軟棗獼猴桃‘天源紅’離體再生體系的建立

林苗苗， 方金豹， 齊秀娟， 陳錦永， 顧 紅， 張威遠(yuǎn)， 孫雷明

( 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所， 鄭州 450009 )

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軟棗獼猴桃‘天源紅’離體再生體系的建立

林苗苗， 方金豹*， 齊秀娟， 陳錦永， 顧 紅， 張威遠(yuǎn)， 孫雷明

( 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所， 鄭州 450009 )

為了建立快速高效的全紅型軟棗獼猴桃離體再生體系，該研究以果皮、果肉均為紅色的軟棗獼猴桃新品種‘天源紅’(Actinidiaarguta)帶腋芽莖段和幼嫩葉片、葉柄為外植體材料，采用組織培養(yǎng)的方法，研究適合其離體再生的外植體類型以及最佳植物生長物質(zhì)組合。結(jié)果表明：初春帶腋芽的莖段是最好的獲得無菌苗的外植體材料,誘導(dǎo)腋芽出芽的最佳植物生長物質(zhì)組合為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1；研究發(fā)現(xiàn)葉柄比葉片更適合進(jìn)行‘天源紅’愈傷組織誘導(dǎo)，葉柄誘導(dǎo)的最佳植物生長物質(zhì)組合為MS+ZT 0.5 mg·L-1；同時(shí)，研究了不定芽增殖的最佳植物生長物質(zhì)組合為MS+ZT 1.0 mg·L-1；此外使用6-BA也可以達(dá)到較高的不定芽增殖率，在生產(chǎn)上可以替代ZT進(jìn)行不定芽分化，即MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1；較適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1；生根后的組培苗在珍珠巖∶泥炭∶細(xì)沙=1∶1∶1的基質(zhì)配比中能夠達(dá)到98%的移栽成活率。該研究結(jié)果建立了全紅型軟棗獼猴桃的離體再生體系，為全紅型軟棗獼猴桃苗木快繁、工廠化育苗提供了技術(shù)支持，同時(shí)建立的再生體系為軟棗獼猴桃遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了基礎(chǔ)。

全紅型軟棗獼猴桃, 組織培養(yǎng), 愈傷組織, 叢生芽

軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)屬于獼猴桃科(Actirlidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)，從20世紀(jì)90年代開始人工馴化栽培，目前生產(chǎn)上的軟棗獼猴桃栽培品種主要以綠色為主，紅色較為少見(齊秀娟等2014)，與中華獼猴桃和美味獼猴桃相比，它具有不需后熟可直接帶皮食用的優(yōu)點(diǎn)?！煸醇t’(A.arguta)品種是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所選育的國內(nèi)首個(gè)果皮、果肉均為紅色的軟棗獼猴桃。由于其果皮、果肉均為紅色的特點(diǎn)，可作為遺傳轉(zhuǎn)化研究的較為特殊的材料。全紅型軟棗獼猴桃在生態(tài)農(nóng)業(yè)中迅速推廣，特別是在觀光果園和采摘園中很受歡迎，具有較好的市場前景，亟需大量的苗木，而傳統(tǒng)的嫁接繁殖不能滿足市場需求。因此研究全紅型軟棗獼猴桃的離體再生體系無論對生產(chǎn)還是科學(xué)研究都非常必要。

關(guān)于軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)的研究最早的報(bào)道是1981年洪樹榮采用軟棗獼猴桃莖段誘導(dǎo)愈傷，此后張遠(yuǎn)記等(1996)、朱道圩等(1997)、劉長江等(2009)采用軟棗獼猴桃葉片、莖段、莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，目前僅有‘魁綠’品種的組培微繁技術(shù)體系(胡皓和張志東， 2011)，關(guān)于‘天源紅’的組織培養(yǎng)尚未有報(bào)道。由于獼猴桃基因型復(fù)雜，而組織培養(yǎng)體系又受到基因型的影響(黃宏文等 2013)，因此需要針對‘天源紅’品種篩選適宜的植物生長物質(zhì)組合。本研究以‘天源紅’獼猴桃葉片、葉柄和帶芽莖段為材料，通過葉片、葉柄愈傷組織的形成產(chǎn)生不定芽和誘導(dǎo)帶芽莖段直接出芽兩條途徑獲得無菌苗，并進(jìn)行增殖以及生根培養(yǎng)，建立‘天源紅’獼猴桃的快速繁殖體系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為全紅型軟棗獼猴桃‘天源紅’，栽種于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所獼猴桃資源圃(34°71′ N，113°71′ E)。以春季剛發(fā)芽新稍莖段、葉片和葉柄作為外植體材料。

