高效液相色譜法測(cè)定三花膏中蒙花苷含量

邱 慧，戴群芳，汪保林

（1．江西省南昌市洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330000； 2．江西省南昌市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 南昌 330038）

高效液相色譜法測(cè)定三花膏中蒙花苷含量

邱 慧1，戴群芳2，汪保林2

（1．江西省南昌市洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330000； 2．江西省南昌市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 南昌 330038）

目的 建立測(cè)定三花膏中蒙花苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 以三花膏中野菊花藥材中的主要活性成分蒙花苷為對(duì)照品，采用Phenomenex Luna C18反相色譜柱(250 mm×4．6 mm，5 μm)，以甲醇(A)－含10 mmol／L H3PO4的水溶液(B，48∶52)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，流速為1．0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm，柱溫為35℃。結(jié)果 蒙花苷質(zhì)量濃度在4．67～46．74 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0．999 9，n＝5），加樣回收率為99．75%，RSD為1．80%（n＝6）。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，適用于三花膏中蒙花苷的含量測(cè)定。

高效液相色譜法；三花膏；蒙花苷；含量測(cè)定

三花膏是南昌市洪都中醫(yī)院自制制劑（批準(zhǔn)文號(hào)為贛藥制字Z20090089），由木芙蓉花、野菊花、金銀花3味藥組方。全方具有清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)之功效，主治癰疽疔癤、乳癰、以及無(wú)名腫毒，臨床應(yīng)用療效顯著。野菊花為菊科 Compositae植物野菊 Chrysanthemum indicum L．的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、瀉火平肝之功效，多用于疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈等癥[1]。其含有木犀草苷、綠原酸、蒙花苷、尿嘧啶、槲皮素、丁香脂素、鵝掌楸堿、麥黃酮、β－谷甾醇、α－香樹(shù)脂醇、β－香樹(shù)脂醇、羽扇豆醇、金合歡素、香草酸等多種化學(xué)成分[2－5]。野菊花為本制劑的主藥之一，而蒙花苷為野菊花藥材的重要活性成分。文獻(xiàn)[6－8]報(bào)道蒙花苷的含量測(cè)定多采用高效液相色譜(HPLC)法。為了有效控制該醫(yī)院制劑的質(zhì)量，參照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》中藥材野菊花的HPLC測(cè)定方法并結(jié)合文獻(xiàn)[9]，以蒙花苷為檢測(cè)指標(biāo)，建立了測(cè)定本品中蒙花苷含量的HPLC法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Shimadzu LC－20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；BS224 S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Mettler Toledo XS105 DualRange型電子天平(Mettler Toledo公司)；UV－2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ－300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥

蒙花苷對(duì)照品（批號(hào)為111528－200606，中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量為98．3%）；三花膏（洪都中醫(yī)院制劑中心，批號(hào)分別為20160420，20160519，20160515）；甲醇為色譜純（Merck公司）；水為超純水（Purifier DZG－303A超純水系統(tǒng)，博科公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex Luna C18反相色譜柱(250 mm× 4．6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)－含10 mmol／L磷酸的水溶液(B，48∶52)；流速：1 mL／min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按蒙花苷計(jì)應(yīng)不低于10 000。在此色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖1。供試品蒙花苷峰保留時(shí)間為17．8 min。陰性對(duì)照品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間無(wú)吸收峰，表明對(duì)含量測(cè)定無(wú)干擾。

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：精密稱取蒙花苷對(duì)照品適量，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為77.4 μg/mL的溶液，即得對(duì)照品貯備液。

圖1 高效液相色譜圖

供試品溶液：取本品約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取缺野菊花的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得缺野菊花的陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

供試品溶液提取方法考察：選擇以測(cè)定供試品中蒙花苷的含量為指標(biāo)，對(duì)提取溶劑（因素A）和超聲時(shí)間（因素B）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。按直觀分析，影響含量測(cè)定結(jié)果的因素為A＞B，最佳提取工藝為 A2B3，故擬選擇 A2B3，即供試品以70%甲醇超聲處理45 min。由于3種超聲時(shí)間中含量測(cè)定結(jié)果基本一致，因此在不影響試驗(yàn)準(zhǔn)確性的前提下，綜合考慮到時(shí)間、成本效益，最終選擇超聲30 min作為提取條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 L9（32）正交試驗(yàn)考察結(jié)果

線性關(guān)系考察：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液作為1號(hào)對(duì)照品溶液，分別精密量取0.5，1.0，1.5，3.0，5.0 mL，置10 mL棕色容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件分別取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=2.215 64×107X+4 918.75，r=0.999 9。結(jié)果質(zhì)量濃度在4.67～46.74 g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限測(cè)定：精密稱取蒙花苷對(duì)照品適量，將2.2項(xiàng)下制得的對(duì)照品溶液用甲醇逐級(jí)稀釋，取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，按3倍信噪比計(jì)算化合物的檢測(cè)限。結(jié)果檢測(cè)限為0.54 ng。

