曼陀羅子對小鼠L5178Y細(xì)胞TK基因的致突變作用

彭曉明，霍仕霞，高 莉，閆 明

（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所·新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830049）

曼陀羅子對小鼠L5178Y細(xì)胞TK基因的致突變作用

彭曉明，霍仕霞，高 莉，閆 明

（新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所·新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830049）

目的 研究曼陀羅子對小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞TK基因的致突變作用。方法 將培養(yǎng)的小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞在代謝活化和非代謝活化條件下，分別以62.5，125，250，500 g/mL的曼陀羅總堿或625，1 250，2 500，5 000 g/mL的氫溴酸東莨菪堿處理3 h后，棄細(xì)胞上清液，并加入DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后將細(xì)胞接種于含三氟胸苷的96孔板，計數(shù)各組的突變細(xì)胞集落數(shù)。結(jié)果 與對照組比較，在代謝活化和非代謝活化條件下，62.5，125，250，500 g/mL的曼陀羅總堿和625，1 250，2 500，5 000 g/mL的氫溴酸東莨菪堿均未見誘導(dǎo)L5178Y細(xì)胞突變率的增加。結(jié)論 62.5～500 g/mL的曼陀羅子總堿和625～5 000 g/mL的氫溴酸東莨菪堿對小鼠L5178Y細(xì)胞TK基因無致突變作用。

曼陀羅子；氫溴酸東莨菪堿；淋巴瘤細(xì)胞；TK基因；突變

曼陀羅子，維吾爾語名為衣提洋克歐如合，為茄科植物曼陀羅 Datura stramonium L.的干燥成熟種子，是維吾爾醫(yī)民間習(xí)用藥。該藥具有生干生寒、安神止痛、固澀壯陽、催眠消炎等功能，被廣泛用于治療乃孜樂性感冒、頭痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、早泄滑精、失眠、痔瘡、牙周炎等濕熱性或血液質(zhì)性疾?。?］，但若給藥劑量控制不當(dāng)易引起中毒反應(yīng)。課題組前期研究已證實(shí)［2-4］，曼陀羅子及其提取物對小鼠肝、腎功能均具有毒性損傷作用，且生藥量超過388 mg/（kg·d）的曼陀羅子提取物亦對Beagle犬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心臟等具有毒性作用。本試驗(yàn)中通過研究曼陀羅子總生物堿提取物和氫溴酸東莨菪堿對小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞TK基因是否具有致突變作用，旨在為曼陀羅子的安全應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇凈安泰），37XAY型倒置熒光顯微鏡（上海光學(xué)六廠），MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱（Sanyo），酶標(biāo)儀（ThermoFisher，Multiskan Go 1510）。1.1.2 試藥

曼陀羅子總生物堿（DTA）由本實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法為，曼陀羅子經(jīng)粗粉后，分別加入5倍、3倍、3倍體積的80%乙醇（pH為3）回流提取3次，每次1 h。提取液過濾濃縮后，加入氨水調(diào)節(jié)pH至8～9，以1∶1體積比例反復(fù)用氯仿萃取至顏色明顯變淺，濃縮冷凍干燥至浸膏，利用酸堿滴定法測定總生物堿含量80%以上。然后稱取0.1 g的DTA，加入200 μL二甲基亞砜（DMSO）超聲溶解，備用。氫溴酸東莨菪堿（SH，批號為LRAA3018）購自Sigma-Aldrich公司。

DMEM（高糖）培養(yǎng)基和馬血清為Gibco公司產(chǎn)品。氨芐青霉素鈉和硫酸鏈霉素購自Amersco公司。DMSO、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、甲基甲烷磺酸乙酯（MMS）、環(huán)磷酰胺（CP）均為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。哺乳動物微粒體酶S9購自上海寶錄生物科技有限公司。

1.1.3 細(xì)胞株

小鼠淋巴瘤細(xì)胞株L5178Y TK+/-clone（3.7.2c）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 方法［5］

1.2.1 L5178Y細(xì)胞培養(yǎng)及藥物劑量的篩選

L5178Y細(xì)胞傳代2～3次后，以1 000 r/min離心收集細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基（不含血清）調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106個/mL左右，轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板，每孔90 μL。然后分別以15.625，31.25，62.5，125，250，500 μg/mL的DTA及10，100，1 000，10 000 μg/mL的SH作用細(xì)胞 24 h。藥物作用完成后，每孔加入 5 g/L的 MTT 10 μL，作用4 h后，每孔加入100 μL三聯(lián)液（10%十二烷基硫酸鈉，5%異丁醇，0.012 mol/L HCl），37℃放置過夜。于全波長Multiskan Go 1510酶標(biāo)儀測定570 nm波長處吸光度值（A），應(yīng)用公式計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=A給藥/A正常×100%。

