均為喉鱗狀細胞癌，其中高分化鱗癌33例，中分化12例，低分化7例。按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC) TNM分類標準（2002），其中I級16例，II期14例，III期10例，IV12例。另外取喉良性疾病對照組24例患者，其中男性14例，女性10年，年齡28～60歲，平均43歲，病種包括：聲帶息肉，聲帶肉芽腫。以上所有的組織所有標本自取材后立即放入液氮中，后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存。52例喉患者及24例良性腫瘤患者（對照組），術(shù)前經(jīng)患者及家屬簽字同意。

2 引物設(shè)計及合成

MSP原理：亞硫酸氫鹽和氫醌能將DNA鏈上的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而當CpG上的胞嘧啶被甲基化后，這一轉(zhuǎn)化將不會發(fā)生。這樣甲基化和未甲基化的DNA序列經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾后，即可通過特異序列的引物區(qū)分開來。引物參照Gene bank及相關(guān)文獻[14，15]，分別識別甲基化特異性序列和非甲基化特異性序列，設(shè)計如下（表1）。

表1 甲基化特異性PCR反應(yīng)引物序列

3 實驗過程及步驟

3.1 組織標本DNA提取

采用康為世紀公司的DNA提取試劑盒（CW0546），按照說明先后試劑制配，然后根據(jù)說明書具體操作。

3.1.1 材料處理

①直接向100μl冷凍的抗凝血液樣品中加入BufferGTL補足至200μl；

②取25mg組織切成小塊，加入Buffer GTL用勻漿器勻漿處理，置于1.5ml離心管中。加入180μl Buffer GTL，將不同樣品做好標記。

3.1.2 加入20μl Proteinase K，渦旋震蕩使樣品徹底混勻。

①血液標本，只需加入Proteinase K混勻，即可繼續(xù)進行下一步操作。

②組織標本，加入Proteinase K混勻后，56℃水浴，直至組織完全裂解，孵育過程中可每隔一段時間顛倒（過夜）

3.1.3 加入200μl Buffer GL，渦旋震蕩充分混勻。加入200μl無水乙醇，渦旋震蕩充分混勻。

3.1.4 將步驟3所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。10,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

3.1.5 向吸附柱中加入500μl Buffer GW1（使用前檢查是否已加入無水乙醇），10,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

3.1.6 向吸附柱中加入500μl Buffer GW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），10,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

3.1.7 12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。

3.1.8 將吸附柱置于一個新的離心管（自備）中，向吸附柱的中間部位懸空懸空加入50～200μl Buffer GE或滅菌水，室溫放置2～5分鐘，10,000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

3.2 DNA修飾

采用康為世紀公司的甲基化DNA檢測試劑盒（CW2140），按照說明書具體步驟操作，進行DNA甲基化修飾劑及檢測。

操作步驟

3.2.1 取20μl DNA樣品，加入到離心管（自備）中，如果樣品量不足，用水補至20μl。

3.2.2 向 DNA樣品中加入 2.2μl的 M-Dilution Buffer，混勻樣品。

3.2.3 42℃水浴30分鐘。

3.2.4 向上步得到的樣品中，加入220μl配制好的CT Conversion Reagent溶液，混勻，80℃恒溫水浴鍋中避光孵育60分鐘。

3.2.5 向上步溶液中加入480μl M-Buffer PA，溫和上下顛倒混勻。

3.2.6 柱平衡：向已裝入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column CS）中加入200μl Buffer PS，12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

3.2.7 將步驟5所得溶液全部加入到吸附柱（已裝入收集管）中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

3.2.8 向吸附柱中加入500μl M-Buffer PA，12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

3.2.9 向吸附柱中加入650μl M-Wash Buffer（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

3.2.10 12,000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。

3.2.11 將吸附柱放入一個新的離心管（自備）中，向吸附膜中間位置懸空滴加20ul M-Elution Buffer（pH8.5），室溫放置2分鐘。12,000rpm離心1分鐘收集DNA溶液。

