CO2與Er:YAG激光乳突切開及周圍骨組織損傷研究

王曉燕鄭燕青鄭昊葉青

1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉科（福州350001）

2泉州市婦幼保健院.兒童醫(yī)院（泉州362000）

·基礎(chǔ)研究·

CO2與Er:YAG激光乳突切開及周圍骨組織損傷研究

王曉燕1鄭燕青2鄭昊1葉青1

1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉科（福州350001）

2泉州市婦幼保健院.兒童醫(yī)院（泉州362000）

目的以CO2激光與Er:YAG激光為輻射源，活體新西蘭兔中耳骨作為靶組織，行激光消融乳突切開術(shù)，研究激光骨消融后對周圍骨組織的影響，并與電鉆磨骨術(shù)比較，初步評估激光乳突切開的可行性及其安全性，進(jìn)一步拓展激光在耳科手術(shù)中的應(yīng)用。方法24只新西蘭兔隨機(jī)分三組，分別采用電鉆、CO2激光、Er:YAG激光為手術(shù)工具，研磨或消融中耳乳突骨，術(shù)后取磨骨或骨消融部位周邊骨組織，掃描電鏡觀察消融骨組織表面形態(tài)特征，制作石蠟切片HE染色觀察對比骨組織細(xì)胞變化情況，測量骨組織損傷深度，比較用此三種工具手術(shù)后對周圍骨組織的影響。結(jié)果掃描電鏡觀察消融骨組織表面可見膠原成網(wǎng)狀熔合及部分微裂縫改變；石蠟切片HE染色：磨骨或消融部位周邊骨組織均見不同程度損傷改變，其中電鉆組損傷最輕；中耳骨消融后的周邊骨組織損傷深度存在組間差別（P＜0.01），電鉆組損傷深度最?。≒＜0.01）,兩激光組之間無顯著差別（P＞0.05）。消融骨組織周邊不同部位損傷深度之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論激光骨消融乳突切開術(shù)具有可行性，激光消融骨組織后對周圍骨組織的損傷程度大于電鉆組，需要進(jìn)一步研究評估并改進(jìn)激光操作方式來提高手術(shù)視野清晰度、精準(zhǔn)度以及安全性等。

中耳；激光；骨消融；損傷；乳突切開

Foundation：National Natural Science Foundation of China（61475036）；Project of Natural Science Foundation of Fujian Province（2011J01135）；Clinical Specialty Construction Project of Fujian Province.

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

隨著科學(xué)技術(shù)進(jìn)步，醫(yī)療水平的提高，不斷有新手術(shù)器具應(yīng)用于耳外科手術(shù)中。近年，激光技術(shù)的發(fā)展為耳科手術(shù)提供了又一有效工具，在耳科手術(shù)中激光骨消融主要用于激光鐙骨切除術(shù)或鐙骨足板造孔術(shù)[1-3]，激光耳蝸開窗亦有研究[4]，它不僅提供了凝固炭化、切割、氣化等多種不同的手術(shù)方式，而且可以減少失血量，更為精確地切除不想保留的組織，具有較短的手術(shù)時(shí)間，術(shù)后并發(fā)癥像耳鳴、眩暈、聽力喪失、眼震顫等大大減少，術(shù)后疼痛亦減輕，充分體現(xiàn)了其優(yōu)點(diǎn)所在。

在耳科手術(shù)中以乳突切開為最常見術(shù)式，目前常用手術(shù)工具為電鉆，但電鉆存在高噪音、鉆頭易損耗、操作不當(dāng)致周圍組織嚴(yán)重?fù)p傷等缺點(diǎn)，那激光是否可以作為乳突切開手術(shù)之一？在此選用了國內(nèi)外骨消融中常用的兩種激光——裝有掃描技術(shù)的脈沖CO2激光與脈沖Er:YAG激光為輻射源，活體新西蘭兔中耳骨為靶組織，活體兔上初步模擬乳突切開術(shù)，而后研究激光骨消融后周圍骨組織損傷情況，并與傳統(tǒng)電鉆磨骨術(shù)進(jìn)行比較，研究激光乳突骨消融切開術(shù)的可行性并初步評判其安全性，以期進(jìn)一步拓展激光在耳科手術(shù)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要儀器