1.2.2 DTA和SH對L5178Y細(xì)胞致突變的檢測

受試藥物處理：離心收集L5178Y細(xì)胞，以DMEM培養(yǎng)基（含10% 馬血清）調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106個/mL左右，轉(zhuǎn)至15 mL離心管（每管10 mL）。除非代謝活化細(xì)胞外，所有的代謝活化細(xì)胞均需加入200 μL肝微粒體S9混合液。然后將細(xì)胞分為DTA 500，250，125，62.5 μg/mL組，SH 5 000，2 500，1 250，625 μg/mL組，陽性藥組為5 μg/mL MMS（非代謝活化）和2 μg/mL CP（代謝活化），陰性對照為0.1%的DMSO。上述樣品均以2%體積分?jǐn)?shù)加入細(xì)胞培養(yǎng)液，然后于37℃搖床震蕩處理3 h（振蕩頻率為7～18次/分）。

細(xì)胞平板效率（PE）和相對存活率檢測：處理結(jié)束后以1 000 r/min離心收集細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再次離心后吸棄培養(yǎng)基。以DMEM培養(yǎng)基（含10%馬血清）調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×105個/mL，然后吸取少量的細(xì)胞再以DMEM培養(yǎng)基（含20%馬血清）稀釋至8個/mL細(xì)胞懸液，置96孔板，每孔200 μL。于37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 d后，計數(shù)96孔板中含有細(xì)胞集落的孔數(shù)，計算平板效率（PE0）。同時，將剩余濃度為2×105個/mL的 L5178Y細(xì)胞轉(zhuǎn)入 96孔板，每孔200 μL，于37℃ CO2培養(yǎng)箱表達(dá)48 h后，計算第2天的平板效率（PE2）。平板效率（PE）=-ln（EW/TW）/n，EW為不含集落孔數(shù)，TW為總孔數(shù)，n=1.6。相對存活率（RS0）=PE0test/PE0control。

細(xì)胞增長率檢測：受試藥物和細(xì)胞處理結(jié)束后，L5178Y細(xì)胞經(jīng)離心、洗滌、再離心后，以DMEM培養(yǎng)基（含10% 馬血清）調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×105個/mL接種至24孔板中，每孔500 μL。分別在接種后的第1天和第2天進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并計算細(xì)胞增長率（DCG）、相對懸浮生長率（RSG）和相對總增長率（RTG）。細(xì)胞增長率（DCG）=細(xì)胞濃度次日/細(xì)胞濃度前日，相對懸浮生長率（RSG）=（DCG1d×DCG2d）test/（DCG1d×DCG2d）control，相對總增值率（RTG）=RSG×RS2。

細(xì)胞突變率檢測：受試藥物和細(xì)胞處理結(jié)束后，棄細(xì)胞上清液，以 DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后，將L5178Y細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)基（含20%馬血清）調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×104個/mL接種至2塊96孔板（含3 μg/mL三氟胸苷），每孔200 μL（復(fù)孔），于37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 10～14 d，計數(shù)含有集落的孔數(shù)，并計算突變率（MF）。突變率（MF）=-ln（EW/TW）/n/PE2，EW為不含集落孔數(shù)，TW為總孔數(shù)（192），n=2 000。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用 Mutant軟件統(tǒng)計分析。受試藥物的突變頻率比陰性對照高2倍或以上，可判定為陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 L5178Y細(xì)胞給藥濃度的確定

與正常組比較，DTA作用后的細(xì)胞存活率為89.65% ～94.90%，SH作用后的細(xì)胞存活率均超過100%，表明DTA和SH對L5178Y細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性。根據(jù)《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［6］，結(jié)合DTA和SH藥物的溶解能力，故確定DTA的500，250，125，62.5 μg/mL和SH的5 000，2 500，1 250，625 μg/mL作為正式試驗(yàn)劑量。詳見表1和表2。

表1 DTA對L5178Y細(xì)胞存活率的影響

表2 SH對L5178Y細(xì)胞存活率的影響

2.2 非代謝活化下DTA和SH對L5178Y細(xì)胞的影響DTA和 SH在無 S9活化情況下對小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞的毒性作用見表3?？梢姡S著DTA和SH給藥劑量的增加，細(xì)胞的PE，RS，RSG和RTG均無明顯下降，表明DTA和SH對L5178Y細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒性作用。與溶劑對照組比較，突變頻率（MF）隨著給藥濃度增加并無明顯上升趨勢。

2.3 代謝活化下DTA和SH對L5178Y細(xì)胞的影響由表4可知，在代謝活化試驗(yàn)中，與不加S9的個劑量組類似，L5178Y細(xì)胞的PE，RS，RSG和RTG亦無明顯下降。與溶劑對照組比較，DTA和SH給藥組細(xì)胞MF亦無明顯上升趨勢。

