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    PCR結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用于肺炎支原體感染檢驗(yàn)價(jià)值評(píng)價(jià)

    2016-12-22 05:25:10顧秀玉
    關(guān)鍵詞:支原體敏感性特異性

    顧秀玉

    (江蘇省蘇州市立醫(yī)院北區(qū)檢驗(yàn)科 215008)

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    ·臨床研究·

    PCR結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用于肺炎支原體感染檢驗(yàn)價(jià)值評(píng)價(jià)

    顧秀玉

    (江蘇省蘇州市立醫(yī)院北區(qū)檢驗(yàn)科 215008)

    目的 研究分析聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用于肺炎支原體(MP)感染檢驗(yàn)的價(jià)值。方法 本次研究行回顧性調(diào)查法,采集126份MP標(biāo)本,分別采用PCR和ELISA對(duì)每個(gè)標(biāo)本的MP進(jìn)行檢測(cè),對(duì)比記錄各組標(biāo)本的檢出陽(yáng)性率,分析兩種方法結(jié)合使用進(jìn)行檢驗(yàn)的效果。結(jié)果 對(duì)于MP的檢驗(yàn),ELISA與PCR的陽(yáng)性檢出率分別82.5%、81.0%,陰性檢出率分別為17.5%、19.0%,兩組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);兩組結(jié)合使用的陰、陽(yáng)性檢出率分別為25.6%,99.3%。結(jié)論 對(duì)于MP檢測(cè)而言,PCR與ELISA對(duì)其的敏感性與特異性均較理想,兩者聯(lián)合可提高陽(yáng)性檢出率,有利于支原體肺炎疾病的早期診斷與治療。

    聚合酶鏈反應(yīng); 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn); 肺炎支原體; 聯(lián)合應(yīng)用

    近年來(lái),肺炎支原體(MP)感染率有增長(zhǎng)的趨勢(shì),尤其在兒童中的感染率[1]。MP的傳播途徑主要為呼吸道,可引發(fā)多種呼吸道疾病,甚至引起全身機(jī)體的損害?;颊吒腥綧P可出現(xiàn)支原體肺炎的癥狀,也可出現(xiàn)上呼吸道感染的癥狀,如支氣管炎、氣管炎、咽炎等。MP的感染與發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)等疾病相關(guān),并可間接引發(fā)腎炎性腎病、急性腎炎等,患者可并發(fā)出現(xiàn)心包炎、心肌炎、心功能衰竭。因此,臨床上需對(duì)MP患者盡早進(jìn)行檢查確診,但目前尚無(wú)公認(rèn)的快速準(zhǔn)確檢測(cè)方法[2]。本文圍繞PCR結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用于MP感染檢驗(yàn)的價(jià)值展開(kāi)討論,取得了較為滿意的結(jié)果,現(xiàn)具體結(jié)果報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 以2015年1~12月本院收治的126例MP感染患者為對(duì)象實(shí)施研究方案。患者年齡4個(gè)月至13歲,平均(7.2±2.6)歲。臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱咳嗽,用磺胺類或β內(nèi)酰胺類藥物治療無(wú)效,使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物后表現(xiàn)為有效,符合MP感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。并同時(shí)采集126例普通細(xì)菌性肺炎標(biāo)本作為對(duì)照組。

