肉質(zhì)性狀相關(guān)基因在四種鯉科魚(yú)類肌肉組織中的表達(dá)差異研究

趙燕英，李瑞文，李 虎，李 倩，林亞秋，陳 娟

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川 成都 610091；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

肉質(zhì)性狀相關(guān)基因在四種鯉科魚(yú)類肌肉組織中的表達(dá)差異研究

趙燕英1，李瑞文2，李 虎3，李 倩1，林亞秋1，陳 娟1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川 成都 610091；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

為了闡明肉質(zhì)性狀相關(guān)基因在四種鯉科魚(yú)類中的表達(dá)差異，以齊口裂腹魚(yú)(雅魚(yú)，Schizothorax prenanti)、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)、鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)和鰱魚(yú)(Hypophthalmichthys molitrix)四種鯉科魚(yú)類為研究對(duì)象，利用索式抽提法和物性測(cè)定儀測(cè)定四種魚(yú)類背部與腹部肌內(nèi)脂肪(IMF)含量和肌肉剪切力，并利用熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)、過(guò)氧化物酶體激活增殖受體γ(PPARγ)、過(guò)氧化物酶增殖劑受體γ亞型的輔激活因子1α(PGC-1α)、鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)等肉質(zhì)性狀相關(guān)基因在四種魚(yú)肌肉組織中的表達(dá).結(jié)果顯示，齊口裂腹魚(yú)背部與腹部肌肉的IMF含量極顯著高于其他魚(yú)類(P＜0.01)，而肌肉剪切力均顯著低于其他三種魚(yú)類(P＜0.05)，PGC-1α在齊口裂腹魚(yú)背部及腹部肌肉中表達(dá)水平最高，PPARγ和CAST在齊口裂腹魚(yú)背部及腹部肌肉中表達(dá)水平最低.研究結(jié)果為闡明齊口裂腹魚(yú)優(yōu)良肉質(zhì)形成的分子機(jī)制提供重要的參考數(shù)據(jù).

齊口裂腹魚(yú)；草魚(yú)；鯉魚(yú)；鰱魚(yú)；肌內(nèi)脂肪含量；剪切力；基因表達(dá)

近年來(lái)人們對(duì)肉類產(chǎn)品的要求越來(lái)越高，不僅要求營(yíng)養(yǎng)豐富，而且還需具有較好的風(fēng)味和感觀性狀.據(jù)統(tǒng)計(jì)在發(fā)展中國(guó)家，人們所攝取的動(dòng)物蛋白25%來(lái)自水產(chǎn)品[1]，其中魚(yú)肉由于其特有的優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們的青睞.但關(guān)于動(dòng)物肉質(zhì)調(diào)控方面的研究多集中于哺乳動(dòng)物，在魚(yú)類上研究相對(duì)匱乏，尚不深入.

肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)和嫩度是影響肉質(zhì)性狀(包括肉質(zhì)風(fēng)味、嫩度和多汁性)的重要因素[2]，因此檢測(cè)IMF和嫩度相關(guān)基因在不同魚(yú)類肌肉的表達(dá)差異具有重要的理論與實(shí)際意義.

哺乳動(dòng)物研究表明，影響動(dòng)物IMF沉積的關(guān)鍵基因有很多，比如心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart fatty acidbinding protein，H-FABP)家族[3-5]、過(guò)氧化物酶體激活增殖受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)家族[6-7]、過(guò)氧化物酶增殖劑受體γ亞型的輔激活因子(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)[8]等.鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin，CAST)是影響肉嫩度的主要候選基因[9-10].但關(guān)于上述基因在魚(yú)類中的報(bào)道較少，且不深入.

