慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓部分細(xì)胞因子的表達(dá)及意義*

宋建新，張 芹，梅 芬，歐陽紅梅，蔣雅先，撒亞蓮△

(云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院:1.血液病診斷室;2.臨床基礎(chǔ)研究所，昆明 650032)

?

·論 著·

慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓部分細(xì)胞因子的表達(dá)及意義*

宋建新1，張 芹1，梅 芬2，歐陽紅梅1，蔣雅先1，撒亞蓮2△

(云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院:1.血液病診斷室;2.臨床基礎(chǔ)研究所，昆明 650032)

目的 探討慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者不同時(shí)期骨髓白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及干擾素-γ(INF-γ)表達(dá)的變化。方法 應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析30例CML慢性期(CML-CP)、21例加速期(CML-AP)、15例急變期(CML-BP)，經(jīng)治療后緩解患者42例、未緩解患者7例的骨髓液中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及INF-γ表達(dá)水平,并與對照組比較。結(jié)果 CML各組患者INF-γ、IL-2水平均低于對照組(P<0.05)，IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10均高于對照組(P<0.05)。隨著病情進(jìn)展，INF-γ、IL-2水平逐漸降低,即CML-BPCML-AP>CML-CP，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；颊呓?jīng)治療完全緩解后，INF-γ、IL-2有所回升，但仍低于對照組(P<0.01)，IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10有所降低，同樣也高于CML-CP(P<0.05)；未緩解組IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10及IL-2、INF-γ與急變期相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 在CML患者骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子水平的變化對CML的發(fā)生、發(fā)展及與預(yù)后評估有一定的意義；檢測CML骨髓IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10及INF-γ水平有望為CML患者免疫治療及預(yù)后判斷提供新的思路和理論依據(jù)。

慢性粒細(xì)胞白血??； 白細(xì)胞介素; 干擾素-γ

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是起源于多能造血干細(xì)胞的惡性克隆性增殖性疾病，根據(jù)臨床病程可分為慢性期(CP)、加速期(AP)和急變期(BP)。骨髓微環(huán)境是由基質(zhì)細(xì)胞、輔助細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞)、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子組成的一個(gè)有序的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，其不僅提供造血細(xì)胞賴以生存、發(fā)育及分化的場所，同時(shí)其改變也為血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供了一個(gè)合適的生存空間。細(xì)胞因子作為骨髓微環(huán)境的重要成分，在維持骨髓微環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡中起著重要作用。為切實(shí)反映骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子的變化對CML腫瘤細(xì)胞的影響，本文通過對CML不同時(shí)期治療前后骨髓液中細(xì)胞因子水平的檢測，探討CML患者骨髓免疫微環(huán)境部分細(xì)胞因子改變在CML發(fā)病和化療過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 66例患者均來自云南省第一人民醫(yī)院血液科門診及住院患者，經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)檢查，符合CML各期的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。其中，CML-CP 30例，CML-AP 21例，CML-BP 15例，男42例、女24例，年齡18～78歲、中位年齡56歲；經(jīng)治療后完全緩解44例，未緩解7例，其中CML-CP除8例失訪全部完全緩解，21例CML-AP患者中完全緩解14例、未緩解3例、4例轉(zhuǎn)外院治療而失訪，CML-BP完全緩解8例、未緩解4例、治療中1例死亡、2例轉(zhuǎn)外院失訪。30例缺鐵性貧血患者作為對照組，其中男18例，女12例；年齡18～76歲，中位年齡54.5歲。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并征得所有受試者知情同意。

1.2 試劑與儀器 白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、干擾素-γ(IFN-γ)試劑盒購自BD公司。流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司FC500。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 采集CML患者治療前后及初診缺鐵性貧血患者骨髓液2.0 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，3 000 r/min離心30 min，取上清液-80 ℃保存待測。

