CKS1B參與擬穴青蟹性腺發(fā)育的研究

韓坤煌戴燕彬鄒志華張子平王藝?yán)?/p>

（1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361021；2. 寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司，寧德 352103；3. 漳州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，漳州 363000；4. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

CKS1B參與擬穴青蟹性腺發(fā)育的研究

韓坤煌1，2戴燕彬3鄒志華1張子平4王藝?yán)?

（1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361021；2. 寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司，寧德 352103；3. 漳州市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，漳州 363000；4. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

CDC28蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基1B（CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B，CKS1B）是高度保守的CKS1家族成員之一，在細(xì)胞周期中作為細(xì)胞周期蛋白激酶的調(diào)節(jié)亞基參與調(diào)控真核生物的細(xì)胞分裂。因此，研究CKS1家族基因參與甲殼動(dòng)物性腺發(fā)育調(diào)節(jié)的分子機(jī)制具有重要的意義。從已構(gòu)建的擬穴青蟹性腺EST數(shù)據(jù)庫中篩選到CKS1B基因片段，繼而克隆出其全長(zhǎng)cDNA序列（Sp-CKS1B），并利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其在不同組織和性腺不同發(fā)育階段中的差異表達(dá)。結(jié)果顯示，獲得Sp-CKS1B的全長(zhǎng)cDNA序列722 bp，其中5' UTR為82 bp，3' UTR為379 bp，開放閱讀框261 bp，編碼86個(gè)氨基酸，包含一段典型的CKS保守序列，屬于CKS家族蛋白。在不同組織qRT-PCR結(jié)果顯示，Sp-CKS1B 基因在O5期雌蟹卵巢中的表達(dá)水平最高，并與其他組織具有極顯著差異（P＜0.01）；同時(shí)，在性腺不同發(fā)育階段的表達(dá)結(jié)果顯示，Sp-CKS1B 基因在精巢T1期的表達(dá)量最高，其次為O5期，二者顯著高于卵巢O1-O4期的表達(dá)水平（P＜0.05）；而在精巢T3期的表達(dá)量最低，并顯著低于T1、T2以及卵巢O4、O5期的表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)果說明了Sp-CKS1B在擬穴青蟹的性腺發(fā)育過程中可能具有十分重要的作用。

CDC28蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基1B；擬穴青蟹；基因克??；組織表達(dá)；性腺發(fā)育

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要特征之一，受到細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）等因子的調(diào)控，而CDKs的活性受到細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDK inhibitor，CKI）、細(xì)胞周期蛋白激酶活化激酶（CDK activating kinase，CAK）以及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶調(diào)節(jié)亞基（Cyclin kinase subunit，CKS）的調(diào)控［1］。CKS1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白CKS/Suc1家族成員之一，在序列上高度保守，在細(xì)胞周期中通過與CDKs結(jié)合參與調(diào)控真核生物的細(xì)胞分裂［2］。CDC28蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基1B（CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B，CKS1B）是CKS1家族成員之一，在細(xì)胞周期中參與組成泛素連接酶SCFSKP2-CKS1復(fù)合物，進(jìn)行泛素化降解細(xì)胞周期蛋白抑制因子p27kip1，使細(xì)胞周期從G1期順利向S期轉(zhuǎn)換，為后續(xù)細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備［3，4］。Reynard等［5］研究表明CKS1在細(xì)胞分裂G1期和M期均具有重要作用。Westbrook等［6］在CKS1參與乳腺癌細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，減少雌激素的分泌會(huì)導(dǎo)致CKS1表達(dá)水平降低，而使癌細(xì)胞停滯于G1期，進(jìn)一步敲除CKS1基因后，CDK1的表達(dá)亦相應(yīng)減少，使細(xì)胞分裂難以進(jìn)入M期。Demetrick等［7］研究表明CKS1在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂第一次分裂中期向后期轉(zhuǎn)換過程中具有重要的作用。因此，CKS1是細(xì)胞有絲分裂和減數(shù)分裂的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。