精密度試驗(yàn)：取4號(hào)對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各化合物的峰面積。結(jié)果的 RSD為0.5%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為1.0%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批三花膏樣品6份，每份約2.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果蒙花苷的平均含量為 0.62 mg/g，RSD為0.5%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量（蒙花苷含量為0.62 mg/g）的三花膏樣品6份，每份約2.5 g，精密稱定，分別置已加標(biāo)并經(jīng)氮?dú)獯蹈傻?個(gè)錐形瓶中（90 μg/mL的蒙花苷對(duì)照品溶液各15 mL），依法制備供試品溶液。分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量及回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蒙花苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取9批三花膏樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每份樣品測(cè)3次，以外標(biāo)法計(jì)算各指標(biāo)成分含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 三花膏中蒙花苷含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

綠原酸、木犀草苷等也是野菊花的主要活性成分［2］，但易與三花膏處方中的金銀花藥材所含活性成分形成干擾，因此本研究中最終選擇具有廣泛藥理活性，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且能被準(zhǔn)確、靈敏測(cè)定的蒙花苷作為三花膏含量控制標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

取蒙花苷對(duì)照品適量，用水（10 mmol/L磷酸）-甲醇（52∶48）溶液配制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的對(duì)照品溶液，在190～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，測(cè)得蒙花苷在334 nm波長(zhǎng)處有較大吸收。

3.3 流動(dòng)相篩選

考察了2015年版《中國(guó)藥典（一部）》野菊花蒙花苷含量測(cè)定項(xiàng)下的流動(dòng)相甲醇-水-冰醋酸（26∶23∶1）［1］、乙腈-甲醇-0.5%冰醋酸梯度洗脫［9］及水（10 mmol/L H3PO4）-甲醇（32∶48），結(jié)果，后者洗脫效果較理想，故選擇后者為流動(dòng)相。

3.4 提取方法考察

考察了不同濃度的甲醇溶液與不同提取時(shí)間對(duì)蒙花苷提取效果的影響，結(jié)果表明，70%的甲醇超聲30 min的效果較理想，提取充分且效果十分穩(wěn)定；先用石油醚進(jìn)行提取，繼而棄去石油醚提取液，然后再采用不同濃度的甲醇進(jìn)行超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，回收率明顯低于單一的超聲提取方法。故選擇70%甲醇超聲處理30 min。

3.5 對(duì)照品溶液制備

蒙花苷對(duì)照品易溶于熱的甲醇溶液中，在制備對(duì)照品溶液的過(guò)程中，需仔細(xì)觀察，確保其充分溶解，必要時(shí)可采用加熱的方法促使其溶解，冷卻至室溫后再定容至刻度。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：314-315.

［2］馮子明，楊椏楠，姜建雙，等.野菊花的化學(xué)成分［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35（24）：3 302-3 305.

［3］王錦越，陳 東，梁麗娟，等.野菊花的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35（6）：718-721.

［4］畢躍峰，潘成學(xué)，王普菊，等.野菊花的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2009，44（12）：894-897.

［5］高美華，李 華，張 莉.野菊花化學(xué)成分的研究［J］.中藥材，2008，31（5）：682-684.

［6］譚曉杰，賈 英，陳曉輝，等.RP-HPLC法測(cè)定野菊花中蒙花苷含量［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，21（6）：434-435.

［7］崔蘭沖，李小芩，韓 瑩，等.HPLC測(cè)定野菊花中蒙花苷與木犀草素的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32（1）：33-35.

［8］郭美蘭，敬應(yīng)春，蔡國(guó)琴.RP-HPLC同時(shí)測(cè)定野菊花中綠原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2012，14（4）：10-13.

［9］孫 菲，孫 欣，金 榮.高效液相色譜法測(cè)定香菊膠囊中蒙花苷含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2016，25（8）：72-74.

Content Determination of Linarin in Sanhua Ointments by HPLC

Qiu Hui1,Dai Qunfang2,Wang Baolin2
(1．Nanchang Hongdou Hospital of TCM,Nanchang,Jiangxi,China 330000; 2．Nanchang Institute for Food and Drug Control,Nanchang,Jiangxi,China 330038)

Objective To develop an HPLC method for the content determination of linarin in Sanhua Ointments．Methods Linarin, which was the main active ingredient of Flos Chrysanthemi Indici in Sanhua Ointments,was used as the reference standard．The isolation was performed on a Phenomenex Luna C18reversed phase column(250 mm× 4．6 mm,5 μm)with the mobile phase consisting of methanol－water(containing 10 mmol／L H3PO4)(48∶52),isocratic elution;the flow rate was 1．0 mL／min,the detection wavelength was 334 nm and the column temperature was set at 35℃．Results The linearity of linarin was good in the range of 4．67－46．74 g／L (r＝0．999 9,n＝5),the average recovery rate was 99．75% and RSD was 1．80%（n＝6）．Conclusion This method is simple,accurate, and specific for the content determination of linarin in Sanhua Ointments．

HPLC;Sanhua Ointments;linarin;content determination

邱慧，碩士研究生，藥師，研究方向?yàn)樗幬锓治?，（電子信箱?12672105@qq.com；汪保林，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锓治?，本文通訊作者，（電話?791-88538260（電子信箱）rlxlei1021@163.com。

2016－04－22；

2016－06－01）

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)19－0061－03