幾種定量線粒體DNA1555A＞G異質(zhì)性突變檢測方法

高慧沈姍姍劉晶晶王琳凱梁少明張阮章胡玉華郭輝林玉梅王沙燕

1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院（深圳518020）

2亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司（深圳518133）

·技術(shù)與方法·

幾種定量線粒體DNA1555A＞G異質(zhì)性突變檢測方法

高慧1沈姍姍1劉晶晶2王琳凱1梁少明2張阮章1胡玉華1郭輝1林玉梅1王沙燕1

1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院（深圳518020）

2亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司（深圳518133）

目的 利用TaqMan探針建立熔解曲線定量分析技術(shù)平臺(tái)，比較TaqMan探針熔解曲線技術(shù)、變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）及測序技術(shù)在檢測線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變負(fù)荷方面的差異。方法 建立TaqMan探針熔解曲線技術(shù)，分析氨基糖苷類藥物性耳聾家系及正常人群的線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變水平，并與前期實(shí)驗(yàn)中DHPLC技術(shù)及測序技術(shù)的檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。結(jié)果TaqMan探針熔解曲線技術(shù)成功分析50例樣本的線粒體DNA 1555A＞G突變水平，相比于Sanger測序技術(shù)多發(fā)現(xiàn)1例異質(zhì)性突變，但比DHPLC技術(shù)少發(fā)現(xiàn)3例異質(zhì)性突變。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)建立的TaqMan探針熔解曲線技術(shù)成功檢出19%至86%范圍內(nèi)的線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變水平，操作簡單，成本低。

線粒體DNA 1555A＞G；耳聾；TaqMan探針；熔解曲線；變性高效液相色譜分析技術(shù)

Fund:Supported by the Strategic Emerging Industry Development Fund of Shenzhen,No.CXZZ20130517143111780.

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

耳聾是人類常見的致殘性疾病，1993年P(guān)rezant等[1]首次發(fā)現(xiàn)藥物性耳聾與線粒體DNA 12S rRNA 1555A＞G突變密切相關(guān)，并認(rèn)為氨基糖苷類抗生素是藥物性耳聾的主要誘因。最初認(rèn)為線粒體相關(guān)的致聾基因以線粒體DNA同質(zhì)性突變的形式致病，然而1997年el-Schahawi等[2]首次提出線粒體DNA 12S rRNA 1555A＞G存在異質(zhì)性突變，2003年del Castillo等[3]認(rèn)為1555A＞G突變致聾的臨床表型與其突變負(fù)荷有關(guān)。當(dāng)突變負(fù)荷小于20%時(shí)，無臨床癥狀或表現(xiàn)為輕度耳聾。然而當(dāng)突變負(fù)荷大于52%時(shí)，可導(dǎo)致中到重度聽力殘疾。我們前期也通過檢測線粒體DNA 12S rRNA 1555A＞G異質(zhì)性突變一大家系，對線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變與耳聾臨床表型的相關(guān)分析進(jìn)行了同類報(bào)道[4]，明確了線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變水平與臨床表型及向下一代的突變傳遞量有關(guān)?？梢姸繖z測線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變水平有助于預(yù)測及分析藥物性耳聾的臨床表型。

目前，檢測1555A＞G異質(zhì)性突變方法主要報(bào)道限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）[2]、毛細(xì)管電泳[3]、變性高效液相色譜（Denaturing High Perfor?mance Liquid Chromatography,DHPLC）[4]、實(shí)時(shí)定量PCR[5]及SnaPshot[6]等技術(shù)。近年來，探針熔解曲線技術(shù)已逐步興起，現(xiàn)已用于各種臨床疾病的基因診斷[7,8]。其基于熒光PCR平臺(tái)，利用探針多色性及雙鏈DNA解鏈溫度（Tm）的差異，快速地完成基因突變的檢測及基因分型[9]。然而該技術(shù)對于異質(zhì)性突變的研究很少[10]，本研究擬利用TaqMan探針熔解曲線技術(shù)分析藥物性耳聾相關(guān)線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變水平，比較TaqMan探針熔解曲線技術(shù)、DHPLC及測序技術(shù)在檢測線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變負(fù)荷方面的差異。