1.3.2 細(xì)胞因子檢測 按照試劑盒說明書設(shè)計(jì)流式細(xì)胞術(shù)方案，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算所需微球量，混合微球，以1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入丟棄上清液相同量的增強(qiáng)劑混合待用。取試管編號，每管加入20 μL離心后的骨髓上清液，每管加入混合微球50 μL及PE染料50 μL，避光孵育3 h，加入wash buffer液600 mL混勻，1 500 r/min離心10 min棄上清液，加入300 μL wash buffer液混勻上機(jī)檢測，用FCAP分析軟件分析。

2 結(jié) 果

與對照組相比，CML-CP患者骨髓微環(huán)境中INF-γ、IL-2水平明顯降低(t=7.45,10.69,P<0.05)，IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平明顯增高(t=17.58,11.08，13.08,11.30,P<0.05)；INF-γ、IL-2在CML-BP明顯低于CML-AP(t=8.05,8.40，P<0.05),CML-AP明顯低于CML-CP(t=6.44,6.61,P<0.05)；IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10在CML-BP明顯高于CML-AP(t=9.78,6.89，9.10,9.74,P<0.05),CML-AP明顯高于CML-CP(t=15.64,11.84，9.61,11.69,P<0.01)；INF-γ在緩解組與CML-CP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.21，P>0.05)，IL-2在緩解組高于CML-CP(t=2.97，P<0.05)，但仍低于對照組(P<0.05)；緩解組IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10與CML-CP比較有所降低，但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.90，7.08，11.04，6.18，P<0.05)。未緩解組INF-γ、IL-2、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平與CML-BP組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.46，0.90，0.09，0.57，0.10，2.20，P>0.05)。見表1。

表1 各組IL-1β、IL-2、IL-4 、IL-6、IL-10及INF-γ水平檢測結(jié)果

3 討 論

CML是獲得性造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，其典型特征是Ph陽性并表達(dá)具有強(qiáng)酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白。CML患者應(yīng)用ABL酪氨酸激酶抑制劑(TKI)疾病很容易得到控制，但經(jīng)治療達(dá)完全細(xì)胞遺傳學(xué)緩解的CML患者體內(nèi)仍殘留有107個(gè)左右包括白血病干細(xì)胞(LSC)的白血病細(xì)胞，這些微小殘留LSC是CML不能被最終治愈和復(fù)發(fā)的根本原因,這可能與BCR/ABL基因突變及相關(guān)耐藥性有關(guān)[2]。正常情況下，造血微環(huán)境中具有調(diào)控活性的基質(zhì)細(xì)胞等通過合成和釋放造血因子和造血抑制因子來調(diào)控血細(xì)胞的生長，并維持血細(xì)胞在不同階段的正常形態(tài)。細(xì)胞因子作為骨髓微環(huán)境的重要組成成分，在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，了解CML骨髓微環(huán)境細(xì)胞因子的變化，進(jìn)一步確定有效的治療尤為重要。

IL-1β是一個(gè)多功能炎性細(xì)胞因子，主要由受到刺激的白細(xì)胞產(chǎn)生，在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、造血調(diào)控和腫瘤免疫中起重要作用[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在急性白血病(AL)患者血清中IL-1β水平明顯增高，且與AML患者病情進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)[4-5]；研究還發(fā)現(xiàn)，在無外來刺激的情況下，包括CML在內(nèi)的LSC及其骨髓基質(zhì)細(xì)胞均可通過自分泌、旁分泌途徑產(chǎn)生大量IL-1β[6]。研究還顯示，IL-1β可促進(jìn)惡性細(xì)胞的生長、遺傳的不穩(wěn)定性及惡性細(xì)胞的克隆演變[7]。

IL-2、INF-γ屬于Th1細(xì)胞因子,它們都具有誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，介導(dǎo)激活CD8+CTL細(xì)胞，產(chǎn)生致炎性細(xì)胞因子，增強(qiáng)自然殺傷(NK)細(xì)胞活性，從而發(fā)揮抗細(xì)菌、抗病毒和抗腫瘤的作用。文獻(xiàn)報(bào)道，Th1型細(xì)胞因子如INF-γ可將巨噬細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞，參與Th1型免疫應(yīng)答，作為誘導(dǎo)細(xì)胞和殺傷細(xì)胞的M1型巨噬細(xì)胞參與殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞[8]。在對AL的研究中發(fā)現(xiàn)，AL患者血清中IL-2、INF-γ水平明顯減低，且與AL患者病情進(jìn)展及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[9-11]。