1.2 方法

1.2.1帶芽莖段出苗誘導(dǎo) 截取軟棗獼猴桃‘天源紅’新發(fā)枝條上端10 cm，截成3 cm左右?guī)а壳o段，芽上下各1.5 cm，用洗潔精洗凈，在流水下沖洗1～2 h；在超凈工作臺上，將莖段在75%酒精中消毒，消毒后用無菌水沖洗2次，置于0.1%升汞中消毒，無菌水沖洗4～5次，放在濾紙上，將材料剪成1 cm左右?guī)а壳o段(芽下部莖稍長些)供接種使用。

消毒后的莖段外植體分別接種于5種添加不同植物生長物質(zhì)(6-BA、IBA)的MS培養(yǎng)基中，每瓶放置3個(gè)莖段，每個(gè)處理10瓶，共30個(gè)重復(fù)，觀察發(fā)芽生長情況。

1.2.2 葉片、葉柄不定芽誘導(dǎo) 以新稍葉片為材料，帶回實(shí)驗(yàn)室經(jīng)洗潔精洗凈后，流水沖洗1～2 h；在超凈臺中，經(jīng)酒精和升汞消毒后，用無菌水沖洗4～5次，放在濾紙上，葉片橫截葉脈剪成寬0.2 cm寬的細(xì)長條，葉柄剪成0.5 cm長，分別接種于7種添加不同植物生長物質(zhì)(6-BA、NAA、ZT)的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理6瓶，每瓶放置5片剪好的葉片或葉柄，共30個(gè)重復(fù)，觀察愈傷形成、出芽生長情況。

1.2.3 不定芽增殖 經(jīng)腋芽萌發(fā)和葉片、葉柄愈傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽，需進(jìn)行增殖培養(yǎng)。將萌發(fā)后的幼嫩無菌苗1～2 cm轉(zhuǎn)移到6種添加不同植物生長物質(zhì)(6-BA、IBA、NAA、ZT)的MS培養(yǎng)基中，每個(gè)處理10 瓶，每瓶3棵，共30個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察不定芽的分化和生長情況，計(jì)算增殖系數(shù)。

1.2.4根的誘導(dǎo) 以1/2 MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，將誘導(dǎo)產(chǎn)生的>2 cm的不定芽接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基共設(shè)計(jì)4種不同濃度的IBA、NNA組合，每個(gè)濃度轉(zhuǎn)入10瓶，每瓶3棵已長好的不定芽，共30個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察并記錄生根情況。

1.2.5煉苗與移栽 將生根后的組培瓶移入日光溫室煉苗，遮蔭3 d不開瓶口，擰松瓶口放置1 d，將瓶口敞開2 d，之后進(jìn)行移栽，控制氣溫不超過30 ℃，空氣相對濕度在90%以上。移栽所用基質(zhì)為珍珠巖∶泥炭∶細(xì)沙=1∶1∶1，基質(zhì)用多菌靈消毒晾干后備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長物質(zhì)對全紅型軟棗獼猴桃腋芽出芽的影響

在統(tǒng)計(jì)時(shí)排除外植體污染情況，單從萌芽率計(jì)算，‘天源紅’莖段在不同濃度的植物生長物質(zhì)中都有較高的萌芽率，接種后表型觀察發(fā)現(xiàn)添加NAA的組合莖部愈傷產(chǎn)生較多，雖然觀察到腋芽發(fā)芽，但苗伸長不好，不利于接種；6-BA和IBA的組合萌芽率較高，特別在6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1濃度下，萌芽率可達(dá)到100%(圖版Ⅰ：1)。

表 1 不同植物生長物質(zhì)組合對‘天源紅’外植體腋芽出芽的影響

Table 1 Effects of different growth regulator substance on axillary bud germination in ‘Tianyuanhong’

