平貝黑腐病發(fā)生的土壤微生態(tài)機(jī)制及拮抗細(xì)菌初步篩選*

宋小雙 遇文婧 周 琦 鄧 勛

（黑龍江省森林保護(hù)研究所，哈爾濱 150040）

平貝黑腐病發(fā)生的土壤微生態(tài)機(jī)制及拮抗細(xì)菌初步篩選*

宋小雙 遇文婧 周 琦 鄧 勛*

（黑龍江省森林保護(hù)研究所，哈爾濱 150040）

采用土壤微生物學(xué)和植物病理學(xué)研究方法，以平貝黑腐病發(fā)病植株和健康植株根區(qū)土壤為研究對象，研究土壤養(yǎng)分、微生物區(qū)系組成同平貝黑腐病發(fā)生的相關(guān)性，并對健康植株根區(qū)土壤中黑腐病病原菌的高效拮抗細(xì)菌進(jìn)行了初步篩選。結(jié)果表明：根區(qū)土壤pH值下降，鹽分含量提高及土壤有機(jī)質(zhì)與速效磷、鉀供給不足等可導(dǎo)致黑腐病發(fā)生；平貝根區(qū)土壤微生物區(qū)系組成及其多樣性的變化，尤其是真菌數(shù)量的上升是平貝黑腐病發(fā)生的主要原因；分離篩選得到3株可顯著抑制黑腐病病原菌生長的細(xì)菌菌株，其中菌株SF013對病原菌生長抑制作用最好，對峙培養(yǎng)和發(fā)酵液抑菌率分別為79.11%和85.19%。

平貝黑腐?。幌到y(tǒng)發(fā)病機(jī)制；生防細(xì)菌篩選

平貝黑腐病(Sclerotinia sclerotiorum)是平貝最重要的病害，又名菌核病，屬于土傳病害，以土壤為媒介進(jìn)行傳播，嚴(yán)重可導(dǎo)致平貝絕產(chǎn)[1]。目前，黑龍江省森工林區(qū)平貝栽培已有30多年的歷史，主要采取連作模式，有關(guān)研究表明，連作條件下作物土傳病害的發(fā)生與根際土壤微生物區(qū)系發(fā)生異常變化密切相關(guān)[2]，而土壤微生物區(qū)系和養(yǎng)分的變化是土傳病害發(fā)生的主要原因[3-7]，但目前平貝根腐病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制還沒有相關(guān)報(bào)道。因此本文通過對平貝黑腐病發(fā)病植株和健康植株土壤微生物區(qū)系及養(yǎng)分的比較研究，揭示平貝黑腐病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制，同時(shí)篩選平貝健康植株根際土壤中的高效拮抗細(xì)菌菌株，旨在為平貝黑腐病的微生態(tài)調(diào)控修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于牡丹江市海林林業(yè)局三十五林場平貝栽培基地（44°52′41.89″N，129°19′40.92″E），平貝種植面積2.78 hm2，始栽于1980年，為多年連作栽培模式。該地區(qū)年有效積溫2 400℃，全年日照時(shí)數(shù)2 540 h，年平均降水量550 mm，無霜期125天左右。近年平貝黑腐病、灰霉病發(fā)生嚴(yán)重，發(fā)病率50%以上。

1.1.2 采樣時(shí)間及方法

于2014年5月，在三十五林場平貝栽培地，分別采集平貝健康和發(fā)病地塊的土壤樣品。土壤采集深度為5～10 cm，隨機(jī)取5個(gè)點(diǎn)采集后混合，裝入自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。

1.1.3 培養(yǎng)基

細(xì)菌、真菌和放線菌所用培養(yǎng)基分別為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（BPA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和高氏一號培養(yǎng)基（GA）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)病與健康地塊土壤養(yǎng)分分析

土壤pH值采用電位法，可溶性鹽分采用蒸干法，有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法，土壤銨態(tài)氮采用氯化鉀浸提靛酚藍(lán)比色法，速效磷用碳酸氫鈉浸提鉬銻抗比色法，速效鉀用醋酸銨浸提火焰光度法測定[8]。