IL-4、IL-6、IL-10屬于Th2型細(xì)胞因子，具有介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，與抑制自身免疫有關(guān)。Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-10 能把巨噬細(xì)胞極化為M2型即腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)，主要參與Th2免疫調(diào)控，抑制免疫，對細(xì)胞內(nèi)病原體和腫瘤細(xì)胞的殺傷能力下降，有利于腫瘤細(xì)胞的生長[7]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，TAM可以釋放G0S2(G0/G1switch gene2)，加快細(xì)胞生長周期，對腫瘤細(xì)胞的增殖有很強(qiáng)的促進(jìn)作用[12]。IL-4、IL-6、IL-10在AL中的作用已有了相關(guān)報(bào)道[8-10]，Ⅰ期在AL患者血清中水平明顯增高，其增高與AL患者病情進(jìn)展及預(yù)后呈正相關(guān)。

本研究通過流式細(xì)胞儀檢測初診CML不同時(shí)期、治療后完全緩解和未緩解患者骨髓IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、INF-γ檢測發(fā)現(xiàn)，在CML-CP IL-2、INF-γ表達(dá)水平明顯低于對照組，隨著病情的進(jìn)展逐漸降低，CML-BPCML-AP>CML-CP，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示CML患者的骨髓造血微環(huán)境發(fā)生了異常變化，即在CML骨髓微環(huán)境中Th1/Th2平衡向Th2漂移，抑制了局部細(xì)胞免疫功能，進(jìn)而使機(jī)體的整個(gè)免疫系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致對白血病細(xì)胞的免疫耐受，且機(jī)體細(xì)胞免疫功能隨著病情的不斷加重更進(jìn)一步紊亂，以致惡性克隆沖破了機(jī)體的免疫監(jiān)視，從而在免疫應(yīng)答誘導(dǎo)和效應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)上抑制機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，進(jìn)而導(dǎo)致CML的病情進(jìn)展。經(jīng)治療完全緩解后，IL-2、INF-γ表達(dá)水平較有所增高，但I(xiàn)NF-γ在緩解組與CML-CP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IL-2在緩解組高于CML-CP(P<0.05)，但仍低于對照組(P<0.05)；IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10表達(dá)水平有所降低，但仍高于CML-CP(P<0.05)。說明CML經(jīng)治療后雖達(dá)到了形態(tài)學(xué)及基因水平的緩解，但免疫功能仍未恢復(fù)正常，還存在復(fù)發(fā)的因素。所以，在CML緩解后，如何恢復(fù)患者機(jī)體乃至骨髓微環(huán)境的免疫平衡，可能是最終清除白血病微小殘留的途徑之一。至于在CML患者骨髓微環(huán)境中，是否存在由細(xì)胞因子對巨噬細(xì)胞的極化，且巨噬細(xì)胞在CML中的作用及這些因子與白血病細(xì)胞之間如何相互作用還有待進(jìn)一步研究。

總之，通過對CML患者骨髓部分細(xì)胞因子的研究發(fā)現(xiàn)，在CML患者骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子水平的變化對CML的發(fā)生、發(fā)展及與預(yù)后評估有一定的意義。檢測CML患者骨髓IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10及INF-γ水平有望為CML患者免疫治療及預(yù)后判斷提供新的思路和理論依據(jù)。

[1]張之南，沈悌．血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M]．2版．北京：科學(xué)出版社，1997:134-136．

[2] Lucas CM，Wang L，Austin GM，et al．A population study of imatinib in chronic myeloid leukemia demonstrates lower efficacy than in clinical trials[J]．Leukemia，2008，22(10)：1963-1966．

[3]Okabe-Kado J，Kasukabe T，Honma Y,et al．Extracellular NM23-Hl protein inhibits the snrvival of primary cultured normal human peripheral blood mononuclear ells and activates the cytokine production[J].Int J Hematol,2009，90(2)：143-152．

[4]張秀蓮，張偉華，侯素敏，等.急性髓系高白細(xì)胞白血病患者外周血白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)及意義[J].白血病·淋巴瘤，2011，11(11)：663-665.

