超聲輔助提取莢果蕨總黃酮的響應(yīng)面優(yōu)化

施偉梅,夏侯國論,盧 凱

(1.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000；2. 廣州城市職業(yè)學(xué)院科技中心，廣東 廣州 510405)

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超聲輔助提取莢果蕨總黃酮的響應(yīng)面優(yōu)化

施偉梅1*,夏侯國論2,盧 凱1

(1.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000；2. 廣州城市職業(yè)學(xué)院科技中心，廣東 廣州 510405)

利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取莢果蕨總黃酮工藝。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了超聲溫度、乙醇濃度、液料比及超聲時(shí)間4個(gè)因素及因素間交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響，建立了回歸模型。結(jié)果表明，超聲輔助提取莢果蕨總黃酮的最佳工藝為：超聲溫度65℃、乙醇濃度60%、液料比21∶1、超聲時(shí)間35min，在此條件下，總黃酮的提取率為1.256%，與預(yù)測值相對(duì)誤差為0.641%，驗(yàn)證了該模型的有效性，該工藝與傳統(tǒng)提取方法相比，提取率提高了18.49%，是一種高效快速提取莢果蕨總黃酮的方法。

莢果蕨；總黃酮；提??；響應(yīng)面分析

莢果蕨(Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro)又名黃瓜香、野雞膀子，是球子蕨科莢果蕨屬多年生草本植物[1-2]。莢果蕨，具有清熱解毒、殺蟲、止血的功效，是常用中藥貫眾[3]的主流品種之一；其幼葉清香可口，質(zhì)地脆嫩，是營養(yǎng)價(jià)值極高的山野菜，更是難得的藥、食同源植物。研究表明，莢果蕨富含蛋白質(zhì)、多糖及多種微量元素，還有黃酮、蛻皮甾酮等活性成分[4-6]。黃酮類化合物是一類擁有多樣生物活性的植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗衰老、抗癌、抑菌、保健等功效[7-8]，迄今為止，對(duì)莢果蕨黃酮的研究報(bào)道較少，主要集中在對(duì)黃酮成分[9]的研究上，而對(duì)莢果蕨黃酮的提取方法還沒有系統(tǒng)深入的研究報(bào)道。近年來，超聲波輔助提取技術(shù)由于具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的分離提取[10-11]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取法對(duì)莢果蕨總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究，并以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)法優(yōu)化其超聲提取工藝，旨在為進(jìn)一步研究開發(fā)莢果蕨提供依據(jù)。

一、實(shí)驗(yàn)部分

(一)儀器與試劑

Lambda 35紫外可見分光光度，美國珀金埃爾默公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司； DHG-9070電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TDL-50B臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；Q-250B高速萬能粉碎機(jī)：上海冰都電器有限公司；AB135-S電子分析天平，上海樹信儀表有限公司。

莢果蕨：采于四川省南充西山，在50℃烘箱中烘干至恒重后粉碎，過60目篩，置于干燥皿中密封保存?zhèn)溆茫惶J丁對(duì)照品，中國藥品生物制品檢定所；乙醇，分析純，使用時(shí)，配制成不同體積濃度的乙醇溶液；其它試劑均為分析純。

(二)試驗(yàn)方法

1.總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-AL(NO3)3比色法[12]，在波長510nm處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，

并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=10.89X-0.0029，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。

將從莢果蕨中提取的待測液用上述方法進(jìn)行測定，所得的吸光度代入回歸方程中得到總黃酮質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算總黃酮的提取率。

式中：b為莢果蕨提取液總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為莢果蕨粉末的質(zhì)量，mg。

2.莢果蕨總黃酮的乙醇回流提取

莢果蕨粉末2.000g→乙醚脫脂8h→乙醇水浴提取→趁熱抽濾→定容→提取液→測吸光度A，計(jì)算總黃酮提取率。

3.莢果蕨總黃酮的超聲提取

精確稱取一定量的莢果蕨粉末，加入一定濃度乙醇，按照設(shè)定的程序進(jìn)行超聲輔助提取莢果蕨中的總黃酮，抽濾，濾液定容，測吸光度A，計(jì)算總黃酮提取率。

(三)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)研究了超聲溫度、乙醇濃度、液料比和超聲時(shí)間對(duì)莢果蕨中總黃酮提取效果的影響。

2.響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用Design-Expert8.0.6軟件數(shù)據(jù)分析，根據(jù)Box-Behnken建立數(shù)學(xué)模型，以超聲溫度(X1)、乙醇濃度(X2)、液料比(X3)和超聲時(shí)間(X4)為自變量，+1、0、-1代表自變量的高、中、低水平，莢果蕨總黃酮提取率(Y)為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)曲面因素與水平表

