基因芯片檢測(cè)人乳頭瘤病毒基因分型在宮頸病變篩查中的臨床應(yīng)用價(jià)值

杜 瓊，劉 苑，趙 瀅，唐睿珠，蔡雪梅，徐秋月，劉子杰△，王 磊

(1.云南昆鋼醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南安寧 650302；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)婦科，昆明 650032；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，昆明 650032；4.北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司 101111)

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·論 著·

基因芯片檢測(cè)人乳頭瘤病毒基因分型在宮頸病變篩查中的臨床應(yīng)用價(jià)值

杜 瓊1，劉 苑2，趙 瀅3，唐睿珠3，蔡雪梅3，徐秋月3，劉子杰3△，王 磊4

(1.云南昆鋼醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南安寧 650302；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)婦科，昆明 650032；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，昆明 650032；4.北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司 101111)

目的 旨在分析基因芯片方法檢測(cè)人乳頭瘤病毒基因分型在宮頸病變篩查中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 收集2015年9月至2015年12月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科門(mén)診進(jìn)行人乳頭瘤病毒基因分型的372例標(biāo)本，包括22種基因型(含高危18種、低危4種),同時(shí)進(jìn)行薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查。結(jié)果 223例檢出人乳頭瘤病毒基因，檢出率為59.94%,檢出高危型194例(52.15%)，低危型29例(7.80%);薄層液基細(xì)胞學(xué)篩查結(jié)果異常率(包括非典型增生、低度病變和高度病變)為44.08%，非典型增生為22.88%,低度病變檢出率為18.01%，高度病變檢出率為5.10%。在宮頸病變表現(xiàn)出炎癥以上病變時(shí)，多重感染與宮頸病變程度具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論 人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)對(duì)宮頸病變篩查有較高臨床應(yīng)用，且與細(xì)胞學(xué)改變具有良好相關(guān)性，進(jìn)行人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)有利于宮頸病變的早期篩查。

人乳頭瘤病毒； 薄層液基細(xì)胞學(xué)； 宮頸病變

在世界范圍內(nèi)，宮頸癌仍然是女性第二常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升，全世界每年新發(fā)病例數(shù)49.3萬(wàn)[1]。其中24萬(wàn)人死于宮頸癌，世界衛(wèi)生組織和國(guó)際癌癥研究所(WHO/IARC)早已明確人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染特別是高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因，因此HPV的檢測(cè)，成為了宮頸癌防治和篩查的重要技術(shù)手段，尤其是HPV-DNA分型檢測(cè)，可以預(yù)防或減少宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)宮頸癌的預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)與治療有重要意義。薄層液基細(xì)胞學(xué)篩查技術(shù)(TCT)是基于細(xì)胞分類(lèi)學(xué)對(duì)宮頸細(xì)胞進(jìn)行分級(jí)、評(píng)估，明確宮頸病變的程度及發(fā)展方向，為臨床治療提供依據(jù)。本文將HPV-DNA分型檢測(cè)技術(shù)與TCT相比較，分析HPV-DNA分型與宮頸病變的相關(guān)性，明確HPV-DNA分型的意義，為宮頸病變的診斷提供更多、更有力的依據(jù)。目前，HPV的常見(jiàn)檢測(cè)方法有液態(tài)雜交(HCII)法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法、基因測(cè)序法、基因芯片(DNA芯片)法等。而液相雜交法對(duì)標(biāo)本的病毒載量進(jìn)行半定量。PCR是以分子信標(biāo)為探針的熒光定量分析。基因測(cè)序法是對(duì)靶片段DNA分子的核苷酸排列順序的測(cè)定?；蛐酒ㄅc標(biāo)記的標(biāo)本進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱顯示標(biāo)本中靶分子的數(shù)量。本研究采用基因芯片技術(shù)對(duì)常見(jiàn)的HPV進(jìn)行檢測(cè)及基因分型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年9月至2015年12月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科門(mén)診進(jìn)行HPV常規(guī)篩查的372例女性。年齡21～77歲，中位數(shù)為40歲。分別對(duì)就診患者進(jìn)行HPV-DNA分型檢測(cè)與TCT篩查。

1.2 HPV-DNA分型檢測(cè) 采用HPV微陣列芯片試劑盒(博奧生物，北京)對(duì)22種HPV-DNA分型進(jìn)行檢測(cè)(包括18種高危型：16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82型；4種低危型：6、11、70、81型)。采集宮頸脫落細(xì)胞并提取DNA，通過(guò)多重PCR擴(kuò)增待測(cè)標(biāo)本的目的基因片段，將PCR產(chǎn)物與雜交液按一定比例混合后點(diǎn)入對(duì)應(yīng)的基因芯片中進(jìn)行雜交，22種HPV-DNA片段與基因芯片上的特異性探針?lè)磻?yīng)，再通過(guò)晶芯LuxscanTM10K-B微陣列芯片掃描儀(博奧生物，北京)讀取結(jié)果，輸出報(bào)告。