1 探針熔解曲線定量技術(shù)的建立

1.1 構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

選擇優(yōu)化的PCR引物對線粒體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物送至上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司進(jìn)行克隆及構(gòu)建線粒體DNA nt1555(A/G)位置的突變型及野生型質(zhì)粒，并利用ABI 3130測序儀測序驗(yàn)證。將質(zhì)粒稀釋至工作濃度，利用相同濃度1555A＞G野生型與突變型質(zhì)粒，按不同體積比例構(gòu)建0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%十一個(gè)不同突變負(fù)荷的標(biāo)準(zhǔn)品備用。

1.2 PCR反應(yīng)及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)探針及引物設(shè)計(jì)的一般原則，利用prim?er5.0設(shè)計(jì)正向引物5’-AGTAGAGTGCTTAGTTGAA?CAGGGC-3’,反向引物5’-CCAAGTGCACTTTC?CAGTACACTTA-3’，擴(kuò)增155bp的線粒體DNA nt1441～1595基因片段（包含nt1555位點(diǎn)）。利用Oli?go7.0設(shè)計(jì)36bp的TaqMan探針5-ROX-CCCTACG?CATTTATATAGAGGAGACAAGTCGTAACAHQ1-3’（5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)）。反應(yīng)體系：1×buffer，3.0 mM MgCl2，0.2 mM dNTPs，上游引物0.04 μM，下游引物0.4 μM，TaqMan探針0.4 μM，2.5U Taq酶，20ng DNA（50000copies質(zhì)粒），加蒸餾水補(bǔ)至25μl。結(jié)合研究中Taq酶最適的延伸溫度，參考廈門致善生物科技有限公司“遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）”提供的反應(yīng)條件：（1）95℃預(yù)變性10min；95℃15s，65℃15s（每個(gè)循環(huán)降低1℃），74℃20s，10個(gè)循環(huán)；（2）95℃15s，55℃15s，74℃20s，50個(gè)循環(huán)；（3）95℃1min，40℃3min，45℃升逐漸升溫至85℃并每升高0.4℃收集ROX熒光。儀器選擇：SLAN-96S Real Time System（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取50000copies不同突變負(fù)荷的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品置于反應(yīng)體系中，按照優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，將獲得的熔解曲線作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件Scatter散點(diǎn)圖功能，分析標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線與突變負(fù)荷關(guān)系。根據(jù)散點(diǎn)圖的圖形分布做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并求出定量突變負(fù)荷的函數(shù)。

2 驗(yàn)證及對比分析

2.1 臨床樣本

已排除耳聾以外的其他疾病，遵循知情同意原則，選擇有異質(zhì)性突變的耳聾家系作為病例對照，共收集18例，均為本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文獻(xiàn)中的氨基糖苷類藥物性耳聾大家系成員[4]。按統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，隨機(jī)選擇聽力正常人群作為正常對照，共收集32例。利用EDTA-K2真空抗凝管采集2ml全血，選擇德國QIA?GEN公司的QIAamp DNA全血抽提試劑盒，按照提取步驟說明書提取全基因組DNA，置-20℃保存。

2.2 對比驗(yàn)證

選擇上述家系中不同突變負(fù)荷樣品18例及正常對照組32例，共50例。利用建立的TaqMan探針熔解曲線方法檢測50例樣本的1555A＞G異質(zhì)性突變水平，根據(jù)所建立的標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)，分析每個(gè)樣本的異質(zhì)性突變負(fù)荷。利用實(shí)驗(yàn)室前期建立的DHPLC分析技術(shù)定量正常對照樣本的線粒體DNA突變負(fù)荷[11]，并與TaqMan探針熔解曲線結(jié)果進(jìn)行對比分析。異質(zhì)性家系成員的TaqMan探針熔解曲線檢測結(jié)果直接與前期運(yùn)用DHPLC技術(shù)定量線粒體DNA突變負(fù)荷的結(jié)果[4]進(jìn)行分析對比。采用SPSS13.0軟件中P-P圖對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果選擇t檢驗(yàn)或者配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)分析TaqMan探針熔解曲線與DHPLC兩種技術(shù)所得結(jié)果有無差別，進(jìn)一步探討探針熔解曲線技術(shù)對基因異質(zhì)性突變水平檢測的靈敏度與特異性。選擇Sanger測序技術(shù)驗(yàn)證所有樣本是否存在1555A＞G突變。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線