3.驗(yàn)證與比較試驗(yàn)

通過軟件分析獲得最佳提取工藝條件后，按照優(yōu)化條件進(jìn)行提取測定，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方程計(jì)算值的差異。并將該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)乙醇提取結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，探討2種方法對(duì)莢果蕨總黃酮提取效果的影響。

二、結(jié)果與分析

(一)單因素試驗(yàn)

1.超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

1.31.21.11.00.90.8提取率/%超聲溫度/℃5560657075

圖1 超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

固定乙醇濃度為70%、液料比為20∶1、超聲時(shí)間為30min，考察了不同超聲溫度對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1可看出，隨著溫度升高，總黃酮提取率不斷升高，65℃時(shí)達(dá)到最大，繼續(xù)升高溫度，提取率反而下降。這是因?yàn)殡S著溫度升高，增加了溶液中總黃酮的溶解性，超出65℃之后，由于溫度過高，會(huì)導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)被氧化而使得提取率降低，因此，最佳的溫度選擇為65℃。

2.乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

固定超聲溫度為65℃、液料比為20∶1、超聲時(shí)間為30min，考察了不同乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖2可看出，莢果蕨總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加，呈先增加后降低的趨勢，乙醇濃度為60%時(shí)，提取率達(dá)到最高。這可能是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增加，溶劑的極性減小，增大了黃酮類物質(zhì)的溶解性；當(dāng)乙醇濃度超過60%后，莢果蕨中一些極性較弱的成分不斷溶出，增加了與黃酮類物質(zhì)的溶出競爭[13]，導(dǎo)致總黃酮提取率下降。因此，最佳乙醇濃度選定為60%。

固定超聲溫度為65℃、乙醇濃度為60%、超聲時(shí)間為30min，考察了不同液料比對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可看出，隨著液料比的增加，莢果蕨總黃酮的提取率逐漸增加，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增大液料比，反而導(dǎo)致提取率降低。這是因?yàn)殡S著液料比的增大，溶劑與莢果蕨的接觸面積增加，莢果蕨顆粒內(nèi)外的濃度差增大，增加了傳質(zhì)推動(dòng)力，使總黃酮更易溶出與擴(kuò)散；當(dāng)液料比超過20∶1時(shí)，溶劑量過大，增加了濃縮過程中總黃酮的損失[14]，造成了總黃酮提取率的下降，因此，最佳的液料比選擇為20∶1。

1.31.21.11.00.90.8提取率/%超聲溫度/℃5560657075

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

圖3 液料比對(duì)總黃酮提取率的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

3.超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

固定超聲溫度為65℃、乙醇濃度為60%、液料比為20:1，考察不同超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。從圖4可看出，隨著超聲時(shí)間的延長，總黃酮的提取率增大，當(dāng)超聲時(shí)間為35min時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加超聲時(shí)間，總黃酮提取率反而有所下降。這是因?yàn)槌晻r(shí)間過長，容易使黃酮類物質(zhì)氧化而破壞。另外，超聲時(shí)間過長，溶出的雜質(zhì)增加，將抑制黃酮類物質(zhì)的溶出，而最終導(dǎo)致總黃酮提取率的下降。因此，最佳超聲時(shí)間選擇為35min。

(二)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

1.響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取超聲溫度(X1)、乙醇濃度(X2)、液料比(X3)和超聲時(shí)間(X4)四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)表見表2，響應(yīng)面分析方案見表3。

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)以及響應(yīng)值

表3 響應(yīng)曲面方差分析表

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

表4 Box-Behnken 的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從方差分析表3可知，由試驗(yàn)數(shù)據(jù)所得模型失擬度F=29.50，P <0.0001，表示該模型顯著。由模型擬合得到的回歸方程為： Y=-24.55+0.52X1+0.16X2+0.04X3+0.20X4+4.50×10-4X1X2+1.10×10-4X1X3+9.30×10-4X1X4+3.00×10-5X2X3+1.04×10-3X2X4-1.40×10-4X3X4-4.48×10-3X12-1.86×10-3X22-1.01×10-3X32-4.50×10-3X42，其方程的R2為0.967 2。方程中P<0.05 的項(xiàng)代表顯著項(xiàng)，包括X1、X3、X4及二次項(xiàng)X1X4、X2X4、X12、X22、X32、X42，表明各影響因素與響應(yīng)值的關(guān)系并不是簡單的線性關(guān)系，各因素之間的交互作用對(duì)莢果蕨總黃酮的提取有影響。方程的失擬度F=2.43，P=0.203 3>0.05，表示失擬度不顯著，說明該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。由表4可知，該模型的調(diào)整系數(shù)為0.9344，表明莢果蕨總黃酮提取率的實(shí)際值與預(yù)測值之間具有很好的擬合度，可以用該模型對(duì)莢果蕨總黃酮的提取率進(jìn)行預(yù)測和分析。

