GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)25A在親子鑒定中的應(yīng)用

練勇伶，邱平明，陳玲

（南方醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院，南方醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，廣東 廣州510515）

GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)25A在親子鑒定中的應(yīng)用

練勇伶，邱平明，陳玲

（南方醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院，南方醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，廣東 廣州510515）

目的 探討GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒在親子鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。方法 對(duì)738例親子鑒定的1 680份樣本，采用Goldeneye 25A試劑盒復(fù)合擴(kuò)增23個(gè)常染色體STR基因座和1個(gè)Y-STR基因座，評(píng)估該系統(tǒng)在親子鑒定中的排除能力和突變率。 結(jié)果采用Goldeneye 25A系統(tǒng)，累積非父排除率大于0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 999。738例親子鑒定案例中排除親子關(guān)系63例，最常見(jiàn)為9～13個(gè)基因座排除；等位基因突變事件22例，其中一步突變21例，二步突變1例，20例表現(xiàn)為1個(gè)STR基因座突變，1例表現(xiàn)為2個(gè)STR基因座突變；D19S253與FGA基因座的突變率最高，均為5.42×10-3，父系突變與母系突變比例為6.33∶1。Y-STR與Amelogenin基因座的分型結(jié)果相符。結(jié)論Goldeneye 25A系統(tǒng)用于親子鑒定是高效的。

法醫(yī)遺傳學(xué)；STR；親子鑒定；GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)25A

GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒（簡(jiǎn)稱(chēng)Goldeneye 25A）是北京基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)有限公司2015年末推出的一個(gè)五色熒光STR復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)。該系統(tǒng)在GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)20試劑盒的基礎(chǔ)上，增加了4個(gè)常染色體STR基因座（D22S1045、 D1S1656、D10S1248、D2S441）和1個(gè)Y染色體STR基因座（DYS391）。本研究對(duì)該系統(tǒng)在738例親子鑒定中的應(yīng)用情況進(jìn)行了分析，評(píng)估該系統(tǒng)在親子鑒定應(yīng)用中的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

本鑒定中心2016年1月—2016年5月受理的738例親子鑒定案件，共1680份樣本，包括血痕、血液、毛發(fā)、羊水、口腔拭子、肌肉等。738例中，三聯(lián)體331例，父子二聯(lián)體244例，母子二聯(lián)體163例，均知情同意。

1.2 儀器

3500xl遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）。

1.3 方法

除血痕、口腔拭子采用直擴(kuò)法，其余樣品均采用Chelex-100法[1]提取DNA。 采用GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒復(fù)合擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10 μL，其中含去離子水6 μL、5×PCR反應(yīng)預(yù)混液Ⅳ2μL、5×25A引物混合物2μL、模板為1mm2血痕/口腔拭子或1μL DNA提取液。熱循環(huán)條件為：95℃2min；94℃5s，60℃1min，循環(huán)30次；60℃10min，15℃保溫，最終擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。GeneMapper IDX軟件分析結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

累積非父排除率（CPE）參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行計(jì)算。對(duì)每例案件計(jì)算累積親權(quán)指數(shù)（CPI）[3]。根據(jù)親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范[4]，3個(gè)以上的基因座不符合遺傳規(guī)律，則排除父權(quán)關(guān)系的存在；CPI≥10000，則支持親權(quán)關(guān)系的存在；有1~2個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律，可以考慮為基因突變；將與子代新等位基因相差最小的親代基因視為突變基因，該親代視為突變基因的提供者，以確定突變基因的父/母來(lái)源[5]。

2 結(jié)果

2.1 Goldeneye 25A在親子鑒定中的應(yīng)用

本系統(tǒng)累積非父排除率大于0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 999。

用Goldeneye 25A系統(tǒng)檢測(cè)738例親子鑒定案件，331例三聯(lián)體案例中認(rèn)定316例，排除15例，407例二聯(lián)體案例中認(rèn)定359例，排除48例（表1）；排除基因座最少4個(gè)，多為9～15個(gè)基因座，排除概率較高的基因座為Penta E、D18S51和FGA（表2）。Goldeneye 25A認(rèn)定親子關(guān)系的三聯(lián)體案例，CPI小于10000的占0.949%（3/316），其中2例小于10 000是因?yàn)榘l(fā)生突變。Goldeneye 25A認(rèn)定親子關(guān)系的二聯(lián)體案例，CPI小于10 000的占1.114%（4/359），均有突變發(fā)生。

