紫甘藍(lán)食用色素抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化活性研究

王忠博，張志斐，姚妍妍，李洋

（華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北唐山063000）

紫甘藍(lán)食用色素抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化活性研究

王忠博，張志斐，姚妍妍，李洋*

（華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北唐山063000）

探討紫甘藍(lán)食用色素抑制細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的活性。采用H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血、肝勻漿脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、肝線粒體腫脹實(shí)驗(yàn)以及羥基自由基評(píng)價(jià)紫甘藍(lán)食用色素抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的能力。紫甘藍(lán)食用色素能夠顯著抑制紅細(xì)胞溶血、降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、減輕線粒體腫脹、清除羥基自由基，均呈一定的量效關(guān)系。紫甘藍(lán)食用色素在體外能夠抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，作為天然食用色素開發(fā)利用，有廣闊前景。

紫甘藍(lán)；天然食用色素；脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；抗氧化活性

食品中添加的人工合成色素被大量證據(jù)證實(shí)不僅不能向人體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有些還會(huì)危及人類身體健康[1]。隨著全球范圍內(nèi)消費(fèi)者日益關(guān)注飲食健康，天然色素的應(yīng)用成為食品行業(yè)色素使用的新趨勢(shì)。天然色素多來(lái)自于動(dòng)、植物組織以及微生物，不僅對(duì)人體無(wú)毒害，安全性高，而且部分天然色素具有生理活性，兼有營(yíng)養(yǎng)保健的作用，如花色苷類色素能夠抗衰老、防治心腦血管疾病[2]；葉綠素有拮抗誘變及抗癌作用[3]；微生物中南極紅色素有強(qiáng)抗氧化作用[4]等。因此，天然色素的研發(fā)愈加受到重視。

紫甘藍(lán)（Brassicaoleracea L.var.capitata L.f.rubra）為十字花科、蕓苔屬甘藍(lán)種中的一個(gè)變種，富含紫紅色色素，顏色鮮艷。紫甘藍(lán)適應(yīng)能力強(qiáng)，產(chǎn)量高，易貯藏，作為食用蔬菜在我國(guó)大面積種植，價(jià)格低廉，因而紫甘藍(lán)色素具備開發(fā)成天然食用色素的巨大潛力。有研究表明紫甘藍(lán)色素為花色苷類物質(zhì)[5]，揭示了其不僅可作為天然食用色素，更可能具有生理活性。

因此，本文從組織、細(xì)胞、細(xì)胞器3個(gè)方面開展紫甘藍(lán)食用色素防護(hù)脂質(zhì)過氧化損傷實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)其生理活性功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘藍(lán)：購(gòu)自超市。D101大孔吸附樹脂：購(gòu)自西安藍(lán)曉科技有限公司。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所?？箟难?、無(wú)水乙醇、雙氧水、十二烷基硫酸鈉、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、硫酸亞鐵、水楊酸均為分析純。

1.2 主要儀器

RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Christ公司；3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BT 125D分析天平：德國(guó)Sartorius公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫甘藍(lán)食用色素的制備

將新鮮、成熟的紫甘藍(lán)剪碎，加入適量含0.1%鹽酸的80%乙醇溶液，室溫浸提4 h，過濾，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在30℃水浴減壓蒸餾，得濃縮液。將濃縮液加入裝有D101大孔吸附樹脂的色譜柱，吸附飽和后用去離子水洗至洗脫液無(wú)色，之后加入含0.1%鹽酸的80%乙醇溶液洗脫至無(wú)色，收集洗脫液。將洗脫液濃縮除去乙醇，冷凍干燥處理，得紫甘藍(lán)食用色素。

1.3.2 紅細(xì)胞和肝勻漿的制備

取KM小鼠，18 g～22 g，摘眼球取血，肝素抗凝全血，將小鼠頸椎脫臼處死，快速取肝臟。血液樣品用10倍體積的磷酸鹽緩沖液（150mmol/LNaCl、8.1mmol/L Na2HPO4、1.9mmol/LNaH2PO4、10mmol/LEDTA，pH 7.4）2 000 r/min、5min離心洗滌3次，去除血漿后得紅細(xì)胞，4℃保存并在6 h以內(nèi)使用[6-7]。