選取健康雄性成年新西蘭兔24只，質(zhì)量為2.0 kg-2.5 kg，實(shí)驗(yàn)動物均由福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供。主要使用設(shè)備：以色列Sharplan 30C CO2激光外科系統(tǒng)、Sharplan Acuspot微控制器、Sharplan SurgiTouchTM 773 flashscanner掃描系統(tǒng)，美國Sciton公司Contour Profile 2940 Er:YAG激光治療儀，德國Leica M520外科手術(shù)顯微鏡，瑞士Nou?vag MD20微動力系統(tǒng)（手術(shù)電鉆、電鋸），日本JSM-6380LV掃描電鏡。

1.2 電鉆及激光中耳乳突切開模型的建立

分別測得CO2激光器及Er:YAG激光器激光束射出后經(jīng)不同裝置后光斑尺寸隨工作距離的變化關(guān)系，并結(jié)合操作方便性，確定光斑尺寸，找出激光對應(yīng)的工作距離（表1）。根據(jù)激光器說明書推薦劑量及前期離體人乳突骨激光消融操作情況[5]，確定激光器參數(shù)（表2）。

將符合上述條件24只隨機(jī)分成A、B、C三組，每組各8只，均以右耳為實(shí)驗(yàn)耳。A組（電鉆組），B組（CO2激光組），C組（Er:YAG激光組），分別用以上三種工具手術(shù)。動物麻醉、固定、體位擺放、解剖至暴露乳突[6]。然后分別通過三種方式打開鼓泡暴露中耳腔：電鉆組：使用電鉆打開鼓泡暴露中耳腔，磨開乳突大小應(yīng)約為10mm X 5mm孔，深部暴露中耳腔孔的大小約為5mm X 3mm（圖1）。CO2激光組：將CO2激光器通過Acuspot微控制器耦合到手術(shù)顯微鏡（Leica M520）上，激光器連接flashscanner掃描裝置（掃描系數(shù)設(shè)為：0.05），按照Acuspot微控制器說明書將耦合器散焦設(shè)為“3”，調(diào)整工作距離光斑大?。ū?）。然后開啟激光器，指示燈定位于暴露的乳突骨中央，設(shè)定激光器參數(shù)（表2），手控Acuspot微控制器操縱桿顯微鏡下操作，消融乳突骨至暴露中耳腔，消融骨的大小同電鉆組相近。Er:YAG激光組：連接2mm手柄，開啟激光器，指示燈定位于暴露的乳突骨中央，設(shè)定激光器參數(shù)（表2），手持手柄顯微鏡下非接觸操作，工作距離約40-60mm（表1），激光消融乳突骨至暴露中耳腔，消融骨的大小同前兩組相近。

表1 光斑大小、工作距離確定Table 1 Light spot size and working distance

表2 激光器參數(shù)設(shè)置及激光劑量的確定Table 2 Laser parameter setting and laser dose determination

術(shù)后6小時(shí)活體取下消融或研磨部位周圍骨組織（圖1），置于10%EDTA液中脫鈣處理，常規(guī)制作石蠟切片，HE染色；同時(shí)留取激光消融部位骨組織樣本放入2.5%戊二醛溶液中，采用1%鋨酸溶液固定，丙酮脫水，冷凍干燥儀干燥制備標(biāo)本、離子濺射鍍膜，掃描電鏡觀察激光消融骨組織表面超微結(jié)構(gòu)的變化。

圖1 中耳乳突切開暴露中耳腔，箭頭示用于制作組織切片所取骨組織部位Fig.1 Fenestration of mastoid bone; Arrow shows sampling sites

1.3 觀察及測量指標(biāo)

1.3.1 掃描電鏡觀察激光消融骨組織表面超微結(jié)構(gòu)的變化，并拍照。

1.3.2 光學(xué)顯微鏡觀察骨組織HE染色切片，連接顯微照相機(jī)照相，研究比較電鉆、激光對周邊骨組織損傷所致細(xì)胞形態(tài)等改變。光學(xué)顯微鏡下確定骨組織損傷邊界，連接顯微照相機(jī)，用Olympus DP2-BSW分析軟件測量消融骨周邊骨組織損傷深度。測量方法：對組織切片中較不規(guī)則的骨組織斷面取6處位置進(jìn)行測量、記錄（圖2）。