表1 738例親子鑒定的排除情況

表2 各基因座排除情況

2.2 STR突變

Goldeneye 25A系統(tǒng)肯定親子關(guān)系的675例案件中共發(fā)現(xiàn)等位基因突變事件22例，20例表現(xiàn)為1個(gè)STR基因座突變，1例表現(xiàn)為D19S253與FGA這2個(gè)STR基因座均突變；21例為一步突變，1例為二步突變、發(fā)生在Penta E基因座。各基因座突變率（表3），其中D19S253與FGA突變率最高；父系突變19例，母系突變3例，父系突變與母系突變的比例為6.33∶1，總的突變率小于0.2%。

表3 各基因座突變率

2.3 三等位基因現(xiàn)象

Goldeneye 25A系統(tǒng)否定親子關(guān)系的63例中發(fā)現(xiàn)2例罕見(jiàn)的基因變異，其中1例Penta D基因座上孩子基因型為（9，13，14），峰高比約為1∶1∶1（圖1），疑父基因型為（8，12）。

圖1 Goldeneye 25A系統(tǒng)和PowerPlex21系統(tǒng)在Penta D基因座的分型圖譜

2.4 無(wú)效等位基因

用Goldeneye 25A系統(tǒng)檢測(cè)的738例親子鑒定案件中，1例親子鑒定經(jīng)Goldeneye 25A系統(tǒng)檢測(cè)，父和子在Penta E基因座均表現(xiàn)為純合子、且峰高和附近雜合子基因座的峰高接近，經(jīng)PowerPlex21系統(tǒng)檢測(cè)證實(shí)Goldeneye 25A系統(tǒng)在Penta E基因座出現(xiàn)等位基因丟失，父基因型為（14，19），子基因型為（18，19）（圖2）。

圖2 Goldeneye 25A系統(tǒng)和PowerPlex21系統(tǒng)檢測(cè)一例案件在Penta E基因座的分型圖譜

3 討論

3.1 親子鑒定系統(tǒng)的效能分析

Goldeneye 25A系統(tǒng)的累積非父排除率大于0.999 999 999 999 999 999 999 999 999 999，高于Goldeneye 20A試劑盒[6]，表明該系統(tǒng)對(duì)于親子鑒定有更高的效力。

Goldeneye 20A系統(tǒng)中DNA變性-復(fù)性-延伸循環(huán)進(jìn)行[7]。Goldeneye 25A系統(tǒng)因復(fù)性與延伸溫度一致，均為60℃，在引物結(jié)合模板DNA的同時(shí)進(jìn)行DNA延伸。Goldeneye 20A直接擴(kuò)增需2 h 50 min；提取后擴(kuò)增需2h 30min。Goldeneye 25A系統(tǒng)擴(kuò)增只需50多分鐘，所以Goldeneye 25A系統(tǒng)更省檢測(cè)時(shí)間。

3.2 STR基因座的突變和變異分析

Goldeneye 25A系統(tǒng)認(rèn)定的675例親子鑒定中，有12個(gè)STR基因座檢出突變，突變率最高的基因座是D19S253與FGA，本研究觀察到1宗案件在D19S253與FGA兩個(gè)基因座均發(fā)生突變。FGA在本中心大群體樣本的研究中也顯示該基因座是高突變率基因座。足夠大數(shù)量的群體樣本才可獲得比較接近的突變率數(shù)據(jù)。因此突變率數(shù)據(jù)要參考大群體樣本的研究。目前尚無(wú)D19S253在大群體樣本中的突變率數(shù)據(jù)，但本研究顯示該基因座可能為高突變基因座，這有待后續(xù)親子案件的積累和進(jìn)一步觀察。而

D13S317、TPOX、D7S820、D1S1656、D8S1179、D5S818、CSF1P0、D3S1358、vWA、D2S441、TH01等基因座未觀察到突變事件，與本研究案件數(shù)量少有關(guān)。本研究觀察的減數(shù)分裂次數(shù)男女比例為1.50∶1，父系突變與母系突變比例為6.33∶1，男性精母細(xì)胞成熟所需的分裂次數(shù)比女性配子成熟的分裂次數(shù)多，父系突變率較高，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相似[8]。