植物生長物質(zhì)組合Growthregulatorsubstance6?BA(mg·L?1)IBA(mg·L?1)NAA(mg·L?1)外植體數(shù)Numberofexplants萌芽數(shù)Numberofbud萌芽率Budpercentage(%)0．50．503027900．51．0030301001．01．003026871．000．13024802．000．1302790

2.2 不同植物生長物質(zhì)對全紅型軟棗獼猴桃葉片、葉柄愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽形成的影響

葉片在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中快速膨大生長，并且在靠近葉脈的位置易形成愈傷組織，但愈傷組織較為質(zhì)密，而葉緣部位不容易有愈傷產(chǎn)生，盡管在每個(gè)組合中都有愈傷組織的產(chǎn)生，但出芽率較低，僅在ZT 0.5 mg·L-1時(shí)有的出芽率(圖版Ⅰ：2，表2)，在6-BA+NAA的組合中，愈傷誘導(dǎo)率尚可，但出芽率也較低。

相對于葉片，葉柄更容易出芽，愈傷組織產(chǎn)生在葉柄兩端，逐漸膨大出芽，在單加ZT的培養(yǎng)基中，隨著ZT濃度增高，出芽率先增后減，ZT為0.5 mg·L-1時(shí)，出芽率最高，ZT濃度升高后形成的愈傷組織硬而質(zhì)密，不適宜出芽增殖，添加6-BA和NAA組合后，也會誘導(dǎo)形成愈傷組織，但出芽率如表3所示沒有加ZT效果好(圖版Ⅰ：3，表3)。

表 2 不同植物生長物質(zhì)對‘天源紅’葉片愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽形成的影響

Table 2 Effects of different growth regulator substance on bud differentiation and callus inducing of leaf in ‘Tianyuanhong’

植物生長物質(zhì)組合Growthregulatorsubstance6?BA(mg·L?1)ZT(mg·L?1)NAA(mg·L?1)外植體數(shù)Numberofexplants愈傷組織誘導(dǎo)率Callusinductionpercentage(%)出芽率Germinationpercentage(%)00．2030902700．5030884000．8030922401．003087331．000．1305002．000．1307563．000．1307013

表 3 不同植物生長物質(zhì)‘天源紅’葉柄愈傷組織和不定芽形成的影響

Table 3 Effects of different growth regulator substance on bud differentiation and callus inducing of leaf stem in ‘Tianyuanhong’

植物生長物質(zhì)組合Growthregulatorsubstance6?BA(mg·L?1)ZT(mg·L?1)NAA(mg·L?1)外植體數(shù)Numberofexplants愈傷組織誘導(dǎo)率Callusinductionpercentage(%)出芽率Germinationpercentage(%)00．20301002600．50301005000．80301003301．0030100271．000．13010062．000．130100273．000．13010033

2.3 不同植物生長物質(zhì)組合對不定芽增殖的影響

單株小苗接種于不同增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在添加ZT的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后10 d左右開始出芽，在30 d后可長成> 2 cm的高度，在ZT為1.0 mg·L-1時(shí)增殖率最大(圖版Ⅰ:4)，并且提高ZT濃度也沒有增大增殖率，我們發(fā)現(xiàn)在添加高濃度6-BA時(shí)，小苗同樣有增殖的效果，但是6-BA的濃度過高時(shí)，莖段基部愈傷組織會加速膨大，并且愈傷質(zhì)密不利于出苗。

圖版Ⅰ ‘天源紅’莖段出芽及葉片再生體系 1. 莖段腋芽; 2. 葉片愈傷; 3. 葉柄愈傷; 4. 叢生芽; 5. 生根; 6. 移栽。 Plate Ⅰ Establishment of stem budding and regeneration of leaf in ‘Tianyuanhong’ 1. Stem with axillary bud; 2. Callus of leaf; 3. Callus of leaf stem; 4. Multiple shoot clumps; 5. Shooting; 6. Transplant.

