P選擇素為靶標(biāo)的MRI在大鼠急性胰腺炎病情輕重分級(jí)中的應(yīng)用

田冰 劉日 陳士躍 劉芳 賈國(guó)榮 李晶 陳錄廣 王莉 陸建平

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·論著·

P選擇素為靶標(biāo)的MRI在大鼠急性胰腺炎病情輕重分級(jí)中的應(yīng)用

田冰 劉日 陳士躍 劉芳 賈國(guó)榮 李晶 陳錄廣 王莉 陸建平

目的 探討P選擇素為靶標(biāo)的磁共振靶向?qū)Ρ葎?P-Gd-probe)在大鼠急性胰腺炎(AP)病情輕重分級(jí)中的應(yīng)用。方法 采用腹腔注射L-精氨酸溶液(100mg/100g體重)3次、間隔1h的方法制備SD大鼠AP模型，對(duì)照組注射等容積生理鹽水，依照病理結(jié)果將AP大鼠分為急性水腫性胰腺炎(AEP，造模后6、12h)組及急性壞死性胰腺炎(ANP，造模后24、48h)組。造模6、12、24、48h大鼠及對(duì)照組大鼠行磁共振T1加權(quán)橫斷位平掃及增強(qiáng)掃描，對(duì)比劑采用P-Gd-probe。測(cè)量增強(qiáng)前后胰腺部位的信號(hào)聲噪比(SNR)。掃描完成后取胰腺組織行病理學(xué)檢查，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胰腺組織P選擇素表達(dá)。結(jié)果 造模6h后胰腺組織出現(xiàn)炎癥改變，且炎性程度隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而加重，胰腺組織P選擇素蛋白表達(dá)也隨AP的炎性程度加重而增高。對(duì)照組增強(qiáng)前后胰腺組織SNR值基本不變；AEP組增強(qiáng)前后SNR值分別為17.22±1.35、37.38±1.66，ANP組分別為16.29±1.39、58.18±1.03，這兩組增強(qiáng)后的SNR值均顯著高于增強(qiáng)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為-49.59、-86.09，P值均<0.001)。結(jié)論MRI時(shí)選擇P選擇素為靶標(biāo)的單克隆抗體靶向?qū)Ρ葎┯兄趯?duì)AP病情嚴(yán)重程度的判斷。

胰腺炎，急性壞死性；P選擇素； 靶向?qū)Ρ葎?磁共振成像

Fund program: National Natural Science Foundation of China(81300366)

急性胰腺炎(AP)是胰酶消化自身及周圍組織所引起的炎癥反應(yīng)。輕癥急性胰腺炎(MAP)具有自限性，但20%～30%可以發(fā)展成為重癥急性胰腺炎(SAP)，SAP病情兇險(xiǎn)，預(yù)后較差。因此，及早診斷、分型和評(píng)估對(duì)掌握AP的進(jìn)展、及時(shí)有效干預(yù)治療及判斷預(yù)后尤為重要。目前的臨床診斷及評(píng)分系統(tǒng)都存在一定的局限性，如何準(zhǔn)確、客觀、簡(jiǎn)易地判斷AP的病情輕重成為臨床亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題?；赑選擇素在AP時(shí)表達(dá)增高，且在MAP與SAP中表達(dá)具有差異的特征[1]，本研究構(gòu)建以P選擇素為靶標(biāo)的單克隆抗體磁共振成像(MRI)靶向?qū)Ρ葎?，并?duì)AP大鼠行MRI，觀察P選擇素的表達(dá)，探討其在判斷AP病情嚴(yán)重程度中的應(yīng)用價(jià)值。

材料與方法

一、大鼠AP模型制作

25只雄性SD大鼠，體重250～300 g，按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組及AP 6、12、24、48 h組，每組5只。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，自由飲水。用生理鹽水配制濃度為20%的L-精氨酸溶液。以腹腔注射L-精氨酸溶液100 mg/100 g體重3次、間隔1 h的方法制備AP模型。對(duì)照組同法注射等容積生理鹽水。3次注射完成后，給予大鼠正常食物和水[2]。

二、P選擇素為靶標(biāo)的磁共振對(duì)比劑(P-Gd-probe)的制備

精密稱取14 mg的磷脂材料DSPE-PEG-COOH和2 mg的Gd造影材料Gd-DTPA-SA，應(yīng)用甲醇充分溶解后倒入燒瓶中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h，加入1 ml蒸餾水超聲充分溶解剩余產(chǎn)物，通過(guò)納米級(jí)薄膜擠壓20次，形成載Gd-DTPA的MRI探針(Gd-probe)。向該探針溶液加入100 mg的P選擇素單克隆抗體以及50 μg的二氯乙烷，混合后透析除去游離分子，最終獲得P選擇素單克隆抗體修飾的MRI探針(P-Gd-probe)。