3.2.12 向收集的20ulDNA中加入2.2ul M-Dilution Buffer，室溫靜止30分鐘。

3.2.13 向溶液中加入500ul預(yù)冷的無水乙醇顛倒混勻，沉淀30分鐘（建議置于-20℃沉淀，過夜沉淀效果更好）。

3.2.14 12,000rpm離心15分鐘，輕輕倒掉上清，再用75%乙醇洗滌一次。

3.2.15 12,000rpm離心1分鐘，倒掉上清，室溫下待乙醇揮發(fā)后，加入20μl M-Elution Buffer溶解，DNA置于-20℃保存。

3.3 甲基化特異性PCR

采用康為世紀公司的2×GoldStar Best Master－Mix（含染料），按照說明進行相關(guān)操作。

3.4 PCR反應(yīng)體系（表2）

表2 PCR反應(yīng)體系

3.5 PCR反應(yīng)條件（表3）

表3 PCR反應(yīng)條件

3.6 結(jié)果檢測

取5ulPCR產(chǎn)物與2ul上樣緩沖液充分混勻后，加樣至含有溴化乙錠(EB)的2.5%瓊脂糖凝膠上，于盛有l(wèi)xTAE緩沖液的電泳槽內(nèi)電泳30分鐘，電壓100V，以凝膠成像分析儀(UVI)觀察分析電泳結(jié)果

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料多組間比較采用行χ列表卡方檢驗，兩組間比較采用Fisher’s確切概率法，以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以P>0.05認為差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 PCR擴增產(chǎn)物電泳可以出現(xiàn)以上三種結(jié)果

①甲基化特異引物擴增出目的條帶，而非甲基化特異引物無條帶擴出，這種情況為甲基化（圖A）。②非甲基化特異性引物擴增出目的條帶，而甲基化引物無條帶擴出，這種情況為非甲基化（圖B）。③兩對引物均擴增出目的條帶，也屬于甲基化（圖C）。具

表3 組織中甲基化情況

圖3 對照組組織PCR反應(yīng)物凝膠電泳圖N1、N2、N3為三個檢測標本

2.2 RASSFIA基因甲基化與喉癌臨床病理特征的關(guān)系見表4、圖2。

2.2.1 性別因素

本研究中，男性48例發(fā)生甲基化為32例（66.7%）；女性4例發(fā)生甲基化為2例（50%），兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）

2.2.2 年齡因素

分>60歲和<60歲兩個年齡組，兩組甲基化發(fā)生率為75.1%和55.6%，兩組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意體如圖1。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物圖

2 試驗結(jié)果及分析

2.1 喉癌、癌旁組織及良性腫瘤的RASSF1A甲基化情況

52例喉癌組織、52例癌旁組織及24例對照組織中RASSFIA基因啟動子區(qū)甲基化的例數(shù)分別為34例（65.4%）、4例（7.7%）、0例（0%）。喉癌組甲基化發(fā)生率顯著高于癌旁組和喉良性腫瘤，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而癌旁組甲基化發(fā)生率與喉良性腫瘤比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。詳見表3、圖2,3,4。義（P>0.05）

圖2 喉癌組織PCR反應(yīng)物凝膠電泳圖T1、T2、T3為三個檢測標本

圖4 癌旁組織PCR反應(yīng)物凝膠電泳圖1,2,3為三個檢測標本

2.2.3 腫瘤分化程度

本研究中，高分化鱗癌，中分化鱗癌及低分化鱗癌分別是組織甲基化率分別是：68.7%，66.7%，57.2%.三組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）

2.2.4 腫瘤臨床分期

本研究中，根據(jù)腫瘤分期：I期，II期，III期，IV期甲基化率分別是：68.7%,71.4%，90.0%,91.7%。四組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。詳見表4。