2.4 不同生根培養(yǎng)基對幼苗生根的影響

將長2.0 cm左右的單棵苗轉(zhuǎn)移到1/2 MS培養(yǎng)基中，添加不同濃度的IBA和NAA，觀察生根時(shí)發(fā)現(xiàn)有兩種生根方式，一種是莖部先形成疏松的愈傷組織，愈傷組織發(fā)出根；另一種是莖部直接發(fā)出根，這種生根方式更有助于提高移栽成活率。從表5可以看出，在NAA 0.2 mg·L-1時(shí)生根率最高，并且主要以莖部發(fā)根為主。

2.5 生根苗移栽研究

生根苗移栽在配好的基質(zhì)中，經(jīng)過30 d，成活率可達(dá)到98%以上，根系生長旺盛，可以進(jìn)行大田栽種(圖版Ⅰ：5、圖版Ⅰ：6)。

3 討論與結(jié)論

本研究采取兩種途徑獲得‘天源紅’獼猴桃無菌苗的方法， 其中帶芽莖段直接出苗的方法可以較快地獲得無菌苗；在葉片和葉柄通過愈傷組織出芽的方式中，葉柄的愈傷誘導(dǎo)率和出芽率都較高，而葉片的相對較低；雖然通過愈傷獲得苗的方法不如腋芽出苗快捷，但通過愈傷組織建立的再生體系可以為今后的遺傳轉(zhuǎn)化研究以及染色體倍性操作相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。本研究獲得最佳腋芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+ IBA 1.0 mg·L-1；葉柄愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + ZT 0.5 mg·L-1；增殖培養(yǎng)基為MS + ZT 1.0 mg·L-1；生根培養(yǎng)基為1/2MS + NAA 0.2 mg·L-1。

表 4 不同植物生長物質(zhì)組合對‘天源紅’不定芽增殖的影響

Table 4 Effects of different growth regulator substances on adventitious propagation in ‘Tianyuanhong’

植物生長調(diào)節(jié)劑組合GrowthregulatorsubstanceZT(mg·L?1)6?BA(mg·L?1)IBA(mg·L?1)植株數(shù)Numberofplants增殖系數(shù)Regenerationcoefficient0．500303．01．000304．52．000304．501．00．5302．002．00．5303．503．00．5302．0

表 5 不同植物生長物質(zhì)組合對‘天源紅’幼苗生根的影響

Table 5 Effects of different growth regulator substances on rooting in ‘Tianyuanhong’

IBA(mg·L?1)NAA(mg·L?1)總株數(shù)Totalplants生根株數(shù)Numberofrooting生根率Rootingrate(%)0．708059841．0082697400．255539600．5474085

在進(jìn)行不定芽增殖時(shí)，采用腋芽出苗的方法獲得的無菌苗在遺傳上性狀更加穩(wěn)定，能夠保持品種的優(yōu)良性狀(劉翠云等,1996)。本研究中也發(fā)現(xiàn)采用帶芽莖段能夠快速地獲得無菌苗。關(guān)于軟棗獼猴桃愈傷誘導(dǎo)，前人的研究結(jié)果不一致，張遠(yuǎn)記等(1996)指出莖段容易愈傷化，但愈傷組織難以分化，葉片不易愈傷化，但愈傷組織容易分化；賈景明等(1999)以幼莖作為外植體愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)75%；本研究發(fā)現(xiàn)采用葉柄能夠很好地獲得愈傷組織并能夠進(jìn)一步分化，葉柄兩側(cè)傷口處有膨大愈傷組織產(chǎn)生，這與鄭小華(2008)的研究一致。

關(guān)于獼猴桃愈傷組織誘導(dǎo)，目前認(rèn)為ZT的使用效果最好(張遠(yuǎn)記等1996；謝志兵和魯旭東，2003)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)高濃度的6-BA可替代ZT誘導(dǎo)出芽，也有認(rèn)為適當(dāng)濃度的6-BA對獼猴桃的不定芽增殖有明顯的促進(jìn)作用，而對莖伸長卻有抑制作用(劉崢等，2013)。本研究發(fā)現(xiàn)在‘天源紅’的增殖過程中，可以采用6-BA來代替ZT，可獲得同樣的增殖效果，沒有對莖的伸長生長造成影響，也可能是由于軟棗獼猴桃本身的長勢較好；在腋芽快速出芽時(shí)也可采用6-BA代替ZT，但是愈傷誘導(dǎo)時(shí)，還沒有發(fā)現(xiàn)合適的6-BA的濃度配比能夠誘導(dǎo)出芽，因此，在愈傷誘導(dǎo)時(shí)在培養(yǎng)基中加入ZT還是快速的出芽誘導(dǎo)的方法。