2.試驗(yàn)因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的3D分析

各試驗(yàn)因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響可以通過響應(yīng)面3D圖直觀反映出來，結(jié)果見圖5。由圖5可知，并不是所有因素對(duì)莢果蕨總黃酮的提取都有顯著的影響，超聲溫度的影響最為顯著，隨著超聲溫度的升高，總黃酮提取率隨之增大，隨后超聲溫度繼續(xù)增大，總黃酮提取率則明顯下降，表現(xiàn)為曲面較陡; 超聲時(shí)間的影響次之，表現(xiàn)為曲面較平緩，響應(yīng)值變化較??；乙醇濃度和液料比對(duì)總黃酮提取率的影響不顯著，曲面基本表現(xiàn)為平直線。各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小是不同的，主次因素順序?yàn)槌暅囟?超聲時(shí)間>乙醇濃度>液料比。

3.最佳提取工藝的優(yōu)化及驗(yàn)證

根據(jù)回歸模型，利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到最優(yōu)提取工藝為：超聲溫度65.46℃、乙醇濃度60.19%、液料比為21.39∶1，超聲時(shí)間35.36min，莢果蕨總黃酮提取率最大預(yù)測值為1.248%。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃裕瑢?duì)上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行了提取試驗(yàn)?？紤]到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：超聲溫度65℃、乙醇濃度60%、液料比為21∶1，超聲時(shí)間35min。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際提取率平均值為1.256%，略高于DesignExpert軟件的預(yù)測值，測定結(jié)果重現(xiàn)性良好，相對(duì)于預(yù)測值，誤差為0.641%，驗(yàn)證了該數(shù)學(xué)模型的有效性。且該超聲輔助提取工藝與傳統(tǒng)乙醇提取法相比，提取率提高了18.49%，詳見表5?？梢姡捎庙憫?yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)可靠，得到的總黃酮提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

三、結(jié)論

采用響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助提取莢果蕨總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立數(shù)學(xué)模型。利用模型方程優(yōu)化出莢果蕨總黃酮的最佳提取工藝為：超聲溫度65℃、乙醇濃度60%、液料比為21:1，超聲時(shí)間35min。經(jīng)過驗(yàn)證，實(shí)際提取率為1.256%，理論值為1.248%，其相對(duì)誤差為0.641%，說明實(shí)際值與預(yù)測值擬合度良好。模型響應(yīng)曲面圖表明影響莢果蕨總黃酮提取率的因素依次為：超聲溫度>超聲時(shí)間>乙醇濃度>液料比。該工藝相比于傳統(tǒng)提取工藝，提取率提高了18.49%。響應(yīng)面法對(duì)莢果蕨總黃酮的提取條件優(yōu)化合理可行，為提高莢果蕨總黃酮的提取率提供了理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 潘志和)

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Flavonoids fromMatteucciastruthiopteris(L.) Todaro

SHIWei-mei1，XIAHOUGuo-lun2，LUKai1

(1.College of Pharmacy, Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China;2. Science & Technology Center, Guangzhou City Polytechnic, Guangzhou 510405, China)

Response surface methodology was used to determine optimum condition for ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids fromMatteucciastruthiopteris(L.) Todaro. The extraction temperature, concentration of ethanol, liquid-solid ratio and extraction time were chosen to carry out the single factor experiment. The effect of each factor and their interactions on total flavonoids was studied according to the Box-Behnken response surface methodology, and the regression model was established. The results showed that the optimum extraction condition was: extraction temperature 65℃, concentration of ethanol 60%, liquid-solid ratio 21:1 and extraction time 35min, respectively. Under these conditions, the yield of total flavonoids was 1.256%. Compared to the predictive value the relative error was 0.641%, indicating that the regression model fitted well with the experimental data. Moreover, the extraction yield was increased by 18.49% as compared to the traditional extraction method, stated that it could be a rapid and efficient extraction method for flavonoids fromMatteucciastruthiopteris(L.) Todaro.

Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro; flavonoids; extraction; response surface methodology

2016-09-10

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(150949)；贛南醫(yī)學(xué)院科研課題(YB201429)

施偉梅，女，贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院講師。

R284.2

A

1674-0408(2016)04-0030-07