表4 甲基化與臨床病理的關(guān)系

討論

DNA甲基化是哺乳動物表觀遺傳學(xué)修飾的一種最重要形式，是DNA復(fù)制后調(diào)節(jié)的最常見方式之一，與胚胎正常發(fā)育、細胞定向分化等有關(guān)成為現(xiàn)在研究熱點[3]。DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，將S-腺甘甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的C5位的碳原子上，使之變成5一甲基胞嘧啶，這種修飾反映主要發(fā)生在基因組DNA的CpG島上。文獻報道兒乎所有的管家基因都含有CpG島，但是這種CpG島大部分處于非甲基化狀態(tài)，如果其發(fā)生甲基化，可導(dǎo)致基因表達收到抑制。DNA甲基化抑制基因表達的機制主要如下[4]：①甲基化的胞嘧啶突入DNA雙螺旋大溝，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合。②甲基化CpG可激活阻遏蛋白因子從而抑制轉(zhuǎn)錄。③甲基化CpG與甲基化CpG結(jié)合蛋白結(jié)合有抑制轉(zhuǎn)錄的作用[5]。④啟動子DNA甲基化與組蛋白去乙酞化之間具有協(xié)同抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用等。大量研究表明，DNA異常甲基化在腫瘤形成中起著重要作用，尤其是抑癌基因的高甲基化導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄沉寂，表達失活，基因功能下降甚至喪失，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。

目前國內(nèi)外有大量研究抑癌基因RASSFlA表達缺失及甲基化狀態(tài)的報道，首先在肺癌中發(fā)現(xiàn)了RASSFlA啟動子區(qū)甲基化及表達缺失[6]，隨后在乳腺癌、鼻咽癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、肝癌等[7]惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)RASSFlA啟動子區(qū)甲基化，但其甲基化程度相差較大。Damann等報道：在原發(fā)性非小細胞肺癌甲基化比例：72%～78%；Yan等[8]用MSP分析報道乳腺癌中的比率是：49%～6l%； Byun等[9]對150個胃標本(包括15個癌細胞系)進行研究，發(fā)現(xiàn)RASSFIA失活約60%；徐婷娟等[10]通過數(shù)據(jù)分析等到結(jié)論：胃癌的病理分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃癌RASSF1A甲基化有相關(guān)性；楊靜等[11]發(fā)現(xiàn)在喉癌組織中基因RASSFlA的甲基化率為62%，對照組基因無DNA甲基化，許承弼等[12]報道采用MSP方法檢測RASSFlA基因在48例喉癌組織、34例發(fā)生了甲基化,其甲基化率：70%，說明喉癌的發(fā)生、及發(fā)展與抑癌基因的啟動子區(qū)甲基化有關(guān)系。本研究應(yīng)用MSP技術(shù)檢測52例喉癌組織、癌旁組織及對照組織中RASSFIA基因啟動子區(qū)甲基化的例數(shù)分別65.4%、7.7%、0%，喉癌組甲基化發(fā)生率顯著高于癌旁組和對照組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而癌旁組甲基化發(fā)生率與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其結(jié)果基本符合前人的研究，提示：喉癌組織中RASSF1A基因啟動子區(qū)的甲基化，提示其與喉癌發(fā)生關(guān)系密切，可能是喉癌發(fā)生過程中一個重要的分子機制。

Jian等[13]的研究顯示在非小細胞肺癌中RASSFIA基因甲基化與性別及臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性(P>O.05)與非小細胞肺癌的組織學(xué)類型有關(guān)，且發(fā)現(xiàn)與肺癌患者的五年生存率明顯相關(guān)，也就是說RASSFIA基因甲基化是非小細胞肺癌特別是肺腺癌患者不良預(yù)后的因素之一。許承弼及楊靜研究報告，即：DNA甲基化率與年齡、性別、分化程度、腫瘤T分期，病理類型和有無淋巴轉(zhuǎn)移均不相關(guān)。本研究基本符合上訴結(jié)果，這說明RASSFlA基因發(fā)生甲基化可能是腫瘤發(fā)生中的早期事件，喉癌發(fā)展的全過程，而不局限于某個分期或分型。