齊口裂腹魚(yú)(Schizothorax prenanti)是我國(guó)青藏高原特有的冷水性魚(yú)類，屬鯉形目、鯉科、裂腹魚(yú)亞科、裂腹魚(yú)屬，因肉色雪白、肉質(zhì)細(xì)嫩、肉味鮮美、富含脂肪與賴氨酸[11]，已逐漸成為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，備受人們推崇，研究其優(yōu)良肉質(zhì)形成的分子機(jī)理具有非常重要的意義.因此本試驗(yàn)以齊口裂腹魚(yú)和同一鯉科的草魚(yú)、鯉魚(yú)和鰱魚(yú)為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定四種魚(yú)類IMF與剪切力及同時(shí)比較相關(guān)基因的表達(dá)差異，為從分子水平闡明齊口裂腹魚(yú)優(yōu)良肉質(zhì)形成的分子機(jī)制提供基本數(shù)據(jù)，為魚(yú)類肉質(zhì)的調(diào)控研究提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)魚(yú)類的品種選育及遺傳資源的利用提供參考資料.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)所用成年齊口裂腹魚(yú)(497±9.7g，n＝8)購(gòu)買于四川省雅安市蘆山養(yǎng)殖場(chǎng)，成年草魚(yú)(850±12g，n＝8)，鯉魚(yú)(758±16g，n＝8)，鰱魚(yú)(756±23.4g，n ＝8)均購(gòu)自成都白家水產(chǎn)市場(chǎng).宰殺后迅速采集四種魚(yú)的背肌和腹肌，然后迅速置于液氮中用于后續(xù)基因表達(dá)檢測(cè).同時(shí)采集每條魚(yú)的背肌和腹肌各4塊肌肉，每塊肉厚0.5cm，長(zhǎng)寬各1cm，且去除魚(yú)刺及魚(yú)皮，放于-20℃冰箱待測(cè)定剪切力及肌內(nèi)脂肪含量.

1.2 主要試劑

Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，F(xiàn)ermentas RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas Life Science，Hanover，MD，US)，SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)熒光定量試劑盒(TaKaRa，Dalian，China)，TaqMix聚合酶(TaKaRa，Dalian，China)，pMD19-T vector(TaKaRa，Dalian，China).

1.3 方法

1.3.1 四種鯉科魚(yú)類IMF與剪切力的測(cè)定

從-20℃冰箱取出冷凍的四種魚(yú)肉樣品，放入冰箱4℃熟化12 h，然后利用物性測(cè)定儀測(cè)定其剪切力，利用索氏抽提法測(cè)定IMP含量.

1.3.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

從液氮中取出四種魚(yú)類的背肌和腹肌樣品，然后按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)鑒定其質(zhì)量.取1μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，以O(shè)ligo(dT)為引物合成cDNA.

1.3.3 熒光定量PCR

利用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)GenBank上登錄的序列:鯉魚(yú) H-FABP(GU205785.1)，草魚(yú)PPARγ(EU847421)，鯉魚(yú)PPARγ(FJ849064.1)，草魚(yú)PGC-1α(JN195738)，草魚(yú) CAST(JF825477)，鯉魚(yú)CAST(JX275386)，草魚(yú)beta-ACTIN(DQ211096)，鯉魚(yú)beta-ACTIN(JQ013000)設(shè)計(jì)四種魚(yú)所對(duì)應(yīng)的引物(表1).熒光定量 PCR反應(yīng)體系為:10 μL SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)PCR，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA 1μL，加水至20 μL.反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性1 min，95°C 30 s，53.2-62℃ 30 s，45個(gè)循 環(huán)，72°C延伸30 s.

表1 引物序列表Table 1 primer sequence

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

本研究中不同魚(yú)類肌內(nèi)脂肪，肌肉剪切力以及基因相對(duì)表達(dá)結(jié)果使用Graphpad Prism軟件分析，F(xiàn)檢驗(yàn)，當(dāng)p＜0.05時(shí)，被認(rèn)為差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 四種鯉科魚(yú)類肉質(zhì)性狀測(cè)定結(jié)果

四種鯉科魚(yú)類背肌和腹肌樣品通過(guò)索氏抽提器測(cè)得肌內(nèi)脂肪含量如圖1所示，齊口裂腹魚(yú)背部與腹部的IMF含量極顯著高于其他魚(yú)類腹部的IMF含量.