[5]韓瑩，楊君.急性白血病患者血清bFGF、IL-1β和TSCF檢測的臨床價(jià)值[J].疑難病雜志，2011，9(9)：685-687.

[6]Acalescu A，Zlei M,Aanei C，et al．Flow cytometry-based quantification of cytokine levels in AML patient′s plasma and cell culture supernatants[J]．Rev Med Chir Soc Med Nat Lasi,2008，112(1):196-202．

[7]Mantovani A,Garlanda C,Allavena P.Molecular pathways and targets in cancer-related inflammation[J].Ann Med,2010,42(3):161-170.

[8] Edwards JP，Zhang X，F(xiàn)rauwirth KA，et al．Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations[J].J Leukoc Biol，2006，80(6)：1298-1307．

[9]張雄，肖玉梅，劉傳勇，等．急性白血病患者化療前后IL-2 及IL-6水平測定的臨床意義[J]．中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18(7)：1372-1373.

[10]楊會志，汪健，孫自敏．急性髓系白血病患者T 淋巴細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)特性[J]．中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2007，15(6)：1161-1164.

[11]姜煥好，曾東良，吳春鳳，等.急性白血病患者治療前后血清INF-γ、VEGF、IL-10及IL-12水平的變化及意義[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，1(2)：299-300.

[12]Yuan A,Chen JJ,Yang PC.Pathophysiology of tumor-associated macrophages〔J〕.Adv Clin Chem,2008,45(2):199-233.

Expression of partial cytokines in bone marrow of chronic myeloid leukemia patients and its significance*

SONGJianxin1,ZHANGQin1,MEIFen2,OUYANGHongmei1,JIANGYaxian1,SAYalian2△

(1.DiagnosticRoomofHematologicalDiseases;2.ResearchInstituteofClinicalBasis,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital/AffiliatedHospitalofKunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To investigate the changes of IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-10 and INF-γ expressions in bone marrow of chronic myeloid leukemia(CML)patients.Methods The IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-10 and INF-γ expression levels were detected by using flow cytometry in 30 cases of CML chronic phase(CML-CP),21 cases of CML accelerated phase(CML-AP),15 cases of CML blastic phase(CML-BP),42 cases of CML remission after treatment and 7 cases of non-remission.Then the detection results were compared with those in the control group.Results The expression levels of INF-γ and IL-2 in each CML groups were lower than those in the control group(P<0.05),while the expression levels of IL-1β,IL-4,IL-6 and IL-10 were higher than those in the control group(P<0.05).With the disease condition progression,the INF-γ and IL-2 levels were gradually decreased,i.e.,CML-BPCML-AP>CML-CP,the difference among groups had statistical significance(P<0.05).After complete remission by treatment,the INF-γ and IL-2 levels were risen to some extent,but which were still lower than those in the control group(P<0.01),the expression levels of IL-1β,IL-4,IL-6 and IL-10 were decreased to some extent,but likewise were higher than those in CML-CP(P<0.05); the levels of IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10,IL-2 and INF-γ had no statistical difference between the non-remission group and CML-BP group(P>0.05).Conclusion The changes of serum cytokines in bone marrow microenvironment of CMLpatients have certain significance to the occurrence,development and prognosis of CML; the detection of IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-10 and INF-γ levels in bone marrow is hopeful to provide new ideas and theoretical basis for immune therapy and prognosis judgment of CML patients.

chronic myeloid leukemia; cytokines; interferon-γ

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目資助(2014FZ070)。

宋建新，男，副主任醫(yī)師，主要從事血液病診斷研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.006

A

1673-4130(2016)23-3255-03

2016-03-05

2016-05-23)