1.3 TCT檢測(cè) 用TCT取樣器取宮頸分泌物置入保存液相應(yīng)容器中,離心取沉淀、過(guò)濾后制成超薄涂片，經(jīng)乙醚酒精固定、巴氏染色、用Moticam 2206顯微鏡鏡檢。細(xì)胞學(xué)診斷方法采用宮頸或陰道巴氏涂片細(xì)胞學(xué)診斷報(bào)告系統(tǒng)(TBS)分類(lèi)法[2]可分為：(1)無(wú)上皮內(nèi)病變或惡性病變(NILM)；(2)非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)；(3)低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)；(4)高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以行列表進(jìn)行描述，組間比較采用Fisher精確概率計(jì)算，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPV-DNA分型與TCT檢測(cè)結(jié)果 HPV-DNA分型檢出223例(59.68%)，22個(gè)型別均有檢出，主要以16型(36/223,16.14%)、52型(35/223,15.70%)、51型(18/223,8.07%)、18型(15/223,6.73%)、33型(14/223,6.28%)為主；TCT檢出陽(yáng)性164例(44.08%)非典型增生(22.88%),低度病變檢出率(18.01%)，高度病變檢出率(5.10%)，其中高、低度病變共計(jì)77例，77例患者中HPV檢出以16型(21/77,27.27%)、18型(10/77,12.99%)為主。見(jiàn)表1、2。

表1 HPV與TCT檢出結(jié)果[n(%)]

2.2 HPV分型檢測(cè)與TCT的相關(guān)性 經(jīng)TCT檢測(cè)后結(jié)果為NILM 208例(56%)、ASC-US78例(21%)、LSIL為67例(18%)、HSLM 19例(5%)。TCT與HPV-DNA分型檢測(cè)具有良好的相關(guān)性，以TCT結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，HPV檢測(cè)對(duì)ASC-US、LSIL和HSLM病變的檢測(cè)靈敏度分別為74.36%、76.12%、89.47%。見(jiàn)表3。校正年齡后，是否感染HPV與炎癥病變?nèi)跃哂休^強(qiáng)相關(guān)性，而是否感染高危型與炎癥病變無(wú)關(guān)，當(dāng)出現(xiàn)低、高危病變時(shí)HPV低?；蚋呶８腥揪哂酗@著相關(guān)性。見(jiàn)表4。

表2 TCT檢測(cè)結(jié)果(n)

表3 HPV分型檢測(cè)與TCT檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性(n)

表4 校正年齡后分析HPV感染與TCT的相關(guān)性

注：Fisher計(jì)算值=88.19,P=0.00。

2.3 HPV多重感染與宮頸病變的關(guān)系 HPV-DNA分型檢測(cè)結(jié)果顯示，單一型HPV感染167例(85.20%)，多重HPV感染29例(14.8%)；多重HPV感染與宮頸病變程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.86,P>0.05)，但在炎癥、低度和高度病變組間HPV多重感染與宮頸病變程度有明顯相關(guān)性(χ2=6.28,P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 宮頸病變程度與HPV復(fù)合感染的關(guān)系(n)

3 討 論

有關(guān)宮頸癌前篩查的方法目前主要以HPV-DNA分子診斷和TCT為主[3]。HPV-DNA分子診斷是在分子微觀領(lǐng)域，呈現(xiàn)是否受到HPV感染，并提示患者病毒感染的危險(xiǎn)程度，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)宮頸癌或癌前病變的高危患者進(jìn)行針對(duì)性診斷和早期干預(yù)。而TCT檢查是采用液基薄層細(xì)胞檢查宮頸細(xì)胞病變情況，并進(jìn)行分類(lèi)診斷，同時(shí)還能發(fā)現(xiàn)部分宮頸癌變前的微生物感染及液基測(cè)拭子宮頸細(xì)胞的變化。

