阿霉素誘導(dǎo)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原變化

李倩曉，于勤，那榮妹，劉百亭

阿霉素誘導(dǎo)擴(kuò)張型心肌病大鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原變化

李倩曉，于勤，那榮妹，劉百亭

目的通過腹腔注射阿霉素的方法建立擴(kuò)張型心肌?。―CM）心力衰竭大鼠模型，探討其心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的變化。方法選取體質(zhì)量220～280 g的8周齡、SPF級近交系雄性SD大鼠95只，分為DCM組（=70）和對照組（=25）。DCM組采用腹腔注射阿霉素的方法構(gòu)建DCM心力衰竭模型；對照組則注射等容積的0.9%氯化鈉注射液。給藥后第8周，兩組各取20只處死，行免疫組化檢測心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。結(jié)果DCM組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原平均光密度值均高于對照組（均＜0.05），DCM組大鼠心?、?Ⅲ型膠原比值大于對照組（＜0.05）。結(jié)論腹腔注射阿霉素誘導(dǎo)DCM心力衰竭大鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原特異性增生，比例失調(diào)。

心肌病，擴(kuò)張型；膠原，Ⅰ、Ⅲ型；阿霉素

擴(kuò)張型心肌?。―CM）是一種以左心室擴(kuò)大伴收縮功能障礙為典型特征的心肌疾病，是射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭的常見病因之一，也是心臟移植的最常見病因[1-2]。DCM發(fā)病率約4‰，5年生存率約50%，大多數(shù)DCM患者最終發(fā)展為充血性心力衰竭，并出現(xiàn)室性及室上性心律失常、血栓栓塞甚至猝死等[3-4]。研究認(rèn)為，DCM是遺傳因素、自身免疫異常、病毒感染、毒物或藥物等多因素共同作用所致[5-6]。DCM起病隱匿，呈進(jìn)行性惡化，預(yù)后差，臨床誤診率高，故提高對該病的認(rèn)識、早期診斷及早期治療對改善預(yù)后至關(guān)重要。本研究通過腹腔注射阿霉素的方法，誘導(dǎo)制備DCM心力衰竭動物模型，探討其心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的變化。報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑動物為體質(zhì)量為220～280g的8周齡、SPF級近交系雄性SD大鼠95只，購于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。試劑：阿霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司），0.9%氯化鈉注射液（青島華仁藥業(yè)股份有限公司），兔抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體（廣州華拓生物科技有限公司），即用型免疫組織化學(xué)EliVisionTM plus廣譜試劑盒（試劑A：聚合物增強(qiáng)劑，試劑B：酶標(biāo)羊抗鼠/兔ⅠgG聚合物，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組將SD大鼠分為DCM組（=70）和對照組（=25），置于同等條件下飼養(yǎng)。DCM組予腹腔注射阿霉素，每次2.5 mg/kg，1次/周，共6周，使阿霉素累積劑量達(dá)到15 mg/kg。對照組腹腔注射等容積的0.9%氯化鈉注射液。

1.3 免疫組化檢測至給藥后第8周，DCM組大鼠死亡29只，存活41只；正常對照組大鼠全部存活。兩組任取20只，予以斷頸處死，并取厚2～3 mm的左室中段心肌組織，行免疫組化檢測心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)EliVisionTM plus兩步法檢測心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。切片脫蠟至蒸餾水；3%H2O2室溫孵育10 min；磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.4）沖洗，3 min×3次；檸檬酸抗原修復(fù)液高壓加熱至沸騰后放入玻片，持續(xù)蒸汽5 min，自然冷卻至室溫；PBS沖洗，3min×2次；分別滴加1∶200稀釋的一抗（兔抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體），置濕盒中4℃過夜，陰性對照滴加PBS代替一抗；PBS沖洗，3 min ×3次；滴加聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），室溫孵育20 min；PBS沖洗，3min×3次；滴加酶標(biāo)羊抗鼠/兔ⅠgG聚合物（試劑B），室溫孵育30 min；PBS沖洗，3 min×3次；DAB顯色，觀察標(biāo)本染色程度（細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒沉著為陽性反應(yīng)）；純凈水終止顯色，蘇木素復(fù)染l min；自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗；梯度酒精脫水（90%、95%、100%、100%各3 min）；二甲苯透明，5 min×2次；中性樹膠封片。每張切片選取10個不相互重疊的視野，測定標(biāo)本陽性區(qū)的平均光密度值，計算Ⅰ、Ⅲ型膠原比值。

1.4 統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

對照組：心肌細(xì)胞間質(zhì)中僅見少量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)，且顏色較淺（封二彩圖1～2）；DCM組：心肌細(xì)胞間質(zhì)中可見大量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)，且顏色較深（封二彩圖3～4）。DCM組大鼠心?、瘛ⅱ笮湍z原平均光密度值顯著高于對照組（均＜0.05），心肌Ⅰ/Ⅲ型膠原比值亦大于對照組（＜0.05），見表1。

3 討論

DCM的典型特征包括心肌細(xì)胞肥大、變性及心肌纖維化[7]。心肌纖維化以心肌細(xì)胞增殖和心肌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積為主要表現(xiàn)[8-9]。ECM成分主要包括膠原、彈性蛋白及蛋白聚糖等，在維持心臟正常結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用，與心肌肥厚、心肌纖維化有直接關(guān)系[10]。DCM導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程，以ECM異常增多和過度沉積為主要病理基礎(chǔ)，其中最明顯的表現(xiàn)是Ⅰ、Ⅲ型膠原的變化，即膠原含量升高，比例增大。Ⅰ型膠原主要為粗纖維，在成人心肌中占膠原總量的85%，是構(gòu)成心肌膠原的主體成分，其僵硬度大，而伸展與回彈性小，主要維持心肌張力，對抗?fàn)坷?；Ⅲ型膠原主要為細(xì)纖維，約占11%，其伸展與回彈性較大，主要使心肌彈性回縮，儲備能量[11]。因此，Ⅰ、Ⅲ型膠原比值可反映心肌纖維化程度，兩者共同維持膠原纖維網(wǎng)絡(luò)的完整性，保證心臟的正常舒縮功能。若兩者比例失調(diào)，勢必影響心肌舒縮功能，從而導(dǎo)致心功能下降。正常心肌膠原含量為2%～4%，當(dāng)增至8%～12%時，室壁順應(yīng)性降低，出現(xiàn)舒張功能下降；當(dāng)超過20%時，則由于心肌細(xì)胞被阻隔，影響了力的產(chǎn)生與傳導(dǎo)，導(dǎo)致收縮功能障礙。本研究免疫組化檢測顯示，對照組大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)中僅見少量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)，而DCM組大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)中可見大量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)。DCM組大鼠心?、?、Ⅲ型膠原平均光密度值均顯著高于對照組（均＜0.05），心?、?Ⅲ型膠原比值亦大于對照組（＜0.05）。提示腹腔注射阿霉素誘導(dǎo)DCM心力衰竭大鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原特異性增生，比例失調(diào)。

表1 兩組大鼠心?、?、Ⅲ型膠原平均光密度值比較

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.11.019

R542.2

A

1671-0800(2016)11-1445-02

2016-05-05

（本文編輯：孫海兒）

杭州市醫(yī)療衛(wèi)生及重點(diǎn)?？茖２】蒲许?xiàng)目（20140733Q26）

310000杭州，杭州市紅十字會醫(yī)院（李倩曉）；大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院（于勤、那榮妹、劉百亭）

李倩曉，Email：lqx786 @163.com