三、在體MRI掃描

MRI掃描采用Siemens 3.0T磁共振成像儀(Skyra, Siemens medical solution, Erlangen, Germany)。 AP組分別于造模后6、12、24、48 h時(shí)間點(diǎn)通過(guò)小動(dòng)物氣麻機(jī)麻醉大鼠，固定于MRI手臂線圈中，采用T1加權(quán)快速自旋回波序列(T1weighted image Turbo Spin Echo, T1WI TSE)進(jìn)行掃描，獲取T1WI的橫斷面圖像。成像參數(shù)：重復(fù)時(shí)間(TR) 460 ms，回波時(shí)間(TE) 12 ms，視野68 mm×80 mm，矩陣216×256，層厚1 mm，層間距0，回波鏈長(zhǎng)度3，層數(shù)20，平均數(shù)6，掃描時(shí)間(TA)6∶40。T1WI平掃結(jié)束后經(jīng)尾靜脈注射P-Gd-probe靶向?qū)Ρ葎?Gd劑量為0.1 mmol/kg體重)，注射完成后采用上述T1加權(quán)序列獲取增強(qiáng)后圖像。掃描結(jié)束后測(cè)量增強(qiáng)前后T1WI序列胰腺部位的信號(hào)聲噪比(signal noise ratio, SNR)。

四、胰腺組織病理學(xué)檢查及P選擇素表達(dá)檢測(cè)

MRI掃描結(jié)束后立即處死大鼠，迅速取出胰腺腺體以甲醛溶液固定，常規(guī)行組織病理學(xué)檢查，由病理科醫(yī)師盲法讀片，并參考Schmidi等[3]的方法從水腫、腺泡壞死、出血、脂肪壞死、炎癥及血管周圍浸潤(rùn)等方面進(jìn)行病理評(píng)分。同時(shí)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)胰腺組織P選擇素蛋白表達(dá)。

結(jié) 果

一、各組大鼠胰腺組織病理改變及P選擇素表達(dá)變化

對(duì)照組大鼠胰腺組織無(wú)明顯病理?yè)p傷(圖1A)；AP 6 、12 h組大鼠胰腺組織充血、間質(zhì)水腫、少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，少量散在的出血壞死灶，呈現(xiàn)急性水腫性胰腺炎(acute edematou pancveatitis, AEP，即MAP)改變(圖1B、1C)；24、48 h組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)破壞、大片出血壞死灶、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，呈現(xiàn)急性壞死性胰腺炎(acute necratizing pancreatitis, ANP，即SAP)改變(圖1D、1E)。依照病理檢測(cè)結(jié)果將大鼠分為對(duì)照組、AEP組及ANP組。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，ANP組大鼠胰腺組織P選擇素蛋白高表達(dá)，AEP組大鼠胰腺組織低表達(dá)，對(duì)照組大鼠胰腺組織未見(jiàn)表達(dá)(圖1F、1G、1H、1I、1J)。

二、各組大鼠胰腺M(fèi)RI圖像的SNR值

對(duì)照組大鼠MRI掃描增強(qiáng)前后胰腺組織的SNR值分別為17.16±0.68、18.18±0.56，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.72，P=0.06)；AEP組增強(qiáng)前后SNR值分別為17.22±1.35、37.38±1.66，ANP組分別為16.29±1.39、58.18±1.03，這兩組增強(qiáng)后的SNR值均顯著高于增強(qiáng)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為-49.59、-86.09，P值均<0.001，圖2)，且ANP組的增加較AEP組更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.94;P<0.001)。

圖1 對(duì)照組、AEP組、ANP組大鼠胰腺組織病理改變(1A、1B、1C、1D、1E，HE×200)及P選擇素蛋白表達(dá)(1F、1G、1H、1I、1J，免疫組織化學(xué)×200)

圖2 對(duì)照組、AEP組、ANP組磁共振增強(qiáng)前(2A、2B、2C)及增強(qiáng)后(2D、2E、2F)T1WI橫斷位圖

AP是指多種病因引起的胰酶激活，以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征，伴或不伴有其他器官功能改變的疾病，臨床上包括MAP和SAP。SAP病情兇險(xiǎn)，病死率高，病程中常伴發(fā)肝、腎等胰外器官的損害[4]。早期發(fā)現(xiàn)疾病重癥趨勢(shì)能夠指導(dǎo)臨床醫(yī)師在一定的時(shí)間窗內(nèi)采取更積極的干預(yù)措施，從而減輕不良后果[5]。雖然臨床上有APACHEⅡ評(píng)分、Ranson評(píng)分、Balthazar CT分級(jí)[6]等多個(gè)客觀評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)和反映胰腺病理形態(tài)學(xué)改變的影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，但幾種評(píng)分系統(tǒng)的側(cè)重點(diǎn)及測(cè)評(píng)時(shí)間不同，單獨(dú)應(yīng)用都不可避免存在片面性，因此需要一種簡(jiǎn)單、方便的方法對(duì)AP進(jìn)行早期診斷及預(yù)后判斷。

