結(jié)直腸癌組織中Syndecan-1與EGFR表達(dá)及KRAS突變的關(guān)系

原少斐 朱林佳 鄭維鍔 張武 孫洪雨

結(jié)直腸癌組織中Syndecan-1與EGFR表達(dá)及KRAS突變的關(guān)系

原少斐 朱林佳 鄭維鍔 張武 孫洪雨

目的 探討結(jié)直腸癌患者中多配體蛋白聚糖-1（Syndecan-1)與表皮生長因子受體（EGFR）表達(dá)及鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS）突變的關(guān)系。方法 選擇原發(fā)性結(jié)直腸癌標(biāo)本160例，結(jié)腸部腫瘤112例，直腸部腫瘤48例；病理類型為腺癌156例，其它病理類型4例。利用免疫組化法檢測組織標(biāo)本中Syndecan-1和EGFR的表達(dá)情況，運(yùn)用直接測序法檢測組織標(biāo)本中KRAS基因外顯子2第12、第13位密碼子的突變狀態(tài)。采用Spearman相關(guān)分析Syndecan-1的表達(dá)與EGFR表達(dá)及KRAS基因突變的關(guān)系。結(jié)果 腫瘤標(biāo)本中Syndecan-1表達(dá)陽性41例，主要位于細(xì)胞膜20例，主要位于細(xì)胞漿16例，細(xì)胞膜與細(xì)胞漿同時(shí)表達(dá)5例。EGFR在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率69.4%，所有結(jié)直腸癌患者中發(fā)生KRAS突變率為37.5%。Syndecan-1的表達(dá)在腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。Syndecan-1的表達(dá)與EGFR表達(dá)呈顯著相關(guān)（r=1.488，P＜0.01），而與KRAS狀態(tài)無相關(guān)性（r=9.278，P＞0.05）。結(jié)論 Syndecan-1的表達(dá)可能對(duì)結(jié)直腸癌患者的進(jìn)展及預(yù)后判斷有一定價(jià)值。

多配體蛋白聚糖-1 表皮生長因子受體 鼠類肉瘤病毒癌基因 結(jié)直腸癌

多配體蛋白聚糖-1（Syndecan-1）屬于整合素黏附分子跨膜硫酸蛋白多聚糖（HPSG）家族的成員，是一種表達(dá)于成熟上皮細(xì)胞、前B細(xì)胞及漿細(xì)胞表面的跨膜蛋白聚糖，分子量約85～92kD，可特異性結(jié)合一些有生物活性的小分子物質(zhì)，主要參與調(diào)控細(xì)胞的生長、分化以及遷移等[1]。Syndecan-1能夠促進(jìn)細(xì)胞之間的黏附，阻止細(xì)胞的侵襲和脫落，進(jìn)而限制腫瘤細(xì)胞的惡性表型，在控制惡性腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移等過程中有重要作用。Syndecan-1在一些上皮來源腫瘤或癌前病變組織中表達(dá)降低或缺失，可作為判斷腫瘤預(yù)后的指標(biāo)[2-3]。KRAS是RAS癌基因家族成員，位于染色體12p12.1，在細(xì)胞生長以及血管生成等相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要調(diào)控作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。KRAS是EGFR信號(hào)通路下游的重要癌基因。有報(bào)道在結(jié)直腸癌中KRAS突變率在30%～40%[6]。最常見的突變發(fā)生在第2號(hào)外顯子的第12和13密碼子。大量臨床試驗(yàn)證實(shí)Cetuximab或Panitumumab聯(lián)合治療野生型KRAS結(jié)直腸癌的有效率為41%～61%，而對(duì)KRAS突變者幾乎無效，因此KRAS突變被認(rèn)為是抗EGFR單抗療效不佳的獨(dú)立預(yù)后因素[7-8]。本研究通過免疫組化法檢測Syndecan-1的表達(dá)，分析其與EGFR表達(dá)及KRAS突變的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2009年6月至2014年12月本院腫瘤外科和胃腸外科手術(shù)切除的原發(fā)性結(jié)直腸癌標(biāo)本160例，患者中男106例，女54例；年齡33～78（52.0±4.8）歲；腺癌156例，未分化癌2例，鱗癌1例，印戒細(xì)胞癌1例，其它病理類型4例；浸潤深度pT1～2期28例，pT3～4期132例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移112例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有標(biāo)本采集前均與患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片制作 構(gòu)建2個(gè)8×8點(diǎn)陣的組織芯片，一個(gè)用于免疫組化染色，一個(gè)用于陰性對(duì)照。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，厚度3μm連續(xù)切片。對(duì)制成芯片的所有組織進(jìn)行點(diǎn)陣標(biāo)記。根據(jù)標(biāo)記，利用點(diǎn)陣儀對(duì)標(biāo)記完成的組織進(jìn)行打點(diǎn)取樣，黏附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。每例標(biāo)本取1個(gè)點(diǎn)?？酒? h，芯片制作完成。