熔解曲線分析可知，TaqMan探針與野生型質(zhì)粒模板完全匹配，雙鏈DNA具有較高的解鏈溫度，野生峰Tm值為72.5±1℃。突變型質(zhì)粒模板中nt1555處堿基由A突變?yōu)镚，TaqMan探針與模板匹配不完全，雙鏈DNA則具有較低的解鏈溫度，突變峰Tm值為69.5±1℃。十一種不同突變負(fù)荷的質(zhì)粒熔解曲線分析顯示，突變水平從0%到100%變化時(shí)，野生型峰高逐漸降低，突變型峰高逐漸升高，不同突變負(fù)荷的質(zhì)?？色@得形狀不同的熔解曲線圖（圖1）。對于10%水平的低異質(zhì)性突變，與0%突變負(fù)荷相比，其熔解曲線圖形在Tm=69.5℃處有較明顯的凸峰。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的TaqMan探針溶解曲線X軸：溫度；Y軸：-d(Rn)/dT(熒光變化值/溫度變化值)黑水粗線：0%至100%十一種突變負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)品各自的溶解曲線結(jié)果圖;彩色虛線1（0%至50%標(biāo)示圖）：標(biāo)示0%至50%突變負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)品的溶解曲線結(jié)果匯總圖;彩色虛線2（60%至100%標(biāo)示圖）：標(biāo)示60%至100%突變負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)品的溶解曲線結(jié)果匯總圖;Fig.1 X-axle represent Temperature,Y-axle represent the ratio of difference fluorescence and difference Temperature.Black solid curves show the TaqMan probe melting curve results of plasmid standards which include 0 to 100 percentage of mutant mtDNA1555A＞G copies. Colorful dotted curve as the background of pictures marked 0%to 50% simultaneously show the whole melting curve results of plasmid standards which include 0 to 50 percentage of mutant mtDNA 1555A＞G copies.Colorful dotted curve as the background of pictures marked 60% to 100%simultaneously show the whole melting curve results of plasmid standards which include 60 to 100 percentage of mutant mtDNA 1555A＞G copies

3.2 函數(shù)及相關(guān)性分析

多次實(shí)驗(yàn)顯示基因突變負(fù)荷從0%到100%變化時(shí)，野生型及突變型熔解曲線峰高隨著突變負(fù)荷變化而升降的趨勢基本一致。則選擇野生峰與突變峰的平均Tm（72.5℃與69.5℃）處，讀取每個(gè)樣本的兩處峰高（Y值）；采用野生型峰高與突變型峰高的比值（Y72.5℃/Y69.5℃），結(jié)合突變負(fù)荷做散點(diǎn)圖分析，探討高度比與突變負(fù)荷的關(guān)系。通過散點(diǎn)圖分析可知突變負(fù)荷與高度比存在明顯的曲線關(guān)系（圖2A）。利用SPSS13.0曲線擬合技術(shù)，可得最優(yōu)擬合曲線方程：Y=112.88-76.70x+19.50x2-1.85x3。曲線方程計(jì)算的突變負(fù)荷與理論突變負(fù)荷的相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)到0.999（圖2B）。可見該函數(shù)理論上可用于線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變負(fù)荷的計(jì)算。

圖2 曲線擬合及相關(guān)性分析Fig.2 Curve fitting and correlation analysis

3.3 臨床樣本分析及方法學(xué)比較

根據(jù)熔解曲線圖形中野生型峰高與突變型峰高的比值（x=Y72.5℃/Y69.5℃），利用標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)(Y= 112.88-76.70x+19.50x2-1.85x3)計(jì)算出各個(gè)樣本的突變負(fù)荷。選擇SPSS13.0軟件，比較分析TaqMan探針熔解曲線技術(shù)與DHPLC技術(shù)的檢測結(jié)果（表1）。P-P圖分析顯示突變負(fù)荷數(shù)據(jù)明顯不服從正太分布，則選擇配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)比較兩種檢測技術(shù)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示Z=-3.44，P= 0.001,可認(rèn)為兩種方法結(jié)果有差別。經(jīng)研究分析可知，TaqMan探針熔解曲線技術(shù)檢測突變負(fù)荷＜19%與＞86%的樣本時(shí)，與DHPLC技術(shù)結(jié)果差異較大。去除檢測值＜19%與＞86%的樣本后，再次進(jìn)行配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示Z=-0.68，P=0.499，其差異無顯著性意義。因此，在該范圍內(nèi)尚不能認(rèn)為兩種方法檢測線粒體DNA 1555A＞G結(jié)果有差別?？梢奣aqMan探針熔解曲線技術(shù)在檢測突變負(fù)荷為19%～86%的異質(zhì)性突變水平中具有一定的可信度（圖3）。將TaqMan探針熔解曲線技術(shù)檢測值＜19%判斷為正常，19%-86%判斷為異質(zhì)性突變，＞86%判斷為同質(zhì)突變。則32例正常人均無1555A＞G突變，18例耳聾家系成員檢測出2例無突變，7例異質(zhì)性突變和9例同質(zhì)性突變。Sanger測序技術(shù)結(jié)果顯示，在線粒體DNA 12S rRNA nt1555處可看見明顯A峰、G峰或A+G雜合峰，與TaqMan探針熔解曲線技術(shù)檢測結(jié)果相比，TaqMan探針熔解曲線技術(shù)能檢測出Sanger測序未發(fā)現(xiàn)的異質(zhì)性突變（II-3）（表1）。