圖1 四種魚(yú)類肌內(nèi)脂肪含量的比較(A，背部；B，腹部)(??P＜0.01，???P＜0.001)Fig.1 Intramuscular fat content in the four kinds of fish

四種魚(yú)背肌和腹肌樣品通過(guò)物性儀測(cè)得剪切力結(jié)果見(jiàn)表2，由表2可以看出這四種魚(yú)的背部肌肉的剪切力均大于腹部肌肉的剪切力，且齊口裂腹魚(yú)背部和腹部的剪切力均顯著低于其他三種魚(yú)類(P＜0.05)，說(shuō)明齊口裂腹魚(yú)的腹部肌肉最嫩.

表2 四種魚(yú)背、腹部肌肉剪切力分析結(jié)果Table 1 Dorsal and abdominal muscle shear force analysis of four kinds of fish

2.2 肉質(zhì)性狀相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果

qPCR檢測(cè)肉質(zhì)性狀相關(guān)基因(H-FABP、PPARγ、PGC-1α和CAST)在四種鯉科魚(yú)類背肌和腹肌中的表達(dá)，結(jié)果顯示以齊口裂腹魚(yú)為參考對(duì)象，H-FABP基因在齊口裂腹魚(yú)的背肌及腹肌中表達(dá)水平比鯽魚(yú)高；PGC-1α基因在齊口裂腹魚(yú)的背肌及腹肌中表達(dá)水平最高(P＜0.05).PPARγ在齊口裂腹魚(yú)的背部及腹部肌肉中表達(dá)水平最低(P＜0.05).CAST基因在齊口裂腹魚(yú)的背部及腹部肌肉中表達(dá)水平最低(P＜0.05)(圖2).

圖2 四種魚(yú)背部和腹部肌肉中H-FABP，PPARγ，PGC-1α，CAST基因的表達(dá)(?P＜0.05，??P＜0.01，???P＜0.001)Fig.2 Relative expression levels of H-FABP，PPARγ，PGC-1α，CAST in the dorsal and abdominal muscles of four kinds of fish.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)比較了齊口裂腹魚(yú)、草魚(yú)、鯉魚(yú)和鰱魚(yú)四種鯉科魚(yú)類肌肉組織剪切力和IMF含量的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚(yú)背肌和腹肌的剪切力均顯著低于其他三種魚(yú)類，IMF含量顯著高于其他三種鯉科魚(yú)類，結(jié)果提示齊口裂腹魚(yú)肉質(zhì)較其他三種鯉科魚(yú)類細(xì)嫩.

為了揭示其肉質(zhì)優(yōu)良的可能原因，本實(shí)驗(yàn)利用qPCR技術(shù)檢測(cè)了與IMF和嫩度有關(guān)的候選基因HFABP、PPARγ、PGC-1α與CAST等在四種鯉科魚(yú)類肌肉組織中的表達(dá).結(jié)果指出，H-FABP、PGC-1α在齊口裂腹魚(yú)的背部及腹部肌肉中表達(dá)水平最高，與IMF含量變化趨勢(shì)一致；PPARγ則表達(dá)水平最低，與IMF變化趨勢(shì)相反，提示齊口裂腹魚(yú)可能通過(guò)正調(diào)控 HFABP、PGC-1α及負(fù)調(diào)控PPARγ基因變化來(lái)促進(jìn)IMF沉積.具體的相關(guān)性分析及作用機(jī)制還需要進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證.已有研究證明H-FABP基因在不同動(dòng)物中均與IMF含量存在相關(guān)性[12-14]，但不同動(dòng)物相關(guān)結(jié)果存在差異，比如在豬中與 IMF含量呈正相關(guān)[12]，在雞中卻呈負(fù)相關(guān)[13].綜合上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)H-FABP基因表達(dá)水平與動(dòng)物肉質(zhì)調(diào)控的關(guān)系可能存在物種特異性.研究表明PGC-1α可作為動(dòng)物肉質(zhì)性狀的候選基因，抑制成肌細(xì)胞增殖[15]，影響肌纖維類型的轉(zhuǎn)化，并與IMF含量呈正相關(guān)[16].與本實(shí)驗(yàn)中肌內(nèi)脂肪含量較高的齊口裂腹魚(yú)中PPARγ含量較低的結(jié)果不同，王麗等指出，PPARγ在5和7周齡低脂系肉雞脂肪組織中的表達(dá)水平低于高脂系中的表達(dá)水平[17]，結(jié)果不同的原因可能是不同物種，不同研究部位所致.本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得CAST基因在齊口裂腹魚(yú)的背部及腹部肌肉中表達(dá)水平最低，與剪切力變化趨勢(shì)一致.已知CAST是一種內(nèi)源性的、需Ca2＋激活的鈣蛋白酶抑制劑，通過(guò)抑制p-calpain的一系列變化來(lái)進(jìn)一步影響肌肉的嫩度，在肉的嫩化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[18].