AP的發(fā)生、發(fā)展不完全取決于胰酶的消化，也與胰腺微循環(huán)障礙及炎癥遞質(zhì)造成的多器官損害有關(guān)。研究表明胰腺血液循環(huán)障礙可以誘發(fā)AP和促使水腫性胰腺炎發(fā)展成為出血壞死性胰腺炎[7]。P選擇素存在于血小板α顆粒和血管內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade小體，為具有特異性的血小板活化標(biāo)志物，是血小板活化和釋放功能最直接、最敏感的指標(biāo)。生理情況下P選擇素表達(dá)很低，在凝血酶、白三烯、TNF-α等炎癥因子及炎癥遞質(zhì)的激活下，P選擇素迅速在活化的內(nèi)皮細(xì)胞和血小板表面表達(dá)，其作用是促進(jìn)細(xì)胞之間的連接，在調(diào)節(jié)紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用和血小板活化中起著重要的作用[8]。有研究結(jié)果[9]顯示，MAP患者血小板僅輕度活化，而SAP患者血小板處于高度活化狀態(tài)，血小板活化程度與AP患者病情輕重程度密切相關(guān)，提示監(jiān)測(cè)血漿P選擇素含量有助于對(duì)AP患者病情輕重的判別。

MRI是一種完全無(wú)創(chuàng)的影像學(xué)診斷方法，在此基礎(chǔ)上，基于細(xì)胞與分子水平的MRI靶向成像已經(jīng)成為分子影像學(xué)的研究熱點(diǎn)[10]。利用單克隆抗體進(jìn)行活體成像是MRI的重要方法之一，單克隆型MRI對(duì)比劑是將單克隆抗體與MRI順磁性或超順磁性粒子結(jié)合，新形成的螯合物既具有靶向特異性又具有MRI對(duì)比劑的作用，其不僅能夠與某些器官、組織及病灶靶特異性結(jié)合，而且能夠增強(qiáng)其MRI信號(hào)強(qiáng)度，從而達(dá)到靶向診斷的目的。Gd-DTPA是一種順磁性T1WI陽(yáng)性對(duì)比劑，具有親水性、分子量小的特點(diǎn)，注入血管后迅速向周圍組織間隙分布，由腎臟排泄，即使腎功能有損害，它也能經(jīng)腎排除，是目前應(yīng)用最廣泛的MRI對(duì)比劑。Gd-DTPA不具有組織或器官的選擇性，故如果要作為靶向的對(duì)比劑，即需要連接特異性的抗體。

本研究基于P選擇素在AP中表達(dá)增高且在MAP與SAP中表達(dá)具有差異的特點(diǎn)，構(gòu)建以P選擇素為靶標(biāo)的單克隆抗體磁共振靶向?qū)Ρ葎?，并進(jìn)行大鼠AP模型活體MRI觀察。研究結(jié)果表明，靶向?qū)Ρ葎㏄-Gd-probe增強(qiáng)前后對(duì)照組、AEP組及ANP組胰腺組織的SNR的變化具有顯著差異。因此，MRI時(shí)選用P選擇素為靶標(biāo)的單克隆抗體磁共振靶向?qū)Ρ葎┛蓞^(qū)分AEP與ANP，有助于AP病情嚴(yán)重程度的判斷。

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(本文編輯：呂芳萍)

MRI molecular imaging targeting P selectin in severity grading of acute pancreatitis in rats

TianBing,LiuRi,ChenShiyue,LiuFang,JiaGuorong,LiJing,ChenLuguang,WangLi,LuJianping.

DepartmentofRadiology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LuJianping,Email:cjr.lujianping@vip.163.com

Objective To investigate the application of MRI targeting contrast agent (P-Gd-Probe) for P selectin in evaluating the severity grades of acute pancreatitis(AP). Methods L-arginine solution (100mg/100kg) were intraperitoneally injected for 3 times once an hour to establish AP model in SD rats. Control group was injected with normal saline in a equal volume. All rats were divided into acute edematous pancreatitis (AEP) group (6 h and 12 h after model establishment)and acute necrotizing pancreatitis (ANP) group (24 h and 48 h after model establishment) based on the pathology. The rats were examined by T1WI plain and enhanced scanning at 6 h, 12 h, 24 h and 48 h after injection, and P-Gd-probe was as the enhanced contrast agent. The signal noise ratio (SNR) of the pancreas were measured before and after enhancement. Then the pancreas tissues were harvested for pathological examination and P selectin expression in pancreatic tissue was detected using immunohistochemical analysis. Results Inflammation was observed in pancreatic tissue at 6h after establishment, and became more serious as the modeling time extended. P selectin expression was increased as pancreatitis inflammation became more serious. The SNR of control group was stable before and after enhancement. The SNR before and after enhancement was 17.22±1.35 and 37.38±1.66 in AEP group,and 16.29±1.39 and 58.18±1.03 in ANP group. The SNR after enhancement was higher than that before enhancement, and the differences were significantly different (t=-49.59 and -86.09,P<0.001). Conclusions Monoclonal antibody MRI contrast agent targeting P selectin is helpful in evaluating the severity of AP.

Pancreatitis, acute necrotizing; P-selection; Targeted contrast agent; Magnetic resonance imaging

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.06.008

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院影像醫(yī)學(xué)科(田冰、劉日、陳士躍、劉芳、李晶、陳錄廣、王莉、陸建平)，核醫(yī)學(xué)科(賈國(guó)榮)

陸建平，Email: cjr.lujianping@vip.163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(81300366)

2016-07-18)