圖3 異質(zhì)性突變檢測結(jié)果A:溶解曲線技術(shù)B:DHPLC技術(shù)C:測序技術(shù)Fig.3 Results of heteroplasmic Mutation.(A)TaqMan probe melting curve technology.(B)DHPLC method.(C)Sanger sequencing technology

異質(zhì)性突變的檢測至今無金標(biāo)準(zhǔn)，測序技術(shù)也只能檢測20%以上的異質(zhì)性突變水平，本文以DH?PLC技術(shù)作為參考，可獲得測序技術(shù)與TaqMan探針熔解曲線技術(shù)相對特異性與靈敏度（表2、表3）。

測序技術(shù)：異質(zhì)性突變檢出的相對特異性=40/ 40=100%

異質(zhì)性突變檢出的相對靈敏度=6/10=60%

TaqMan探針熔解曲線技術(shù)：異質(zhì)性突變檢出的相對特異性=40/40=100%

異質(zhì)性突變檢出的相對靈敏度=7/10=70%

4 討論

藥物性耳聾的臨床表型存在明顯的異質(zhì)性[12]，如受藥物影響程度多樣化、發(fā)病年齡多樣化、耳聾程度多樣化，其中線粒體DNA 12S rRNA 1555A＞G異質(zhì)性突變對臨床表型影響最為關(guān)鍵。del Castillo等[3]研究西班牙家系認(rèn)為1555A＞G突變負(fù)荷大于52%時(shí)可導(dǎo)致中到重度聽力殘疾，而我們在研究線粒體DNA 12S rRNA 1555A＞G異質(zhì)性突變家系中[4]，發(fā)現(xiàn)在50%突變負(fù)荷左右的耳聾家系成員中僅存在高頻聽力損失，高于70%可表現(xiàn)輕度、中度或重度耳聾，可見不同地區(qū)或人種的1555A＞G異質(zhì)性突變與臨床表型有所差異，其機(jī)理需要在更多的家系中進(jìn)一步研究。并且異質(zhì)性突變母親極有可能生下同質(zhì)性突變的子代[4,13]，導(dǎo)致子代產(chǎn)生更加嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)。然而1555A＞G異質(zhì)性突變檢測技術(shù)報(bào)道相對較少，并且低水平的異質(zhì)性突變更加難以檢測，測序技術(shù)報(bào)道只能檢測20%以上的異質(zhì)性突變水平[11]。2008年ballana等[14]利用DHPLC技術(shù)及焦磷酸測序技術(shù)能檢出低至5%的異質(zhì)性突變，但該方法需特殊儀器及操作復(fù)雜，難以在臨床普及。探針熔解曲線技術(shù)以省時(shí)、操作簡單等優(yōu)勢，已在臨床實(shí)驗(yàn)室用于野生型，突變型或雜合子等基因檢測，但精確定量異質(zhì)性突變研究相對較少[10]。本實(shí)驗(yàn)首次利用TaqMan探針建立熔解曲線技術(shù)平臺(tái)，成功分析出21.51%至85.84%范圍內(nèi)的7例1555A＞G異質(zhì)性突變，比Sanger測序技術(shù)多發(fā)現(xiàn)1例85.84%的突變。但與DHPLC技術(shù)相比，少發(fā)現(xiàn)3例異質(zhì)性突變，當(dāng)DHPLC及Sanger測序檢測為野生型時(shí)，熔解曲線標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)計(jì)算結(jié)果多為-3.75%～8.86%，并未檢出14.80%與11.50%異質(zhì)性突變。當(dāng)DHPLC及Sanger測序檢測為同質(zhì)性突變時(shí)，熔解曲線標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)計(jì)算結(jié)果多為93.06%～101.10%，DHPLC定量為97.9%的樣本檢測為91.40%。以DHPLC技術(shù)作為參考，測序技術(shù)檢出異質(zhì)性突變的相對靈敏度為60%，TaqMan探針熔解曲線技術(shù)檢出異質(zhì)性突變的相對靈敏度為70%?？梢?，本實(shí)驗(yàn)中建立的TaqMan探針熔解曲線技術(shù)不及DHPLC方法靈敏，對＜15%及＞90%的突變難以準(zhǔn)確定量，需進(jìn)一步對其檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，以提高其檢測的敏感性與準(zhǔn)確性。