目前關(guān)于甲殼動(dòng)物生殖內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究已發(fā)展成為其內(nèi)分泌學(xué)研究的一個(gè)學(xué)術(shù)熱點(diǎn)。擬穴青蟹（Scylla paramamosain）是我國(guó)東南沿海的一種重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蟹類，與其他蟹類相比，具有個(gè)體較大、生長(zhǎng)較快、肉鮮味美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者喜愛，在我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要的地位［8］。目前研究擬穴青蟹性腺發(fā)育的調(diào)控機(jī)制已深入到分子水平，而關(guān)于CKS1在甲殼動(dòng)物性腺發(fā)育中的研究尚未見到報(bào)道。因此，本研究首次在甲殼動(dòng)物中成功克隆出擬穴青蟹CKS1B（命名為Sp-CKS1B）基因的全長(zhǎng)cDNA序列［9］，并檢測(cè)其在不同組織以及性腺發(fā)育過程中的差異表達(dá)，以期在分子水平上為研究CKS1家族基因參與甲殼動(dòng)物性腺發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

所用擬穴青蟹采自廈門農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，結(jié)合性腺的外部形態(tài)、性腺發(fā)育指數(shù)［10］及組織學(xué)特征［11，12］，將卵巢分為5個(gè)時(shí)期，精巢分為3個(gè)時(shí)期，每個(gè)性腺發(fā)育時(shí)期的個(gè)體數(shù)選取3只以上，并選取5只以上O5期雌蟹個(gè)體的組織用于測(cè)定組織差異表達(dá)分析。

1.2 方法

利用RDP試劑［13］及RNA提取方法提取擬穴青蟹各樣品總RNA。根據(jù)前期獲得的Sp-CKS1B基因片段，利用Primer5.0軟件，設(shè)計(jì)其5' RACE和3' RACE引物，克隆全長(zhǎng)cDNA序列，采用NCBI數(shù)據(jù)庫中VecScreen、Blast、ORF Finder以及PI、SWISS-MODEL、MEGA 4.0等軟件對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。以隨機(jī)引物介導(dǎo)合成反轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈，以18S rRNA［14］為參照基因，采用qRTPCR技術(shù)，檢測(cè)其在不同組織及性腺不同發(fā)育階段的表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)qRT-PCR技術(shù)所得的RQ值，利用SPSS 15.0軟件對(duì)其進(jìn)行樣本T-檢驗(yàn)分析，所用數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x-±s）來表示，*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果

2.1 Sp-CKS1B全長(zhǎng)cDNA的克隆與序列分析

以擬穴青蟹的性腺EST［15］文庫篩選到的CKS1B基因片段為基礎(chǔ)，通過SMART-RACE技術(shù)成功克隆出Sp-CKS1B基因的全長(zhǎng)cDNA序列，基因登錄號(hào)為FJ623275。如圖1所示，Sp-CKS1B的全長(zhǎng)cDNA序列722 bp，其中5' UTR為82 bp，3' UTR為379 bp，開放閱讀框261 bp編碼86個(gè)氨基酸。推導(dǎo)的蛋白分子量為10.5 kD，pI 6.27。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，其與大多數(shù)物種的CKS1具有70%以上的一致性，結(jié)構(gòu)域分析顯示其包含典型的CKS保守序列（I5-T73），屬于CKS1家族蛋白。

2.2 Sp-CKS1B系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中不同物種的CKS1B蛋白序列，以Mega 4.0軟件的鄰接法將擬穴青蟹Sp-CKS1B推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種的CKS1B氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，構(gòu)建Sp-CKS1B系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖2）顯示，脊椎動(dòng)物、脊索動(dòng)物、甲殼類、昆蟲類各自形成一簇，綠藻（Ostreococcus tauri）處于系統(tǒng)進(jìn)化樹的最外圍，擬穴青蟹Sp-CKS1B與淡水甲殼動(dòng)物大型溞（Daphnia magna）聚為一枝，位于脊椎動(dòng)物、脊索動(dòng)物、昆蟲類的中間。