1.2.2 發(fā)病與健康地塊土壤微生物區(qū)系的測定

土壤微生物計(jì)數(shù)采用土壤稀釋后平皿涂抹法[9]，對供試土壤樣品中的細(xì)菌、放線菌和真菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，每處理設(shè)3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)，涂平板后，在操作臺中用無菌風(fēng)吹干平板，置于28℃培養(yǎng)。完成計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)后，進(jìn)行土壤微生物多樣性計(jì)算，包括微生物多樣性Shannon-Wienner指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（S）、均勻度Pielou指數(shù)（J）。

1.2.3 平貝黑腐病拮抗細(xì)菌的初步篩選

分別采用平板對峙培養(yǎng)法和發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)[10-12]，測定平貝健康地塊根區(qū)土壤細(xì)菌對平貝黑腐病病原菌的抑制作用，以普通平板為對照，測定菌落直徑，按公式計(jì)算抑菌率，篩選高效拮抗細(xì)菌菌株。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用進(jìn)行方差分析，平均數(shù)按新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病與健康地塊土壤養(yǎng)分分析

通過測定土壤pH值、鹽分、有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、速效磷和速效鉀6個(gè)指標(biāo)來比較分析平貝黑腐病發(fā)病與健康地塊土壤化學(xué)性質(zhì)的差異（表1），通過方差分析結(jié)果表明：發(fā)病和健康地塊測定的土壤指標(biāo)均存在顯著性差異（P＜0.05），其中發(fā)病地塊土壤鹽分和銨態(tài)氮分別提高37.28%和12.72%，而有機(jī)質(zhì)、速效磷和速效鉀分別降低19.38%、23.61%和32.72%，說明平貝根區(qū)土壤中養(yǎng)分的變化，如有機(jī)質(zhì)與速效磷鉀供給不足、鹽分含量大幅提高及pH下降等土壤化學(xué)性質(zhì)變化是導(dǎo)致平貝黑腐病發(fā)生的微生態(tài)因素之一。

表1 平貝黑腐病發(fā)病地塊與健康地塊土壤養(yǎng)分分析

2.2 發(fā)病與健康地塊土壤微生物區(qū)系的分析

基于土壤微生物數(shù)量組成和多樣性分析，同平貝健康植株地塊土壤相比，微生物數(shù)量存在顯著性差異（P＜0.05），平貝黑腐病發(fā)病地塊土壤細(xì)菌、真菌數(shù)量分別提高113.15%和68.43%，而放線菌數(shù)量降低39.67%（表2）。上述結(jié)果表明：平貝健康植株與發(fā)病植株根區(qū)土壤微生物數(shù)量發(fā)生變化，其中細(xì)菌數(shù)量增加與平貝鱗莖發(fā)生不同程度腐爛導(dǎo)致組織分解液外滲、土壤營養(yǎng)條件改變、細(xì)菌大量生長繁殖有關(guān)，而真菌數(shù)量增加與土壤微生態(tài)環(huán)境破壞、平貝黑腐病原真菌大量繁殖有關(guān)。

表2 平貝黑腐病發(fā)病地塊與健康地塊微生物數(shù)量

發(fā)病土壤細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)H、豐富度指數(shù)S、均勻度指數(shù)J均低于健康土壤（表3），也反映發(fā)病土壤中微生物數(shù)量呈現(xiàn)單一化趨勢。同微生物數(shù)量結(jié)合分析可知：平貝黑腐病發(fā)病地塊病原真菌過量繁殖，導(dǎo)致微生態(tài)系統(tǒng)破壞，是土傳病害發(fā)生的根本原因。