表118 例藥物性耳聾家系成員檢測結(jié)果Table 1 The test results of 18 cases of drug-induced deafness family members

TaqMan探針熔解曲線技術(shù)分析線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變負(fù)荷主要受兩方面的影響。首先是探針設(shè)計(jì)，探針是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。結(jié)合實(shí)驗(yàn)，觀察異質(zhì)性突變水平從0%到100%變化時(shí)熔解曲線變化的趨勢，從而篩選出最優(yōu)探針。本實(shí)驗(yàn)選擇36bp的TaqMan探針，獲得的熔解曲線能較好的反映異質(zhì)性突變水平的變化（圖1）。其次是突變負(fù)荷的定量，根據(jù)樣品的熔解曲線圖形，可粗略地估算出樣本的突變水平，但要精確定量其突變負(fù)荷，則需采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)采用熔解曲線高度比與突變負(fù)荷作曲線擬合，成功分析19%至86%的異質(zhì)性突變水平。由于技術(shù)局限，本文并未深入探討熔解曲線面積比或面積與高度相結(jié)合分析突變負(fù)荷的情況。此外，本實(shí)驗(yàn)研究的異質(zhì)性突變樣本量較少，結(jié)果也許會(huì)存在偏倚，所以TaqMan探針熔解曲線技術(shù)精確定量突變負(fù)荷仍期待增加樣品數(shù)量進(jìn)一步探討。TaqMan探針熔解曲線技術(shù)對樣本要求不高。在進(jìn)行定量線粒體DNA 1555A＞G異質(zhì)性突變負(fù)荷時(shí)，利用全基因組DNA作為模板與利用mtDNA Ex?tractor WB Kit提取的線粒體DNA作為模板所獲得的分析結(jié)果并無顯著差別。雖然，本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)提示TaqMan探針熔解曲線技術(shù)靈敏度不及DHPLC技術(shù)，但比Sanger測序技術(shù)多發(fā)現(xiàn)1例異質(zhì)性突變，并且操作簡單，成本相對較低，更加便于在臨床實(shí)施。

表2 測序技術(shù)與DHPLC技術(shù)結(jié)果對比分析Table 2 Compare the results of Sanger sequencing technology and DHPLC method

表3 TaqMan探針熔解曲線技術(shù)與DHPLC技術(shù)結(jié)果對比分析Table 3 Compare the results of TaqMan probe melting curve technology and DHPLC method

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Melting curve quantitative technology in quantification of mitochondrial DNA 1555A＞G heteroplasmic mutation

GAO Hui1,SHEN Shanshan1,LIU Jingjing2,WANG Linkai1,LIANG Shaoming2,ZHANG Ruanzhang1, HU Yuhua1,GUO Hui1,LIN Yumei1,WANG Shayan1
1 Second Clinical medical college of Jinan University,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518020,China
2 Yaneng Bioscience(Shenzhen)Co.ltd.,Shenzhen 518133,China

Objective The melting curve quantitative technology was established using the TaqMan probe and compared with DHPLC and Sanger sequencing technologies in detecting mtDNA 1555A＞G heteroplasmic mutation.Methods TaqMan probe melting curve technology was used to test aminoglycoside-induced hearing loss families and normal individuals.The results were compared with our previous results using DHPLC and Sanger sequencing technologies.Results The level of mutant mtDNA 1555A＞G was detected by TaqMan probe melting curve technology successfully in 50 samples, identifying one more case than Sanger sequencing,but three less than DHPLC.Conclusions The quantity of mutant mtDNA 1555A＞G copies ranging from 19%to 86%was accurately detected by the TaqMan probe melting curve technology used in this experiment.

mtDNA1555A＞G;hearing loss;Taq Man probe;Melting Curve Analysis;DHPLC.

R764.1

A

1672-2922（2016）05-686-6

2015-10-30審核人：翟所強(qiáng)）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.05.026

2013年深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金（CXZZ20130517143111780）

高慧，研究生，研究方向:醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)

王沙燕，Email:shayanw@yahoo.com