圖1 擬穴青蟹CKS1B cDNA及其氨基酸序列

2.3 Sp-CKS1B 基因在不同組織中的表達(dá)

利用qRT-PCR技術(shù)得出的組織差異表達(dá)結(jié)果（圖3）顯示，Sp-CKS1B 基因在O5期雌蟹卵巢中的表達(dá)水平最高，并與其他各組織的表達(dá)水平具有極顯著差異（P＜0.01），其次為血淋巴、胃以及眼柄中的表達(dá)，表達(dá)最低值出現(xiàn)在肝胰腺。卵巢以外其他各組織間的表達(dá)無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 Sp-CKS1B 基因在性腺發(fā)育中的表達(dá)

如圖4所示，在擬穴青蟹性腺的不同發(fā)育階段中，Sp-CKS1B 基因在精巢T3期的表達(dá)量最低，并顯著低于T1、T2以及卵巢O4、O5期的表達(dá)水平（P＜0.05）；而在精巢T1期的表達(dá)量最高，O5期的表達(dá)水平緊隨其后，二者與卵巢O1-O4期的表達(dá)水平具有顯著性差異（P＜0.05）；O1-O3期以及T3期之間的表達(dá)水平無明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

圖2 基于鄰位相接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本形式，通過對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控因子的深入研究是目前研究配子細(xì)胞的發(fā)生與成熟的一大熱點(diǎn)。CKS1是一種序列高度保守的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，屬于CKS/Suc1家族［16］，作為CDKs的調(diào)節(jié)亞基，為CDKs功能活性所必須，在細(xì)胞周期過程中起著重要的調(diào)控作用。CKS1B是CKS1的家族成員之一，主要參與合成泛素連接酶SCFSKP2-CKS1復(fù)合物，對(duì)于CDKs的功能抑制因子p27起著泛素化降解作用，從而促進(jìn)細(xì)胞周期順利進(jìn)入S期［3，4］，為后續(xù)細(xì)胞分裂周期做準(zhǔn)備。對(duì)不同物種CKS1B的序列與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析有助于更好地了解其功能的作用機(jī)制。本研究首次在甲殼動(dòng)物中克隆出Sp-CKS1B的全長(zhǎng)cDNA序列，通過比對(duì)分析顯示其序列中包含1個(gè)典型的CKS保守區(qū)域（I5-T73），屬于CKS1家族成員，其序列中存在一個(gè)高度保守的“HXPEPH”序列的β區(qū)域，該區(qū)域決定CKS蛋白的折疊方式［9］。Richardson等［17］率先從人的身上克隆出CKS1基因，其研究表明CKS1從酵母到人的一致性較高，高達(dá)81%，Bourne等［18］研究結(jié)果表明大部分物種的CKS1蛋白分子結(jié)構(gòu)也存在較高的相似性。本研究通過對(duì)Sp-CKS1B的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示其序列在不同物種中高度保守，與大部分物種的CKS1均有70%以上的一致性，特別是與淡水甲殼動(dòng)物大型溞（Daphnia magna）CKS1的一致性最高，達(dá)88%，而與人的CKS1B序列（基因登錄號(hào)：EU176487.1）一致性亦為79%，序列與結(jié)構(gòu)的高度保守反映了其在細(xì)胞周期過程中可能具有相似且十分重要的生物學(xué)功能。

圖3 Sp-CKS1B基因在O5期雌蟹不同組織間的表達(dá)

圖4 Sp-CKS1B基因在性腺發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)

CKS在細(xì)胞周期中的調(diào)節(jié)作用已被廣大研究者所熟知［19-21］，高等真核生物的CKS家族有2個(gè)成員：CKS1和CKS2，它們都是通過結(jié)合CDKs促進(jìn)CDKs功能活性，從而參與調(diào)控細(xì)胞周期［22］。本研究對(duì)Sp-CKS1B在O5期雌蟹不同組織間的表達(dá)水平結(jié)果（圖3）顯示，Sp-CKS1B基因在卵巢中的表達(dá)量最高，并與其他各組織具有極顯著差異（P＜0.01），這與前期關(guān)于Sp-Ub［10］、Sp-SUMO1［12］、Sp-CDK1［14］等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白基因在擬穴青蟹不同組織間的差異表達(dá)相一致，研究表明細(xì)胞周期相關(guān)激酶CDK1和泛素降解系統(tǒng)相關(guān)Ub以及SUMO基因在擬穴青蟹卵巢中的表達(dá)極顯著高于其他各組織。CDK1是細(xì)胞分裂過程中G1/S期以及G2/M期轉(zhuǎn)換的重要調(diào)節(jié)因子［23，24］，泛素蛋白酶體降解途徑（UPP）是真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種重要的蛋白降解途徑，細(xì)胞中有超過80%的蛋白須通過UPP進(jìn)行降解以完成細(xì)胞分裂［1］，Sp-CKS1B與這些基因在卵巢中相同模式的高表達(dá)，可能是由于O5期卵巢中的細(xì)胞分裂次數(shù)較多，且臨近排卵期，卵母細(xì)胞不斷成熟、體積不斷膨脹［11］，可能需要活化眾多的CDKs和降解細(xì)胞周期相關(guān)蛋白以完成細(xì)胞分裂，因而它的表達(dá)水平相比其他組織處于較高的水平。