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚(yú)肌肉組織與其他三種鯉科魚(yú)類相比，其IMF含量最高，剪切力最低.并且發(fā)現(xiàn)肉質(zhì)性狀相關(guān)基因H-FABP與PGC-1α在齊口裂腹魚(yú)肌肉組織中表達(dá)高于其他魚(yú)類，PPARγ與CAST基因在齊口裂腹魚(yú)肌肉組織中的表達(dá)水平低于其他魚(yú)類.但這些相關(guān)基因具體如何調(diào)控齊口裂腹魚(yú)優(yōu)良肉質(zhì)形成的分子機(jī)制需要進(jìn)一步進(jìn)行研究闡明.

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(責(zé)任編輯：李建忠，付強(qiáng)，張陽(yáng)，羅敏；英文編輯：周序林，鄭玉才)

Study on expression difference of genes related to meat quality in muscle tissue of four cyprinid fishes

ZHAO Yan-ying1，LI Rui-wen2，LI Hu3，LI Qian1，LIN Ya-qiu1，CHEN Juan1

(1.School of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.Reproductive and Endocrine Laboratory，Chengdu Woman-Child Central Hospital，Chengdu 610091，P.R.C.；3.School of Life Science and Technology，Xinxiang Medicine University，Xinxiang 453003，P.R.C.)

In order to clarify the expression difference of genes related to meat quality in muscle tissue of four cyprinid fishes，Schizothorax prenanti，Ctenopharyngodon idellus，Cyprinus carpio and Hypophthalmichthys molitrix were selected as the research objects in this study.The intramuscular fat(IMF)content and shear force of the dorsal and abdominal muscles of four cyprinid fishes were detected by using Soxhlet extraction method and texture analyzer.In addition，quantitative RT-PCR was used to detect the relative expression of genes related to meat quality in muscle tissues of four cyprinid fishes，including heart fatty acidbinding protein(H-FABP)，peroxisome proliferators-activated receptor γ(PPARγ)，PPAR gamma coactivator-1α(PGC-1α)，Calpastatin(CAST).The results indicated that the IMF contents in the dorsal and abdominal muscles of the Schizothorax Prenanti were significantly higher than those of other fishes，and the shear force of the dorsal and abdominal muscles was significantly lower than that of other three fishes.The expression level of H-FABP and PGC-1α in dorsal and abdominal muscles of the Schizothorax Prenanti was the highest，while the expression level of PPARγ and H-FABP was the lowest.The lowest expression level of CAST was also found in the dorsal and abdominal muscles of the Schizothorax Prenanti.The results provide important

Schizothorax prenanti；Ctenopharyngodon idellus；Cyprinus carpio；Hypophthalmichthys molitrix；IMF；shear force；gene expressionreference data for elucidating the molecular mechanism of meat quality of the Schizothorax Prenanti.

Q7；Q959.4

A

2095-4271(2016)04-0393-06

10.11920/xnmdzk.2016.04.005

2016-03-23

趙燕英(1981-)，女，漢族，湖北襄陽(yáng)人，副教授，博士，研究方向:基因功能驗(yàn)證.E-mail:biozyy＠163.com

林亞秋(1976-)，女，教授，博士.E-mail:linyq1999＠163.com

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目(2014JY0088)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31201990)