肝臟用冰磷酸鹽緩沖液清洗，濾紙吸干水分后稱重，按1∶9（g/mL）取相應(yīng)體積的冰磷酸鹽緩沖液于冰浴中將肝組織剪碎，玻璃勻漿器中勻漿，得10%（g/mL）肝勻漿，4℃保存。

1.3.3 對(duì)紅細(xì)胞保護(hù)作用的測(cè)定

取1 mL用磷酸鹽緩沖液配制的0.5%（mL/mL）紅細(xì)胞懸液，加入不同濃度的紫甘藍(lán)食用色素溶液0.1mL（對(duì)照組加入0.1mL去離子水）和100mmol/L的H2O2溶液0.1mL，在水浴中37℃恒溫加熱1 h，之后加入4mL磷酸鹽緩沖液并以2 000 r/min離心5min，取上清液在415 nm處測(cè)量吸光度，以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照[8]。色素對(duì)紅細(xì)胞溶血的抑制率計(jì)算公式如下：

式中：A415(對(duì)照)為空白對(duì)照組的吸光度；A415(樣品)為樣品組的吸光度。

按照上述方法，取1mL 0.5%紅細(xì)胞懸液和0.1mL 0.1mg/mL紫甘藍(lán)食用色素在37℃恒溫加熱1 h，測(cè)量415 nm吸光度以檢測(cè)色素是否引起紅細(xì)胞溶血。

1.3.4 肝勻漿脂質(zhì)過氧化抑制活性的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)量丙二醛的生成量以檢測(cè)脂質(zhì)過氧化程度[9]。取0.2mL 10%肝勻漿和0.1mL不同濃度的紫甘藍(lán)食用色素溶液混勻（對(duì)照組取0.1mL去離子水），再加入0.1mL的100mmol/LH2O2溶液，37℃水浴加熱1 h，之后加入0.2mL的8.1%十二烷基硫酸鈉溶液，1.5mL的15%三氯乙酸溶液和1.5mL的0.8%硫代巴比妥酸溶液，并將此混合液加熱至95℃保持1 h。冰浴冷卻后3 000 r/min離心10min，取上清液在532 nm處測(cè)量吸光度，以蘆丁作為陽(yáng)性對(duì)照。色素對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制率計(jì)算公式如下：

式中：A532(對(duì)照)空白對(duì)照組的吸光度；A532(樣品)樣品組的吸光度。

1.3.5 線粒體腫脹度的測(cè)定

將10%肝勻漿在4℃下1 000 r/min離心20min，取上清液在4℃下10 000 r/min離心20min，取沉淀用冰磷酸鹽緩沖液在4℃下10 000 r/min離心20min洗滌1次，沉淀即為肝線粒體，再用冰磷酸鹽緩沖液將沉淀重懸制成懸液，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定該懸液的蛋白質(zhì)濃度（以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)），再調(diào)整成蛋白質(zhì)濃度為0.5mg/mL的線粒體懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取2mL線粒體懸液、0.2mL不同濃度的紫甘藍(lán)食用色素溶液、0.2mL的0.5mmol/L FeSO4溶液和0.2mL的0.5mmol/L抗壞血酸溶液混勻，37℃水浴孵育，每隔一段時(shí)間在520 nm處測(cè)量吸光度。對(duì)照組用等體積磷酸鹽緩沖液代替色素溶液、FeSO4溶液和抗壞血酸溶液，損傷組用等體積磷酸鹽緩沖液代替色素溶液，并用蘆丁作為陽(yáng)性對(duì)照。吸光度的降低表明線粒體腫脹度增大[10]。

1.3.6 羥基自由基清除能力的測(cè)定

通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基[11]。取不同濃度的紫甘藍(lán)食用色素溶液1mL（對(duì)照組加入1mL去離子水），再依次移取1mL 10mmol/LFeSO4溶液、1mL 10mmol/L水楊酸乙醇溶液，之后加1mL 8.8mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5 h，在510 nm處測(cè)量吸光度，以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。色素對(duì)羥基自由基清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A510(對(duì)照)空白對(duì)照組的吸光度；A510(樣品)樣品組的吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行單因素方差分析并計(jì)算IC50，P<0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用