圖2 A骨組織切片測量實(shí)物圖Fig.2 A Measuring physical map in bone tissue section

圖2 a骨組織切片測量示意圖Fig.2 a Measuring diagram in bone tissue section

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡觀察

可見兩激光消融骨組織表面膠原成網(wǎng)狀熔合，可有一些散在骨屑，部分微裂縫改變（圖3）。

圖3 A:CO2激光消融骨組織表面掃描電鏡像，SEM×200；Fig.3 A Surface scanning electric image of bone tissue after CO2laser ablationSEM×200；

圖3 B Er:YAG激光消融骨組織表面掃描電鏡像,SEM×200Fig.3 A Surface scanning electric image of bone tissue after Er: YAGlaser ablationSEM×200

2.2 周邊骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變

電鉆組：僅磨骨邊緣極小損傷，骨細(xì)胞形態(tài)基本正常（圖4 A,a）。CO2與Er:YAG激光組：兩種激光消融周邊骨組織可見細(xì)胞不同程度的損傷，越接近消融部位細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，HE染色可見一較明顯因骨組織損傷導(dǎo)致的“藍(lán)化帶”。消融邊緣可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞變形、核消失、空泡變性等改變，再遠(yuǎn)處可見核邊移，遠(yuǎn)離消融部位可見較正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在消融過程中遇含骨髓骨質(zhì)時(shí)還可導(dǎo)致骨髓發(fā)生“氣穴現(xiàn)象”，脂肪細(xì)胞發(fā)生融合改變。（圖4B,b為CO2消融周邊骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；圖4C,c；Er:YAG激光消融周邊骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；“箭頭”示損傷“藍(lán)化帶”）。

圖4 中耳乳突骨部位開窗處周邊骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變(組織切片HE染色)Fig.4 Bone tissue morphologic characteristics after fenestration（tissue slicing and HE staining）

2.3 周邊骨組織損傷深度

三組不同手術(shù)工具致開窗處周邊骨組織損傷深度（整體均數(shù)之間的比較）存在組間差別（P＜0.01），電鉆組損傷深度最?。≒＜0.01）,兩激光組之間無顯著差別（P＞0.05）。不同部位（圖1）損傷深度之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3，圖5）。

圖5 開窗處周邊不同部位（圖1）骨組織損傷深度（±sd表示）Fig.5 The depth of bone tissue damages in different site after fenestration（±sd）

3 討論

高能量密度的激光主要使組織發(fā)生氣化、凝固、碳化等改變，能量密度稍低時(shí)主要產(chǎn)生凝固、碳化作用，當(dāng)達(dá)到足夠高能量密度時(shí)則可使組織發(fā)生氣化、熔融、噴射和高溫分解等現(xiàn)象，所有這些都將導(dǎo)致生物組織的去除和丟失[5]。激光產(chǎn)生這些作用的同時(shí)也可因激光熱效應(yīng)、壓力效應(yīng)等對周圍組織產(chǎn)生損傷。對組織結(jié)構(gòu)的熱負(fù)荷，超過56℃會引起蛋白質(zhì)凝固，這種熱負(fù)荷的大小與應(yīng)用持續(xù)時(shí)間、能量轉(zhuǎn)移的量及能量穿透深度有關(guān)。而極低能量密度的激光對周圍組織則不會造成損傷，臨床上應(yīng)用低劑量激光療法（low-level laser therapy LLLT）促進(jìn)創(chuàng)傷愈合[7]、治療疼痛[8]，以及現(xiàn)在較熱門的研究——光動力學(xué)療法（photodynamic therapy PDT）[9]等。除能量密度外，對組織作用的激光因其他參數(shù)（波長、脈沖持續(xù)時(shí)間及輸出方式等）、操作方式、以及組織成分等不同組織效應(yīng)也不一樣。本次實(shí)驗(yàn)選用的CO2激光（波長10.6μm）和Er:YAG激光（波長2.94μm），在我們選用的參數(shù)和光劑量情況下都可以對中耳骨進(jìn)行有效消融，可在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行乳突切開。通過掃描電鏡觀察激光消融后骨組織表面，發(fā)現(xiàn)兩激光消融骨組織表面膠原成網(wǎng)狀熔合，可有一些散在骨屑，部分微裂縫改變，這些表明激光消融后周圍骨組織可能存在較明顯的損傷。經(jīng)過脫鈣后，行組織切片HE染色結(jié)果顯示：兩種激光可引起周邊骨組織明顯熱損傷，損傷程度遠(yuǎn)比電鉆組重，在含骨髓多的組織中形成“氣穴”改變，與Ivanenko等[10]應(yīng)用調(diào)Q CO2激光對豬肋骨消融在松質(zhì)骨中改變類似。盡管電鉆對周邊骨組織也有極小損傷（這主要與電鉆機(jī)械損傷有關(guān)，可能與磨骨過程使局部溫度稍增高也有一定關(guān)系），但其骨細(xì)胞形態(tài)正常，因此這種損傷意義不大幾乎可以忽略，尤其在配合沖水的情況下。