1.2.2 免疫組化SP法 SP試劑盒購于北京中杉生物技術(shù)有限公司，鼠抗人Syndecan-1、EGFR單克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。將待檢標(biāo)本切片后經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，3%H2O2作用15min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；切片置10mmol/L檸檬酸緩沖液中微波加熱以修復(fù)抗原；冷卻后滴加山羊血清封閉液，室溫孵育15min，封閉非特異性抗體。去掉多余血清，加入一抗，4℃過夜。滴加生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶一鏈霉菌卵白素工作液，室溫孵育各15min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判斷 按半定量積分法判斷表達(dá)[9]，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞所占比例分別記為0～3分。染色強(qiáng)度：未著色為0分，著色淺為1分，中度著色為2分，著色深為3分。陽性細(xì)胞百分率：高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均陽性細(xì)胞百分率。陽性細(xì)胞數(shù)百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～49%為2分，≥50%為3分。兩項(xiàng)評(píng)分相加，0～1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++），（+）、（++）、（+++）均視為陽性。

1.2.4 KRAS突變檢測 樣本DNA的提?。哼x擇經(jīng)HE染色證實(shí)存在癌組織并占60%以上的蠟塊，切取3張厚度為10μm組織，裝入1.5ml已消毒離心管，常規(guī)脫蠟處理后，加入蛋白酶K至終濃度1mg/ml，十二烷基硫酸鈉（SDS）至2%。孵育24～36h后，離心處理（15 000r/ min，15min，4℃）。抽取石蠟層下的液體。按照QIAamp DNA FFPF Kit試劑盒（德國Qiagen公司）步驟提取石蠟組織DNA，最后以30μl洗脫液洗脫DNA，DNA產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度，調(diào)節(jié)到100μg/ml，-20℃保存?zhèn)溆谩RAS基因的PCR擴(kuò)增及測序：根據(jù)文獻(xiàn)[10]，選擇擴(kuò)增12/13號(hào)密碼子所需特異性引物，引物序列為：5′：AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATA-3′（正義）；5′：CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3′（反義）。PCR反應(yīng)體系50μl，包含2μl模版DNA，10μmol/L正、反各1μl，25μl Premix（含1.5U TaKaKa Taq；10×PCR Buffer，3.0 mmol/L Mg2+；0.4 mmol/L dNTP Mix），引物及PremixPCR檢測試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。PCR反應(yīng)條件：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃40s，循環(huán)30次，循環(huán)結(jié)束4℃保持，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和分析結(jié)果。選取PCR陽性DNA凝膠條帶作為目的片段，采用QIAquick PCR Purification Kit對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收（Qiagen公司產(chǎn)品），后送至上?；蚣夹g(shù)有限公司測序。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 Syndecan-1表達(dá) Syndecan-1表達(dá)陽性41例，陽性表達(dá)率為25.6%，陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)可見棕黃色顆粒（插頁圖1-4）；其中Syndecan-1的表達(dá)主要位于細(xì)胞膜20例，主要位于細(xì)胞質(zhì)16例，細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)同時(shí)表達(dá)5例。