    1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)X線片結(jié)果顯示存在間質(zhì)改變或片狀浸潤(rùn)性陰影,或伴有出現(xiàn)胸腔積液;(2)支原體抗體的效價(jià)在急性期與恢復(fù)期以4倍及以上上升。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)本采集 標(biāo)本均在患者入院當(dāng)天采集,采集方法為靜脈取血,并立即對(duì)血清進(jìn)行分離。具體采集方法如下:選用支氣管肺泡灌洗液法(BALF),纖支鏡型號(hào)為Olympus-P30,在麻醉與術(shù)前準(zhǔn)備工作完成后,清除患者段支氣管處的開(kāi)口處痰液、分泌物、局麻所用藥物。隨后,在目標(biāo)支氣管開(kāi)口將纖支鏡嵌入,若目標(biāo)支氣管已完全阻塞,則將纖支鏡改為向目標(biāo)支氣管的上方嵌入或?qū)χ繕?biāo)支氣管的開(kāi)口處進(jìn)行沖洗。在灌洗瓶的端口接上負(fù)壓吸引器與纖支鏡,隨后中斷負(fù)壓,并叮囑患者降低呼吸幅度,在活檢孔中注入20 mL的生理鹽水(其溫度與人體正常體溫相同),當(dāng)即開(kāi)始負(fù)壓吸引。將纖支鏡上提合適的角度,使液體可以順利回收,重復(fù)3次。將回收所得的BALF保存于無(wú)菌器皿中,本研究標(biāo)本的平均回收率為46.2%(41%~64%)。最后將BALF進(jìn)行離心操作,取上清液并置于-20 ℃的冰箱內(nèi)保存。

    1.3.2 ELISA 對(duì)標(biāo)本血清內(nèi)的MP-IgM進(jìn)行檢測(cè),試劑盒產(chǎn)自深圳安群生物技術(shù)專業(yè)公司,所有操作均按說(shuō)明書實(shí)施。具體操作步驟如下:所用反應(yīng)板被單克隆MP抗原包裹,隨后在其中置入待測(cè)標(biāo)本,并同時(shí)置入MP抗原。若待測(cè)標(biāo)本中含有MP抗體,會(huì)與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物,出現(xiàn)顯色反應(yīng),反之,則無(wú)明顯變化。

    1.3.3 PCR 所用全自動(dòng)的PCR分析儀產(chǎn)自Perkin Elmer(型號(hào)為PE 5700),試劑盒產(chǎn)自達(dá)安基因股份有限公司。將DNA模板、PCR mix、TAQ以一定比例混合。預(yù)反應(yīng)在93 ℃的溫度下反應(yīng)2 min,再在93 ℃、45 s,55 ℃、55 s范圍下循環(huán)各10次,最后在93 ℃、30 s,55 ℃、45 s范圍下循環(huán)各30次。根據(jù)PCR過(guò)程中釋放的熒光反映產(chǎn)物劑量,將熒光轉(zhuǎn)化為DNA模板劑量,并判斷結(jié)果。

    2 結(jié) 果

    2.1 兩種方法檢測(cè)結(jié)果 對(duì)于MP的檢驗(yàn),ELISA與PCR的陽(yáng)性檢出率分別82.5%、81.0%,陰性檢出率分別為17.5%、19.0%,兩組結(jié)合使用的陰、陽(yáng)性檢出率分別為25.6%,99.3%。兩組對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但與非MP感染的結(jié)果比較,兩種方法檢出率均具有明顯優(yōu)勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 兩種方法檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

    2.2 兩種方法敏感性與特異性對(duì)比 兩種方法在敏感性與特異性對(duì)比上,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是兩種方法聯(lián)合使用的差異較單獨(dú)利用一種方法的檢測(cè)效果更為明顯。因此,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

    表2 兩種方法敏感性與特異性對(duì)比(%)