血紅蛋白與氧氣運(yùn)送相關(guān)，氧化還原反應(yīng)非?；钴S，是活性氧自由基產(chǎn)生的重要來(lái)源。由于含有大量的血紅蛋白，并且在其細(xì)胞膜上還有著高濃度的多不飽和脂肪酸，紅細(xì)胞被認(rèn)為是自由基攻擊的主要目標(biāo)[12]。紅細(xì)胞膜受到氧化損傷后會(huì)發(fā)生溶血現(xiàn)象，因而紅細(xì)胞作為一種細(xì)胞模型常用于研究生物膜上的氧化損傷。

本試驗(yàn)先驗(yàn)證紫甘藍(lán)食用色素對(duì)紅細(xì)胞的破壞作用。色素作用于紅細(xì)胞后溶血率為（3.11±0.48）%，這一結(jié)果與空白對(duì)照組（3.78±0.64）%沒有顯著性差異（P>0.05），由此可知色素對(duì)紅細(xì)胞無(wú)不良影響。

紫甘藍(lán)食用色素對(duì)H2O2導(dǎo)致的紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用見圖1。

圖1 紫甘藍(lán)食用色素對(duì)H2O2導(dǎo)致的紅細(xì)胞溶血的抑制作用Fig.1 Inhibition of pigm ents from red cabbageagainst H2O2induced erythrocytehem olysis

由圖1可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，色素對(duì)紅細(xì)胞溶血的抑制作用隨著濃度的增大而增強(qiáng)，能夠顯著抑制H2O2對(duì)紅細(xì)胞造成的氧化損傷（P<0.05），保護(hù)紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，其IC50為109.33μg/mL（抗壞血酸IC50為38.23μg/mL）。

2.2 脂質(zhì)過氧化抑制活性

脂質(zhì)過氧化是多不飽和脂肪酸的氧化反應(yīng)，是生物體內(nèi)常見的氧化進(jìn)程。其主產(chǎn)物丙二醛，被廣泛用于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的指示物，也用于指示氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[13]。因而測(cè)定丙二醛的生成量即可表示脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。紫甘藍(lán)食用色素對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制活性見圖2。

與空白對(duì)照組相比，H2O2作用肝勻漿1 h后丙二醛的生成量顯著增加（P<0.05），而試驗(yàn)組中丙二醛的生成量顯著降低（P<0.05），具有量效關(guān)系（見圖2），IC50為234.02μg/mL（蘆丁組IC50為98.87μg/mL），表明紫甘藍(lán)食用色素對(duì)肝勻漿具有顯著的抗脂質(zhì)過氧化活性。此前有研究顯示紫甘藍(lán)色素能夠抑制亞油酸過氧化作用[14]，也證實(shí)了紫甘藍(lán)色素的脂質(zhì)過氧化抑制能力。

圖2 紫甘藍(lán)食用色素對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制活性Fig.2 Inhibitory activity of pigm ents from red cabbage to lipid peroxidation

2.3 對(duì)線粒體腫脹的抑制作用

在實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)eSO4與抗壞血酸反應(yīng)生成H2O2，導(dǎo)致線粒體膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成其結(jié)構(gòu)損傷，膜通透性改變，從而使線粒體發(fā)生腫脹[15]。520 nm處的吸光度降低即代表線粒體發(fā)生了腫脹，其結(jié)構(gòu)的完整性遭到了破壞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 紫甘藍(lán)食用色素對(duì)線粒體腫脹的抑制作用Fig.3 Inhibitory effectof pigm ents from red cabbageon m itochondrialswelling