2.2 不同臨床病理特征中Syndecan-1表達(dá)情況 見表1。

由表1可見，Syndecan-1表達(dá)在腫瘤浸潤深度方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在患者性別、年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 EGFR表達(dá) EGFR表達(dá)陽性111例，陽性表達(dá)率69.4%，主要表達(dá)于細(xì)胞膜，呈棕黃色細(xì)顆粒狀（插頁圖5-6）。

表1 不同臨床病理特征中Syndecan-1表達(dá)情況（例）

2.4 KRAS突變情況 發(fā)生KRAS突變60例，突變率為37.5%；其中13密碼子突變10例，均為G13D（10/ 60，16.7%）；12密碼子突變50例（50/60，83.3%），共檢出5種突變類型，G12D突變率最高（21/60，35.0%），其余依次為G12V（15/60，25.0%），G12A（11/60，18.3%），G12C（10/60，16.7%），G12S（3/60，5.0%）。

2.5 Syndecan-1與EGFR表達(dá)及KRAS突變的關(guān)系見表2。

表2 Syndecan-1與EGFR表達(dá)及KRAS突變的關(guān)系（例）

由表2可見，結(jié)直腸癌患者中Syndecan-1的表達(dá)與EGFR表達(dá)顯著相關(guān)（r=1.488，P＜0.01），而與KRAS基因是否突變無相關(guān)性（r=9.278，P＞0.05）。

3 討論

Syndecan-1是一種表達(dá)于成熟上皮細(xì)胞、漿細(xì)胞、前B細(xì)胞表面的跨膜蛋白聚糖，其硫酸乙酰肝素側(cè)鏈上可特異性地結(jié)合多種生物活性分子，與脂蛋白、病原體等胞吞吐作用有關(guān)。Syndecan-1的功能主要有：（1）隔離保護(hù)生長因子等免被蛋白酶降解，并協(xié)調(diào)其與相應(yīng)受體的結(jié)合；（2）與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)胞黏附；（3）以共受體的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用，參與血管形成、組織器官分化發(fā)育、組織再生等一系列生理過程的調(diào)節(jié)。Syndecan-1通過與其共價(jià)連接的硫酸肝素側(cè)鏈結(jié)合一系列的細(xì)胞外配體，介導(dǎo)細(xì)胞-ECM、細(xì)胞-細(xì)胞間黏附，被認(rèn)為在調(diào)節(jié)細(xì)胞間聯(lián)合和生長因子信號(hào)傳遞中發(fā)揮了重要作用[11-12]。Syndecan-1的表達(dá)在維持正常上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性、影響細(xì)胞遷移的同時(shí)還以共受體方式調(diào)控細(xì)胞增殖，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。在一些上皮來源的腫瘤或癌前病變，如頭頸部腫瘤、肺癌、乳腺癌及胃癌中，Syndecan-1的表達(dá)降低或缺失，并且與臨床預(yù)后相關(guān)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，Syndecan-1在細(xì)胞膜上的表達(dá)對(duì)維持正常腸道黏膜細(xì)胞的形態(tài)至關(guān)重要[14]；其在大腸腺瘤向大腸癌的轉(zhuǎn)化中表達(dá)缺失，導(dǎo)致細(xì)胞喪失生長抑制功能，使腫瘤細(xì)胞能大量增殖，并具有極強(qiáng)的侵襲活性。

本文研究結(jié)果顯示，Syndecan-1在正常結(jié)直腸黏膜組織和結(jié)直腸癌中均有陽性表達(dá)，主要分布在細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞漿，陽性信號(hào)為棕黃色顆粒染色，結(jié)直腸癌標(biāo)本組織中Syndecan-1陽性表達(dá)率僅為25.6%（41/160），低于正常黏膜的表達(dá)。Syndecan-1表達(dá)在患者不同年齡、性別、結(jié)直腸癌分化程度及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在腫瘤浸潤深度方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在一定程度上說明Syndecan-1的表達(dá)在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的過程中逐漸缺失。有關(guān)Syndecan-1與結(jié)直腸癌臨床預(yù)后的關(guān)系，有學(xué)者報(bào)道Syndecan-1表達(dá)陰性的結(jié)直腸腫瘤患者臨床預(yù)后較差，生存時(shí)間短[15]。因本研究未涉及到隨訪，以后將重點(diǎn)隨訪這些患者的生存時(shí)間來明確Syndecan-1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