表3 平貝黑腐病發(fā)病地塊與健康地塊土壤微生物多樣性（H）、豐富度（S）、均勻度指數(shù)（J）指數(shù)分析

2.3 平貝黑腐病高效拮抗細(xì)菌的初步篩選

通過對峙培養(yǎng)和發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)，初步篩選得到9株對平貝黑腐病病原菌有抑制作用的細(xì)菌菌株（表4），不同菌株對病原菌的抑制作用存在顯著性差異（P＜0.05），其中菌株SF013對病原菌生長抑制作用最好，對峙培養(yǎng)和發(fā)酵液抑菌率分別為79.11%和85.19%，其次為菌株SF007，對峙培養(yǎng)和發(fā)酵液抑菌率分別為77.85%和79.12%，菌株SF003的對峙培養(yǎng)和發(fā)酵液抑菌率分別為60.15%和65.25%，對病原菌生長也具有抑制作用。

表4 抑菌率

3 結(jié)論

3.1 平貝黑腐病發(fā)病與健康植株根區(qū)土壤化學(xué)性質(zhì)存在顯著差異。

3.2 平貝黑腐病的發(fā)生與根區(qū)土壤pH值下降，鹽分含量提高及土壤有機(jī)質(zhì)與速效磷、鉀供給不足等土壤化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化有關(guān)。

3.3 平貝黑腐病發(fā)病與健康植株微生物區(qū)系也存在顯著差異。發(fā)病植株根區(qū)土壤中細(xì)菌與真菌數(shù)量同健康植株相比顯著提高，同時(shí)微生物多樣性、豐富度和均勻度指數(shù)均降低，微生物群落結(jié)構(gòu)趨于真菌主導(dǎo)型。

3.4 平貝根區(qū)土壤微生態(tài)系統(tǒng)中土壤化學(xué)性質(zhì)及根區(qū)微生物區(qū)系組成及其多樣性的變化是平貝黑腐病發(fā)生的主要原因，在分析發(fā)病微生態(tài)機(jī)制基礎(chǔ)上，測定了健康平貝植株根區(qū)土壤細(xì)菌對平貝黑腐病菌的抑制作用，篩選得到3株具有生防潛力的細(xì)菌菌株，為平貝黑腐病的微生態(tài)調(diào)控打下良好基礎(chǔ)。

［1］宋小雙,遇文靜,嚴(yán)大川,等.平貝黑腐病病原菌分離鑒定和生物學(xué)特性的初步研究［J］.中國森林病蟲,2016(03):7-11.

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第1作者簡介：宋小雙（1977-），女，副研究員，博士，主要研究方向：生物防治及生防菌劑研發(fā)。通訊作者：鄧勛（1978-），男，研究員，博士，主要

（責(zé)任編輯：李丹）

Microbial Ecological Study about the Black Rot of Fritillaria ussuriensis and Its Biological Control Bacteria Screening

SONGXiaoshuang
（Forestry Protection Institute of Heilongjiang Forestry Academy,Harbin150081）

Black rot is the most important disease for Fritillaria ussuriensis,In this paper,the root-zone soil of the healthy and disease plant are studied by the method of soil microbiology and plant pathology to understand the micro ecological mechanism of Fritillaria ussuriensis black rot disease,and then screened the biological control bacteria.The results showed that:1)pH value decreased,increase in salt content,soil organic matter and available phosphorus and potassium of root-zone soil,can lead to the occur of black rot disease.2)The composition and diversity of root-zone soil microbial flora,especially the increase of the number of fungi was the main reason for the occurrence of black rot disease.3)Three biological control bacteria were screened by dural culture and fermentation broth inhibition test,in them the strain SF013 have the best inhibition effect,the inhibition rate of dural culture and fermentation broth inhibition test are 79.11% and 85.19%respectively.

Black Rot of Fritillaria ussuriensis;System pathogenesis;Biological control bacteria screening

S567.23+1,S436.631+4

A

1001-9499（2016）06-0018-03

菌物開發(fā)利用及林木病害可持續(xù)控制。

2016-08-11

*黑龍江省森工總局項(xiàng)目（SGZJY2012016，SGZJY2010014）;國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200484，31170597）