進(jìn)一步，本研究通過對(duì)擬穴青蟹性腺不同發(fā)育時(shí)期Sp-CKS1B的差異表達(dá)結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，Sp-CKS1B在性腺各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其表達(dá)值最高出現(xiàn)在精巢T1期，其次為O5期，二者與卵巢O1-O4期的表達(dá)水平具有顯著性差異（P＜0.05）；而在精巢T3期的表達(dá)量最低，并與精巢T1、T2期以及卵巢O4、O5期的表達(dá)水平具有顯著性差異（P＜0.05）。其中Sp-CKS1B在卵巢中的表達(dá)呈一定的梯度增加現(xiàn)象，而在精巢的表達(dá)卻呈相反趨勢(shì)，可能是由卵巢［11］和精巢［25，26］發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制的差異引起。在卵巢發(fā)育過程中，Sp-CKS1B在O1-O4期的表達(dá)未有顯著性差異，至O5期達(dá)到最高值，并與O1-O3期具有顯著性差異，這與Sp-CDK1［14］在擬穴青蟹卵巢中的表達(dá)有所區(qū)別，而與Sp-Ub［10］的表達(dá)模式一致。CDK1在細(xì)胞周期各時(shí)相轉(zhuǎn)換過程中均有普遍功能，CDK1/cyclinA結(jié)合可使細(xì)胞順利通過G2期，并參與了G2/M期的過渡期，CDK1/cyclinB復(fù)合物可促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)出M期［1，23，24］，其在卵巢中的表達(dá)具有較為廣泛的分布；Ub是真核細(xì)胞中普遍存在的小分子蛋白，參與了細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)的泛素化降解［1］。Sp-CKS1B的表達(dá)并不僅僅作用于CDK1，其在卵子發(fā)生中后期顯著提高可能是由于擬穴青蟹卵巢發(fā)育過程中，其卵子細(xì)胞不斷增多，細(xì)胞分裂旺盛，成熟卵黃蛋白積累增加［27，28］，促進(jìn)其細(xì)胞直徑也不斷膨脹［11］，所需的CKS亦會(huì)相應(yīng)增加，故而其表達(dá)量會(huì)有所增加。

本研究中Sp-CKS1B在精巢發(fā)育過程中呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，與Sp-CDK1［14］和Sp-Ub［10］的表達(dá)模式相似。Spruck等［29］對(duì)小鼠生殖細(xì)胞發(fā)生過程的調(diào)控機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，如缺失CKS2基因?qū)?dǎo)致減數(shù)分裂Ⅰ期難以向后期轉(zhuǎn)換；Tang等［30］研究發(fā)現(xiàn)CDK偶聯(lián)的CKS1在G1和G2期均發(fā)揮著重要的作用；Reynard等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，芽殖酵母Cks1可促進(jìn)細(xì)胞周期G1期與M期中的CDKs-cyclins復(fù)合物功能活性的激活；Rother等［31］的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cks1在晚G1期開始表達(dá)，至S/G2期達(dá)到最高；Krishnan等［32］通過氟西汀處理腫瘤細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)CKS1與cyclinA的表達(dá)水平具有同步下調(diào)現(xiàn)象，使腫瘤細(xì)胞停滯于G0/G1期，這些研究成果為進(jìn)一步解釋Sp-CKS1B在精巢中的差異表達(dá)提供了理論依據(jù)。本研究結(jié)果中Sp-CKS1B在精巢T1期的表達(dá)水平最高，在T3期的表達(dá)量最低，可能是由于精巢發(fā)育過程中，前期T1-T2期精原細(xì)胞不斷變態(tài)發(fā)育為精子細(xì)胞，生精細(xì)胞的細(xì)胞分裂旺盛，CKS1B的表達(dá)量增高可促進(jìn)更多的CDKs/cyclins復(fù)合物功能的活化［5，6］，并促進(jìn)眾多蛋白通過泛素化途徑降解［2，3］，促進(jìn)細(xì)胞分裂次數(shù)急劇增加，因而導(dǎo)致表達(dá)量增多；而T3期的成熟細(xì)胞數(shù)量不斷增多，形成了較多的生殖帶［25，26］，處于細(xì)胞分裂周期中的細(xì)胞比例較少，因而其表達(dá)水平最低。