    3 討 論

    支原體是目前發(fā)現(xiàn)的存在于細(xì)胞外的最小微生物,可從人體中分離5種致病性的支原體[4]。MP即原發(fā)性非典型肺炎,可發(fā)生于全年,尤其在冬季的發(fā)病率最高,或可產(chǎn)生流行性發(fā)病。其傳播途徑主要為呼吸道傳播,且在人體內(nèi)的潛伏可達(dá)14~21 d,潛伏期較長(zhǎng)[5]。其常見(jiàn)的檢測(cè)方法有間接血凝試驗(yàn)、冷凝集試驗(yàn)、被動(dòng)凝集法、ELISA等,即MP的分離與培養(yǎng)、PCR、血清學(xué)檢查。MP的分離培養(yǎng)檢測(cè)法是最為理想的方法,所提供的確診依據(jù)最為可靠,但由于臨床所采集的標(biāo)本病原體含量較少、其他雜菌數(shù)量較多、陽(yáng)性率低、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)無(wú)法得以普及。而血清學(xué)檢查中的ELISA是最為常見(jiàn)的檢測(cè)方法。當(dāng)患者感染MP時(shí),體內(nèi)最早出現(xiàn)的抗體為抗MP-IgM抗體,在感染后7 d即可測(cè)出,于10~30 d數(shù)量最多,在12~16周逐漸消失[6-8]。因此,抗MP-IgM抗體是臨床上早期診斷MP感染的有力依據(jù)。而PCR是基于模板DNA理論進(jìn)行定量檢測(cè),其主要作用原理為測(cè)定目標(biāo)的核酸劑量來(lái)間接反映菌數(shù),突出優(yōu)點(diǎn)為大大縮短了檢測(cè)時(shí)間,并可降低模板間的稀釋濃度來(lái)提高準(zhǔn)確性。但傳統(tǒng)PCR的敏感性與特異性欠佳,因此本研究采用的肺泡來(lái)源于目標(biāo)器官即病灶處的肺泡,從而可降提高陽(yáng)性檢出率。

    本文研究結(jié)果顯示,ELISA對(duì)MP-IgM抗體的敏感性與特異性均較高,分別為82.5%、17.5%。兩種方法聯(lián)合使用進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)敏感性達(dá)到99%以上,特異性為25%以上。但其結(jié)果會(huì)受較因素干擾,如抗體的峰值出現(xiàn)較晚等。因此,單份血清所得結(jié)果可靠性較低,需增加標(biāo)本數(shù)量。同時(shí),重癥患者體內(nèi)不存在特異性抗體,會(huì)使檢測(cè)結(jié)果失效。因此,單純使用ELISA進(jìn)行檢測(cè)會(huì)使結(jié)果存在假陰性與假陽(yáng)性。而PCR結(jié)果顯示敏感性與特異性分別為81.0%、19.0%,與ELISA差別不大,說(shuō)明兩者結(jié)合使用可提高陽(yáng)性檢出率。但是兩種方法聯(lián)合使用的差異較單獨(dú)利用一種方法的檢測(cè)效果更為明顯。因此,存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    綜上所述,對(duì)于MP檢測(cè)而言,PCR與ELISA對(duì)其的敏感性與特異性均較理想,兩者聯(lián)合可提高陽(yáng)性檢出率,有利于支原體肺炎疾病的早期診斷與治療。

    [1]邵天波,余麗萍,朱繼蕊.兩種肺炎支原體感染檢測(cè)方法的臨床效果比較[J].山東醫(yī)藥,2008,48(48):97-98.

    [2]王貴年,馬進(jìn)強(qiáng),蘇艾云.肺炎支原體感染的實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐,2009,8(4):458-460.

    [3]狄為民,劉長(zhǎng)山.支原體感染和多系統(tǒng)損害[J].醫(yī)學(xué)綜述,2004,10(1):30-31.

    [4]王俊,韓曉華.肺炎支原體抗體肺炎的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制[J].中華醫(yī)學(xué)研究雜志,2004,4(1):35-37.

    [5]張具良.成人支原體肺炎56例臨床分析[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2011,9(24):283-284.

    [6]李雪輝,陳杭薇,魏娟,等.冬季成人急性呼吸道疾病住院患者肺炎支原體抗體檢測(cè)及分析[J].臨床肺科雜志,2012,17(8):1359-1361.

    [7]陳艷露,宋俊杰,梁紅玉,等.1293例肺炎支原體抗體血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(18):2470-2471.

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    10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.054

    A

    1673-4130(2016)23-3364-02

    2016-06-19

    2016-09-09)

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