由圖3可知，與對(duì)照組相比，線粒體模型組的吸光度隨著時(shí)間推移顯著下降，但在含有紫甘藍(lán)食用色素和蘆丁的實(shí)驗(yàn)組中線粒體腫脹程度明顯減弱，表明紫甘藍(lán)食用色素能夠抑制氧化損傷造成的線粒體腫脹且抑制能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)。在200μg/mL相同終濃度下，紫甘藍(lán)食用色素抑制線粒體腫脹的能力要強(qiáng)于蘆丁。

2.4 清除羥基自由基能力

羥基自由基是活性最強(qiáng)的自由基，其在生物體內(nèi)由氧氣還原成水的過程中不斷產(chǎn)生，是最主要的活性氧自由基，能攻擊并破壞幾乎所有的生物分子，如DNA、蛋白質(zhì)、磷脂和糖類[16]。由前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，紫甘藍(lán)食用色素能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，因而推測(cè)其具有較強(qiáng)清除·OH的能力。結(jié)果如圖4所示。

圖4 紫甘藍(lán)食用色素對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.4 Scavenging activity of pigments from red cabbageon hydroxyl radical

由圖4可知，色素清除·OH的能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，400μg/mL時(shí)清除率達(dá)到98.6%，IC50為111.06μg/mL，大于陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸（IC50為7.65μg/mL）。

3 結(jié)論與討論

本研究在細(xì)胞器-細(xì)胞-組織3個(gè)層面上評(píng)價(jià)紫甘藍(lán)食用色素防護(hù)細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的作用，結(jié)果表明紫甘藍(lán)食用色素能夠清除·OH，具有顯著的體外抗氧化活性，具有一定的量效關(guān)系。

花色苷類物質(zhì)具有多酚羥基結(jié)構(gòu)，而通常認(rèn)為酚羥基是抗氧化活性的原因所在，如結(jié)構(gòu)中B環(huán)上羥基的數(shù)量、位置是其清除活性氧自由基能力的決定因素；C環(huán)上3-OH能增強(qiáng)清除自由基的能力；B環(huán)上3'、4'鄰二羥基結(jié)構(gòu)能夠極大增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化抑制能力[17]。紫甘藍(lán)食用色素屬于矢車菊素花色苷[5]，母核結(jié)構(gòu)如圖5，其能夠有效抑制生物體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，可能與其母核結(jié)構(gòu)中B環(huán)上存在3'、4'鄰二羥基有關(guān)，本研究試驗(yàn)結(jié)果與理論相符。

天然色素的需求量越來(lái)越大，具有功能作用的花色苷類色素尤其受到關(guān)注。開發(fā)花色苷類色素，不僅要研究體外活性，其在體內(nèi)的吸收、代謝及功能作用的發(fā)揮情況，更是下一步研究的重點(diǎn)。

圖5 矢車菊素花色苷的基本結(jié)構(gòu)Fig.5 Basic chem icalstructureof cyanidin

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Inhibitory Activity of the Natural Pigm ents from Red Cabbage to Cellular Lipid Peroxidation

WANGZhong-bo，ZHANGZhi-fei，YAOYan-yan，LIYang*
（SchoolofPharmacy，North China University of Scienceand Technology，Tangshan 063000，Hebei，China）

The objective of thiswork was to study the inhibitory activity of the natural pigments from red cabbage to cellular lipid peroxidation.ThemethodsofH2O2-induced erythrocyte hemolysisand lipid peroxidation of liver homogenate，mitochondrial swelling and scavenging hydroxyl radicalwere used to evaluate the inhibitory activity.The results showed that the natural pigments from red cabbage inhibited erythrocyte hemolysis，lipid peroxidation andmitochondrialswelling significantly andwere scavengersofhydroxyl radical.The inhibitory activity showed a dose-dependent increase in the assays.The naturalpigments from red cabbage could inhibit cellular lipid peroxidation andmightbedeveloped asedible pigmentwith broad prospects.

redcabbage；naturalediblepigment；lipidperoxidation；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.009

2016-04-14

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H2016209319）；河北省省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（X2015062）

王忠博（1993—），男（漢），在讀本科，主要從事天然產(chǎn)物生物活性研究。

*通信作者：李洋（1983—），男（漢），講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物的化學(xué)與生物活性研究。