4 結(jié)論

本研究首次克隆出擬穴青蟹Sp-CKS1B的全長(zhǎng)cDNA序列，BLAST比對(duì)拼接顯示其序列具有保守的CKS結(jié)構(gòu)域，屬于CKS1家族。通過對(duì)其在不同組織以及性腺不同發(fā)育階段的差異表達(dá)研究表明，Sp-CKS1B在卵巢中的表達(dá)量最高，并與其他組織具有極顯著差異；而在性腺不同發(fā)育階段的表達(dá)分布并不一致，顯示Sp-CKS1B對(duì)擬穴青蟹性腺發(fā)育及生殖細(xì)胞的發(fā)生與成熟具有重要的調(diào)節(jié)作用。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

On the Involvement of CKS1B in Gonad Development of Mud Crab Scylla paramamosain

HAN Kun-huang1，2DAI Yan-bin3ZOU Zhi-hua1ZHANG Zi-ping4WANG Yi-lei1
（1. Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea，Ministry of Agriculture，F(xiàn)isheries College，Jimei University，Xiamen 361021；2. Ningde Fufa Fisheries Company Limited，Ningde 352103；3. Fisheries Technical Extension Station of Zhangzhou，Zhangzhou 363000；4. College of Animal Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002）

CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B（CKS1B）is a member of the highly conserved cyclin kinase subunit 1（CKS1）protein family，and involves in cell division of eukaryotic organisms as a regulatory subunit of cyclin-dependent kinases. Therefore，it is of significance to study the function of CKS1 family genes involved in the molecular mechanism of regulating crustacean’s gonad development. In the present study，the fragment of CKS1B gene was selected from the gonad EST library of S. paramamosain，and the full-length cDNA sequence of Sp-CKS1B was cloned，further the expressions of Sp-CKS1B in different tissues and different development stages of gonad were examined using qRT-PCR. As results，the full length cDNA of Sp-CKS1B was 722 bp，including a 5'untranslated region（5' UTR）of 82 bp，a 3'UTR of 379 bp，and an open reading frame of 261 bp encoding a protein of 86 amino acid. The protein contained a typical CKS conservative sequence belonging to the CKS family. Its expression level in the ovary of O5 stage female crabs was the highest，and presented extremely significant difference from other tissues（P＜0.01）. Meanwhile，the expression level of Sp-CKS1B gene in T1 was the highest among the other stages of gonad development，followed by O5 stage，both of them were significantly higher than O1-O4 stage of female with significant difference（P＜0.05）. Its lowest expression level was in the T3 stage，which was significantly lower than in T1，T2，O4，and O5 stages（P＜0.05）. These results suggest that Sp-CKS1B may play a critical role in the gonad development of the mud crab.

CKS1B；Scylla paramamosain；gene cloning；tissue expression；gonad development

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.030

2016-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31072200，31472266），集美大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目（2010A001）

韓坤煌，男，博士研究生，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物增養(yǎng)殖技術(shù)、功能基因組學(xué)；E-mail：hankunhuang@foxmail.com

王藝?yán)?，女，教授，博士生?dǎo)師，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物功能基因組學(xué)；E-mail：ylwang@jmu.edu.cn