在本研究中，激光開窗處周邊骨組織損傷深度明顯大于電鉆組，但兩激光間損傷深度并無顯著差別，開窗周圍不同部位（圖1）損傷深度亦無明顯差異，盡管激光類型、參數(shù)設(shè)置及開窗周邊部位不同，但激光消融后骨組織損傷情況卻類似。因此可以推測激光在有效骨消融情況下其周圍骨組織累積損傷可能存在一限度——即激光造成周邊骨的累積損傷達(dá)到一定限度時(shí)損傷急速衰減。設(shè)想目前臨床上可以應(yīng)用激光快速進(jìn)行乳突骨部分切除后，在接近重要結(jié)構(gòu)時(shí)更換為傳統(tǒng)電鉆磨骨，兩工具聯(lián)合進(jìn)行乳突切開或輪廓化將是一可行的手術(shù)方式，這需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

表3 開窗處周邊不同部位骨組織損傷深度（n=8）（um）Table 3 The depth of bone tissue damages in different site after fenestration（n=8）（um）

4 結(jié)論

此次研究中，激光大面中耳骨消融具有可行性，可為臨床上乳突骨切開術(shù)提供另一有效工具，但激光消融后周圍骨組織的損傷深度及程度較電鉆明顯，其精確度有待提高，因此臨床實(shí)際應(yīng)用中在接近腦組織及重要血管及結(jié)構(gòu)時(shí)，激光的使用應(yīng)保持一安全界限，此安全范圍需進(jìn)一步確定，此外激光大面積骨消融操作的方式需進(jìn)一步優(yōu)化，如果選擇反饋系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)控制，并在消融過程中增加相應(yīng)降溫措施，如激光消融配上沖水裝置[11]，則可能得到高的消融精確度。

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CO2and Er:YAG laser mastoidotomy and its effects on surrounding middle ear bone tissue

WANG Xiaoyan1，ZHENG Yanqing2，ZHENG Hao1，YE Qing1
1 Department of Otolaryngology,Provincial Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001,Fujian,China
2 Quanzhou Women and Children’s Hospital，Quanzhou 362000，F(xiàn)ujian,China

Objective To study the effects of CO2and Er:YAG laser bone ablation on surrounding bone tissue using a New Zealand Rabbit middle ear model to determine the feasibility and safety of laser mastoidotomy in ear surgery.Methods Twenty-four New Zealand Rabbits were randomly divided into three groups to undergo in-vivo mastoid bone ablation by the means of drilling,CO2laser or Er:YAG laser.Specimens of the ablation crater were examined by scanning electron microscopy.HE staining was used to assess thermal damage in the surrounding bone tissue.Results Collagen fusion and cracks were seen on scanning electron microscopy on the surface of the crater bone.Laser bone ablation caused more damage to surrounding bone tissue than bone cutting by drilling(P＜0.01),but there was no significant difference between the two laser groups(P＞0.05)or between different sampling locations(P＞0.05).Conclusions The two laser systems could ablate the bone rapidly in mastoidotomy operations,although they can cause more damage to surrounding bone tissue than traditional drilling.Further study is needed for optimization of laser techniques for large bone ablation.

Middle ear；Laser；Bone ablation；Damage；Mastoidotomy.

R764.9

A

1672-2922（2016）05-665-5

2016-03-25審核人：王國建）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.05.022

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（61475036）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011J01135）；福建省臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目（閩衛(wèi)醫(yī)政【2015】593號）

王曉燕，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向:耳鼻咽喉臨床及激光臨床應(yīng)用

葉青，Email:1158113213@qq.com