表3 DTA和SH對L5178Y細(xì)胞TK基因的致突變性

表4 DTA和SH對L5178Y細(xì)胞TK基因的致突變性

3 討論

小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)（MLA）是Clive等于20世紀(jì)70年代建立的一種體外短期致突變檢測方法，可檢出包括點(diǎn)突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大范圍基因組改變在內(nèi)的多種遺傳改變，具有很高的靈敏度［7］。MLA的檢測終點(diǎn)是TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶，胸苷激酶在體內(nèi)可催化脫氧胸苷（TdR）生成胸苷酸（TMP）的反應(yīng)。正常情況下，此反應(yīng)并非生命所必需的過程，但如果將胸苷類似物（如三氟胸苷、TFT）加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進(jìn)而摻入DNA，造成細(xì)胞致死性突變。而當(dāng)TK基因發(fā)生突變（tk+/-→tk-/-）導(dǎo)致胸苷激酶缺陷時，則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA，故細(xì)胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長，即表現(xiàn)除對TFT的抗性［8］。

曼陀羅種子含有0.2%～0.4%的生物堿，其中主要以東莨菪堿、莨菪堿和阿托品等毒性成分為主［9-10］。曼陀羅子中毒量種子為2～30粒，中毒癥狀有頭暈、嘔吐、心慌、幻視，嚴(yán)重者出現(xiàn)意識喪失、瞳孔散大、昏迷等，因此曼陀羅子對機(jī)體的毒性作用值得關(guān)注。在前期預(yù)試驗(yàn)中，利用MTT比色法檢測15.625，31.25，62.5，125，250，500 μg/mL的 DTA及 10，100，1 000，10 000 μg/mL的SH對小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明DTA和SH對L5178Y細(xì)胞存活率均無顯著降低作用。

本試驗(yàn)中，500 μg/mL是DTA在DMSO中的最大溶解量，而10 g/L的SH對L5178Y細(xì)胞亦無明顯毒性作用，因此根據(jù)《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，確定500 μg/mL的DTA和5 g/L的SH作為正式試驗(yàn)最高劑量。本試驗(yàn)中利用62.5，125，250，500 μg/mL的DTA和625，1 250，2 500，5 000 μg/mL的SH在非活化（不加S9）和活化（加S9）情況下對小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，隨著DTA和SH給藥劑量的增加，細(xì)胞的PE，RS，RSG和RTG均無明顯下降，提示DTA和SH對L5178Y細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒性作用。與溶劑對照組比較，隨著給藥濃度的增加，DTA和其最主要的生物堿成分東莨菪堿處理后的L5178Y細(xì)胞突變頻率（MF）并未出現(xiàn)明顯上升趨勢，提示62.5～500 μg/mL的DTA和625～5 000 μg/mL的SH對小鼠淋巴瘤細(xì)胞TK基因無致突變作用。但目前遺傳毒性評價中，通常采用體外和體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)組合的方法，以減少遺傳毒性受試物的假陰性結(jié)果。因此，曼陀羅子是否確無遺傳毒性，還需進(jìn)一步通過體內(nèi)骨髓細(xì)胞染色體畸變或Ames致突變等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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［5］GB 15193.20-2003，TK基因突變試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) ［S］.

［6］［ZH］GPT 2-1，藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則［S］.

［7］笪紅遠(yuǎn)，曾文，江振洲，等.大黃酸對小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞TK基因的致突變作用［J］.中草藥，2008，39（12）：1 858-1 860.

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［9］劉勇民.維吾爾藥志（下冊）［M］.烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：760.

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Semen Daturae Induced TK Gene Mutation in Mouse L5178Y Cells

Peng Xiaoming，Huo Shixia，Gao Li，Yan Ming
（Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine·Prescription Laboratory of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Wulumuqi，Xinjiang，China 830049）

Objective To investigate the TK gene mutation in mouse lymphoma cell induced by semen daturae.Methods L5178Y cell was treated for 3 h by 62.5，125，250，500 μg/mL of total alkaloids of semen daturae or 625，1 250，2 500，5 000 μg/mL of scopolamine hydrobromide in the activation of metabolic and non-metabolic activation conditions.The supernatant fluid was discarded，and the DMEM media was added to continue developing for 48 h.The number of mutations cell colony in each group was calculated after L5178Y cell was cultured in 96 well plate with TFT.Results Compared with the control group，the mutation rates of L5178Y had no significant increased after total alkaloids of semen daturae or scopolamine hydrobromide treated.Conclusion 62.5-500 μg/mL semen daturae and 625-5 000 μg/mL scopolamine hydrobromide have no mutation effect on TK gene in mouse lymphoma cell.

semen daturae；scopolamine hydrobromide；L5178Y；TK gene；mutation

彭曉明（1983-），男，湖南祁東人，碩士研究生，研究方向?yàn)榧?xì)胞與分子藥理學(xué)，（電子信箱）pxm1983@163.com；閆明（1959-），男，山西原平人，研究員，主要從事藥物分析與新藥研發(fā)工作，本文通訊作者，（電子信箱）yanming21cn@sohu.com。

2016-06-13）

新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)民族醫(yī)藥人才培養(yǎng)計劃項目，項目編號：Q2015-03-05。

R285．5；R282．71

A

1006－4931（2016）19－0017－04