2例三等位基因的個(gè)體，分別采用不同的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其結(jié)果一致，說(shuō)明檢出的2例個(gè)體三帶型等位基因不是污染或泳道滲漏造成的假象，也不是PCR擴(kuò)增引起的非特異性產(chǎn)物[9]。Penta D表現(xiàn)為三帶的案例，其D21S11基因座分型結(jié)果為29/31、其中等位基因31的峰高約為等位基因29峰高的2倍，追溯案情確認(rèn)為21三體綜合征。CSF1PO為表現(xiàn)為三帶的案例，其D5S818基因座表現(xiàn)正常，排除染色體數(shù)量異常；因峰高較低的兩個(gè)等位基因僅相差一個(gè)核心重復(fù)序列，推測(cè)可能是原本為雜合子的兩個(gè)等位基因在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，其中的一個(gè)等位基因發(fā)生了一步滑動(dòng)錯(cuò)配，從而產(chǎn)生新的等位基因[10]。

Goldeneye 25A系統(tǒng)檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)1例親子鑒定在Penta E基因座出現(xiàn)等位基因丟失。DNA圖譜顯示該基因座的峰高與附近雜合子基因座的峰高接近，且僅該基因座違反遺傳規(guī)律，初步預(yù)測(cè)可能是等位基因丟失，加做PowerPlex21系統(tǒng)檢測(cè)，確認(rèn)用Goldeneye 25A檢測(cè)時(shí)在Penta E基因座出現(xiàn)等位基因丟失。目前常使用不同的試劑盒檢測(cè)或測(cè)序來(lái)確定是否出現(xiàn)等位基因丟失（無(wú)效等位基因）[11]。

近年因入戶等需求，親子鑒定案件量劇增，選擇高效的檢測(cè)系統(tǒng)非常必要。與Goldeneye 20A系統(tǒng)相比，Goldeneye 25A系統(tǒng)檢測(cè)可獲得更多基因座的分型結(jié)果，系統(tǒng)效能也優(yōu)于Goldeneye 20A系統(tǒng)。然而，對(duì)于該系統(tǒng)影響親子鑒定結(jié)果判定的STR基因座突變、三帶型、等位基因丟失等問(wèn)題仍需注意，必要時(shí)需增加其他檢測(cè)手段復(fù)核，以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[1][美]John M Butler.法醫(yī)DNA分型專(zhuān)論[M].第3版.侯一平，李成濤，譯.北京：科學(xué)出版社，2013：83-117.

[2]侯一平.法醫(yī)物證學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：21-23.

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（本文編輯：李成濤）

Application of GoldeneyeTMDNA ID System 25A Kit in Paternity Testing

LIAN Yong-ling，QIU Ping-ming，CHEN Ling
（Department of Forensic Science，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

Objective To assess the feasability of applying GoldeneyeTMDNA ID 25A Kit in paternity test cases.Method 23 autosomal STR loci and 1 Y-STR locus of 1680 samples from 738 cases were amplified with Goldeneye 25A kit to validate its exclusion power and mutation rate.Results The cumulated chance of exclusion and the cumulated discriminating power of Goldeneye 25A were greater than 0.999，999，999，999，999，999，999，999，999，999.63 out of 738 cases were excluded，most of which had 9-13 exclusion loci.22 mutation events were observed.Among them，21 mutations were one step and 1 mutation was two steps;20 cases showed single-locus mutation and 1 case showed two-loci mutation.D19S253 and FGA had the highest mutation rate of 5.42×10-3.The ratio of paternal mutation versus maternal mutation was 6.33∶1.The genotype results of Y-STR were consistent with those of Amelogenin.Conclusion Goldeneye 25A is highly effective for paternity testing.

forensic genetics;STR;paternity testing;GoldeneyeTMDNA ID 25A Kit

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2016.06.004

1671-2072-（2016）06-0018-05

2016-06-30

練勇伶（1994—），女，碩士研究生，主要從事分子遺傳學(xué)研究。E-mail：416585484@qq.com。

陳玲（1980—），女，副主任法醫(yī)師，博士，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究。E-mail：lingpzy@163.com。