本研究運(yùn)用HPV-DNA分型檢測(cè)與薄層液基細(xì)胞學(xué)篩查技術(shù)對(duì)372例標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示HPV-DNA分型檢測(cè)中，22種型別(18種高危、4種低危)均有檢出,為HPV的預(yù)防和治療提供了依據(jù)，這也對(duì)宮頸病變的監(jiān)測(cè)提供了預(yù)警。HPV-DNA分型檢測(cè)不僅能確定是否有感染，而且可以對(duì)病毒進(jìn)行分型診斷，研究結(jié)果顯示在宮頸發(fā)生低度病變和高度病變中HPV-DNA分型檢測(cè)以高危型16型及18型占的比例最高，這一結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[4-5]。且在高度病變和低度病變中高危型檢出率較高;而TCT檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著宮頸病變的加重,HPV陰性結(jié)果下降明顯。所以進(jìn)行HPV-DNA分型檢測(cè)是很有必要的。雖然TCT檢測(cè)結(jié)果顯示在細(xì)胞水平出現(xiàn)炎性以上病變的患者中，也有部分HPV-DNA分型檢測(cè)結(jié)果為陰性，此時(shí)患者可能感染了22種型別以外的其他型別，但也可能是其他原因?qū)е拢mHPV感染與宮頸癌的發(fā)生具有很強(qiáng)的相關(guān)性，但并不是唯一的因素，早婚、早育、流產(chǎn)、性生活紊亂等因素也會(huì)發(fā)生宮頸病變[6-7]。在TCT結(jié)果為NILM的患者中仍有33.17%HPV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，是因?yàn)镠PV從感染到病變存在一定的時(shí)間性[8]?；颊呤蹾PV感染時(shí)間較短，在細(xì)胞學(xué)水平變化尚未表現(xiàn)，而臨床可針對(duì)HPV-DNA分型情況，評(píng)估患者的風(fēng)險(xiǎn)，從而制訂有效的治療方案。這也進(jìn)一步明確了HPV-DNA分型檢測(cè)在宮頸病變篩查中具有重要的作用和意義，也為HPV的預(yù)防和治療提供早期的診斷依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，校正年齡后，對(duì)于是否感染HPV與炎癥病變?nèi)跃哂休^強(qiáng)相關(guān)性，而是否感染高危型與炎癥病變無(wú)關(guān)，當(dāng)出現(xiàn)低、高度病變時(shí)HPV低危或高危感染均具有顯著相關(guān)性。在宮頸病變程度與HPV感染情況分析中，患者在受到HPV多重感染時(shí)，會(huì)加快宮頸病變的進(jìn)程[9]。如果HPV-DNA分型檢測(cè)與TCT檢測(cè)均是陰性患者，陰性預(yù)測(cè)值可達(dá)到99%～100%[10]。子宮病變?cè)u(píng)估風(fēng)險(xiǎn)率極低。

目前，HPV常用檢測(cè)技術(shù)中HC Ⅱ能檢測(cè)13種高危型Ⅲ、Ⅳ病毒，靈敏度較好，重復(fù)性高，但僅限于半定量，且不能確定其具體的HPV-DNA亞型。另外，HC Ⅱ還存在交叉雜交的問(wèn)題，易引起假陽(yáng)性結(jié)果。PCR技術(shù)能檢測(cè)14種高危HPV亞型，靈敏度沒(méi)有HC Ⅱ高，但優(yōu)勢(shì)在于能進(jìn)行HPV-DNA的定量和分型[11]。測(cè)序法能檢出所有病毒亞型，特別是對(duì)檢測(cè)稀有型別和發(fā)現(xiàn)新的型別有著重要的作用，但不能檢測(cè)多型、HPV混合感染，只能檢測(cè)優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增基因片段，將混合型判斷為單一型。基因芯片技術(shù)一次可進(jìn)行大量標(biāo)本檢測(cè)，能同時(shí)對(duì)22種HPV基因型進(jìn)行快速分型，且可判斷多重感染，以此看來(lái)基因芯片技術(shù)要比HCⅡ、PCR技術(shù)、測(cè)序法更具優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，HPV-DNA分型檢測(cè)技術(shù)雖然只作為宮頸癌篩查的輔助手段，但在宮頸病變篩查中有著重要的指向性與相關(guān)性，指導(dǎo)意義突出；同時(shí)也反映出TCT的局限性。而HPV-DNA分型檢測(cè)在臨床實(shí)際應(yīng)用中檢測(cè)快速、分型準(zhǔn)確合理、覆蓋度高且所檢出型別與宮頸病變均有相關(guān)性，符合臨床需求，對(duì)臨床指導(dǎo)意義重大，因此HPV-DNA分型檢測(cè)具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。

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Clinical application value of gene chip for detecting HPV DNA genotype in cervical lesions screening

DUQiong1，LIUYuan2，ZHAOYing3,TANGRuizhu3，CAIXuemei3，XUQiuyue3，LIUZijie3△，WANGLei4

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,KungangHospital,Anning,Yunnan650302,China;2.DepartmentofGynecology,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China;4.BeijingBoaoJingdianBiotechnologyCo.,Ltd.,Beijing101111,China)

Objective To investigate the clinical application value of gene chip method for detecting human papilloma virus(HPV) DNA genotype.Methods A total of 372 samples of HPV genotype in the gynecological outpatients department of our hospital from September to December 2015 were collected,including 22 kinds of genotype(18 types of high risk,4 types of low risk),meanwhile all samples were performed thinprep cytologic test(TCT).Results In 372 samples,223 cases of HPV gene were detected with the detection rate of 59.94%,194 cases(52.15%) of high risk type and 194 cases(7.80%) of low risk type were detected;the abnormal rate of TCT was 44.08%(including atypical hyperplasia,low-grade and high-grade lesion),the atypical hyperplasia was 22.88%,the detection rate of high-grade lesion was 5.10% and which of low-grade lesion was 18.01%.In the cervical lesions showing the lesion beyond inflammation,multiple infection and cervical lesions had significant correlation(P<0.05).Conclusion HPV genotyping has higher clinical application in the cervical lesion screening,moreover which has good correlation with the cytological change.Conducting HPV genotyping is beneficial to the early screening of cervical lesions.

human papilloma virus; thinprep cytologic test; cervical lesion

杜瓊,女，主管技師，主要從事微生物及分子生物學(xué)檢驗(yàn)研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.024

A

1673-4130(2016)23-3303-03

2016-04-28

2016-07-25)