在全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸攀升，其發(fā)病率居世界第3位[16]。結(jié)直腸癌的治療一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。隨著靶向治療藥物表皮生長因子受體（epidermal growth factorreceptor，EGFR）抑制劑西妥昔單抗（cetuximab）和帕尼單抗（panitumumab）的問世，目前結(jié)直腸癌的治療進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)指導(dǎo)下的靶向個(gè)體化治療時(shí)代。EGFR是Ⅰ型受體酪氨酸激酶，是原癌基因ErbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，在多種上皮來源的惡性腫瘤中過表達(dá)，當(dāng)其與配體結(jié)合時(shí)，通過激活酪氨酸蛋白激酶途徑，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長和遷移、腫瘤血管形成及抑制腫瘤細(xì)胞凋。Ras蛋白（包括KRAS和NRAS）過度表達(dá)是細(xì)胞增生的標(biāo)志，RAS基因是EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個(gè)重要的下游調(diào)控基因，其陽性表達(dá)是腫瘤發(fā)生的早期事件。KRAS可由基因突變、自身活化或在接受EGFR的信號(hào)后發(fā)生過表達(dá)，這種過表達(dá)被認(rèn)為是包括大腸癌在內(nèi)的很多上皮源性惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制[17]。研究顯示，西妥昔單抗治療的有效性受其下游基因RAS狀態(tài)的影響[18]。突變型的RAS基因無需EGFR接受信號(hào)，能夠自動(dòng)活化該通路并啟動(dòng)下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此只有野生型RAS基因的患者才對(duì)抗EGFR單克隆抗體的治療有效，而突變型的患者無效。國外文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR在結(jié)直腸癌組織中的陽性率為60%～75%[19]。本研究中，EGFR在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率為69.4%，與國外的研究結(jié)果相符。本研究同時(shí)分析了Syndecan-1的表達(dá)與EGFR表達(dá)及KRAS基因的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者中Syndecan-1的表達(dá)與EGFR表達(dá)顯著相關(guān)，而與KRAS基因是否突變無相關(guān)性。

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Expressions of Syndecan-1,EGFR and KRAS gene mutations in colorectal carcinoma

YUAN Shaofei,ZHU Linjia,ZHENG Wei'e,etal.Department of Medical Oncology,The Third Affiliated Hospital,Wenzhou Medical University,Rui'an 325200, China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of Syndecan-1,EGFR and KRAS gene mutations in colorectal carcinoma. Methods The expressions of Syndecan-1 and EGFR were detected by immunohistochemistry in surgical specimens of 160 patients with primary colorectal carcinoma treated between 2009 and 2014 at our Hospital.DNA sequencing was used to detect mutations in KRAS(codons12,13 of exon2).The relationship between Syndecan-1 expression and various clinicopathologicalparameters and molecular markers was analyzed.Results There were 156(97.5%)cases ofadenocarcinomas, and 4(2.5%)cases of other pathological types.Syndecan-1 expression was identified in 41(25.6%)colorectal cancer cases, among which 20 showed predominantly membranous immunopositivity,16 showed a predominantly cytoplasmic staining,and 5 showed mixed membranous and cytoplasmic staining.The positive rate of EGFR expression was 69.4%,and KRAS mutations rate was 37.5%in 160 colorectal cancer cases.The expression of Syndecan-1 was significantly correlated with EGFR expression (r=1.488,P＜0.01),however,it was not correlated with KRAS mutations(r=9.278,P＞0.05),lymph node metastasis and distant metastasis(P＞0.05). Conclusion The expression profile of Syndecan-1 may be of clinical value in colorectal cancer and may help in identifying aggressive forms of colorectal carcinoma.

Syndecan-1 EGFR KRAS Colorectal carcinoma

2015-12-14）

（本文編輯：馬雯娜）

325200 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤中心

朱林佳，E-mail：ysf1004@163.com