人體外周血、腹水及其他體液如鼻咽癌患者的口、喉漱洗液，子宮內(nèi)膜癌的陰道分泌物，乳腺癌的乳頭分泌物，因其取材比較方便，正在作為新的腫瘤標志物，成為現(xiàn)在研究的熱點。1989年Stroun等[14]第一次表明腫瘤患者外周血循環(huán)DNA可能具有原發(fā)腫瘤DNA的某些特征。馬琳等[15]報道正常健康人血液循環(huán)DNA RASSFIA基因甲基化的發(fā)生率均為0,51例卵巢癌患者血液循環(huán)腫瘤RASSFIA甲基化的發(fā)生率為43.1%。一些文獻證實外周血RASSFIA甲基化在肝癌[16]、肺癌等許多腫瘤的診斷中均有一定的價值，但是對于喉癌外周血的RASSFIA基因甲基化報道很少，對血清RASSFIA的檢測很可能有利于喉癌的早期診斷，并有希望成為新型的腫瘤標志物。

綜上所述，抑癌基因RASSFIA基因啟動子區(qū)高甲基化與喉癌的發(fā)生密切相關(guān)，可能是喉癌早期發(fā)展中的一個分子事件。隨著對RASSFIA基因研究的深入，患者外周血將RASSFIA啟動子區(qū)高甲基化作為標志物，結(jié)合其他幾種甲基化率高的基因，用甲基化特異性PCR法進行聯(lián)合檢測，有利于喉癌的早期診斷，并有希望成為新型的腫瘤標志物。大量文獻報道，經(jīng)甲基化抑制劑5-氮一2脫氧胞苷處理的腫瘤或癌細胞株，RASSF1A重新得以表達，同時腫瘤細胞生長受抑制，凋亡增多，其已應(yīng)用于臨床實驗作為常規(guī)化療方案的補充，用于治療兒童白血病等腫瘤，并取得較好的療效[17]。故抑制和逆轉(zhuǎn)抑癌基因甲基化為防治腫瘤提供了新的思路，將有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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（收稿:2016-04-26 修回：2016-08-25）

Experimental study on the relationship between RASSF1A gene promoter methylation status and laryngeal carcinoma

BIE Yuanzhi,SUY Jingwe,LI Wanju
Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery,Anhui Provincial Hospital,Affilitiated to Anhui Medical University,Hefei,230001,China

Objective To detect the methylation status of suppressor gene RASSF1A in laryngeal carcinoma tissues and to investigate the relationship between the promoter methylation of RASSF1A and laryngeal carcinoma.Methods The promoter methylation status of RASSF1A gene in Laryngeal carcinoma tissues and corresponding adjacent tissues from 52 patients,and in normal tissues from 24 specimens was detected with methylation specific polymerase chain reaction(MSP).Grouping according to the age,sex,tumor differentiation degree and tumor stage,to analyze the association between the promoter methylation of RASSF1A gene and the clinicopathological features of each group.Results①The positive rate of promoter methylation of RASSF1A gene was significantly higher in laryngeal carcinoma than that in the adjacent tissues and normal controls(65.4%、7.7%、0%,P<0.05),but no significant difference was detected between the adjacent tissues and normal controls.②It was found that the promoter methylation of RASSF1A gene had no correlation with age,sex,tumor differentiation degree and T stage(P>0.05). Conclutions①Promoter methylation of RASSF1A gene presents in laryngeal carcinoma tissue suggests that it might be closely associated with the occurrence of laryngeal carcinoma,which may be an important molecular mechanism in the process of the occurrence of laryngeal carcinoma.②Promoter methylation degree of RASSF1A gene had no correlation with the differentiation degree and T stage,suggesting that it may be an early event in the occurrence of laryngeal carcinoma.③The detection of RASSF1A promoter methylation might become an important molecular marker for the early diagnosis of laryngeal carcinoma.MSP is a fast and sensitive method for methylation detection in the promoter region,which may be used in clinical diagnosis of laryngeal carcinoma.

laryngeal carcinoma;RASSF1A gene;Methylation;Methylation spcific polymerase chain rection(MSP)

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.05.004

1安徽省立醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（合肥，230001）

孫敬武,主任醫(yī)師.Email:entsunjingwu@hotmail.com