獼猴桃組織培養(yǎng)是進(jìn)行獼猴桃生理生化研究和遺傳轉(zhuǎn)化研究的重要基礎(chǔ)。中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃、大籽獼猴桃、闊葉獼猴桃、毛花獼猴桃都有相關(guān)的組織培養(yǎng)的報(bào)道(秦永華等,2004)，其中研究較深入的中華獼猴桃“紅陽”已建立再生體系并導(dǎo)入抗病基因(周月等，2013)，綠肉軟棗獼猴桃原生質(zhì)體培養(yǎng)并有GFP基因轉(zhuǎn)化的研究(朱道圩，1997；朱道圩等，2003)。但是相關(guān)全紅型軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)還未有報(bào)道，全紅型軟棗獼猴桃作為新的新品種，具有很好的市場前景，同時(shí)由于其果肉全紅的特色，也是遺傳研究的較好材料。本研究的進(jìn)行，豐富了獼猴桃品種的離體再生體系，為獼猴桃新品種苗木快繁以及今后的研究中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究提供條件。

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Establishment of regeneration ofActinidiaarguta‘Tianyuanhong’

LIN Miao-Miao, FANG Jin-Bao*, QI Xiu-Juan, CHEN Jin-Yong,GU Hong, ZHANG Wei-Yuan, SUN Lei-Ming

(ZhengzhouFruitResearchInstitute,CAAS, Zhengzhou 450009, China )

‘Tianyuanhong’ was a newActinidiaargutacultivar, with all red pericarp and pulp. In order to establish the rapid and efficient propagation systeminvitroin ‘Tianyuanhong’, we used stem with axillary bud, young leaf and leaf stem of ‘Tianyuanhong’ as the explants, and used tissue culture methods to study explant types and the best plant growth regulator substance combination in this cultivar. The result showed that stem with axillary bud that sprout in early spring was the best explants, and MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1was the suitable plant growth substances combination; leaf stem was the better experimental material than leaf to induce callus, MS+ZT 0.5 mg·L-1was the optimizing plant growth substances combination; the best plant growth substances combination in adventitious bud propagation was MS+ZT 1.0 mg·L-1; and 6-BA could have the same effect in adventitious bud propagation, and could replace ZT for adventitious bud propagation in production, MS+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1was well; 1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1was the best plant growth substances combination for rooting. After the seedlings rooted, transplanted the seedlings to the substrate, the seedlings could reach the 98% survival rate in the substrate with the ratio of perlite∶ peat soil∶ sand=1∶1∶1. Through this study, theinvitroregeneration system was established in all-redA.arguta‘Tianyuanhong’, which provides a good technical support for seedling micropropagation and factory nursery, at the same time, the established regeneration system provides the basis for the research of genetic transformation in all-redA.arguta.

all-redActinidiaarguta, tissue culture, callus, multiple shoot clump

10.11931/guihaia.gxzw201507025

2015-12-27

2016-03-27

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程專項(xiàng)(CAAS-ASTIP-2016-ZFRI)；河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(S2014-11)；鄭州市科技攻關(guān)項(xiàng)目 [Supported by the Agricultural Science and Technology Innovation Program (CAAS-ASTIP-2016-ZFRI); Henan Program of Agricultural Research System(S2014-11); Zhengzhou Key Scientific and Technological Program(121PPTGG466)]。

林苗苗(1985-)，女，黑龍江牡丹江人，碩士，助理研究員，從事獼猴桃組織培養(yǎng)和栽培生理研究，(E-mail)linmiaomiao@caas.cn。

*通訊作者： 方金豹，博士，研究員，從事獼猴桃栽培生理研究，(E-mail)Fangjinbao@caas.cn。

Q945.5

A

1000-3142(2016)11-1358-06

林苗苗， 方金豹， 齊秀娟， 等. 軟棗獼猴桃‘天源紅’離體再生體系的建立 [J]. 廣西植物， 2016， 36(11):1358-1362

LIN MM, FANG JB, QI XJ， et al. Establishment of regeneration ofActinidiaarguta‘Tianyuanhong’ [J]. Guihaia， 2016， 36(11):1358-1362