植物表皮毛發(fā)育控制基因GL2遺傳互作因子的篩選和鑒定

侍雙月 陳子玉 安麗君

（西北農(nóng)林科技大學生命科學學院 旱區(qū)逆境生物學國家重點實驗室，楊凌 712100）

植物表皮毛發(fā)育控制基因GL2遺傳互作因子的篩選和鑒定

侍雙月 陳子玉 安麗君

（西北農(nóng)林科技大學生命科學學院 旱區(qū)逆境生物學國家重點實驗室，楊凌 712100）

表皮毛廣泛存在于陸生植物的地上部分，是植物與環(huán)境之間的一道天然屏障，具有多種重要的生物學功能。擬南芥HD-Zip家族轉(zhuǎn)錄因子GLABRA 2（GL2）是調(diào)控表皮毛形成和發(fā)育的關鍵因子，通過篩選和鑒定GL2的遺傳互作因子，可以為進一步研究植物表皮毛發(fā)育調(diào)控的分子機制奠定基礎。通過大規(guī)模的遺傳篩選和圖位克隆，獲得了一個葉片上完全沒有表皮毛的突變體M12-01，遺傳分析表明M12-01 single突變表型受隱性單核基因控制。M12-01 single突變體表型與擬南芥TRANSPARENT TESTA GLABKA 1（TTG1）基因的功能缺失突變體表型相似。對TTG1基因的測序結果顯示其+445位堿基由鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰剩瑥亩咕幋a的甘氨酸變?yōu)榫彼?。本研究證實TTG1突變能增強gl2-3突變體的表型，GL2基因與TTG1基因之間存在遺傳互作，這為進一步研究GL2調(diào)控植物表皮毛發(fā)育的分子機制提供了新的遺傳材料。

表皮毛；GL2；圖位克?。籘TG1；遺傳互作

植物表皮毛是一種特化的表皮細胞，是地上部組織表皮向外突出形成的一種單細胞或多細胞結構［1，2］。作為與外界環(huán)境接觸的最外層結構，具有重要的生物學功能。表皮毛的存在能減少植株熱量的散失，提高植物對冷害的抗性［3，4］；減少植株對太陽輻射的吸收，保護組織免受紫外線的傷害［5］；防止水分的散失，提高植物的抗旱性等［6］；吸收重金屬元素，提高植物對土壤重金屬污染的防御［7，8］。另外，表皮毛還能通過建立物理屏障來抵御食植性昆蟲對植物體的危害［9］。同時，表皮毛細胞發(fā)育分化的獨特性使其成為研究細胞命運決定和細胞發(fā)育調(diào)控的模式系統(tǒng)，因此研究植物表皮毛的發(fā)育調(diào)控機制具有重要的理論意義和潛在的應用價值。

模式植物擬南芥表皮毛是一種典型的單細胞結構，無腺體，一般有3個分支，廣泛分布于葉片、莖、蓮座葉和萼片上［10］。目前，擬南芥中已報道的控制表皮毛發(fā)育的基因有70多個，HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子GLABRA2（GL2）是最早鑒定的控制植物表皮毛發(fā)育的關鍵調(diào)控因子之一［11］。GL2正調(diào)控表皮毛的形成，GL2功能缺失突變體表現(xiàn)為表皮毛嚴重缺失，發(fā)育受阻，只在葉片的邊緣有少量的毛狀突起或者1分支、2分支的表皮毛。GL2基因編碼一個HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子，位于連接表皮毛形成及隨后發(fā)育的咽喉位置，其表達受到上游的GL1-GL3/EGL3-TTG1轉(zhuǎn)錄復合體的調(diào)控，但是其下游的調(diào)控路徑還不明確［11］。

本研究通過篩選以gl2-3突變體為背景建立的甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulphonate，EMS）二次誘變庫，得到了一個gl2-3的增強突變體M12-01，其表型為葉表面完全沒有表皮毛。與Col-0回交獲得了M12-01單突變體（M12-01 single）。遺傳學分析表明，M12-01 single是單基因控制的隱性性狀。通過圖位克隆發(fā)現(xiàn)該突變基因是TTG1基因的一個新等位基因［12］。本研究旨在為研究GL2調(diào)控表皮毛發(fā)育的過程提供新的遺傳材料，為進一步解釋GL2調(diào)控植物表皮毛發(fā)育的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型 Columbia（Col-0），Landsberg erecta（Ler）、SALK_039825（gl2-3）純合體、ttg1-1突變體由本實驗室保存。gl2-3背景的EMS突變體庫由本實驗室創(chuàng)制保存。

1.2 方法

1.2.1 植物的種植和培養(yǎng) 將gl2-3背景的EMS誘變庫按pool種植在充分吸水后的商業(yè)營養(yǎng)上（pindstrup substrate peat moss）上，4℃處理3 d保證種子萌發(fā)的均一性，然后移入培養(yǎng)溫度為22℃左右，相對濕度為70%的24 h持續(xù)光照培養(yǎng)間中生長。待植物長出第3、4片真葉（15 d左右）時觀察葉片表皮毛發(fā)育狀況，篩選能回復或者增強gl2-3表皮毛突變表型的植株作為潛在的目標突變體。

1.2.2 突變體背景的純化和遺傳分析 以擬南芥Col-0植株為母本，挑選出的表皮毛明顯異常的突變體為父本雜交得到F1代植株，F(xiàn)1代植株自交得到F2代種子。種植并觀察F2代植株表型，統(tǒng)計F2代群體植株分離的表型和比例，挑選出Col-0背景的單突變體。Col-0與單突變體連續(xù)回交3次，純化單突變體的遺傳背景并獲得BC3。在Col-0與單突變體回交的過程中，通過觀察雜交F1代植株的表型判斷突變基因的顯隱性；通過統(tǒng)計F2群體中的分離比判斷該突變是否為單基因突變。同時，通過正反交來確定突變體的遺傳方式。

1.2.3 圖位克隆 將單突變體與Ler生態(tài)型擬南芥進行雜交，在雜交F2代植株中挑選具有單突變體表型的植株作為圖位克隆的作圖群體。通過CTAB法提取95棵突變體植物DNA，每個樣品中吸取5 μL等量混合得到一個DNA池（bulk），利用已經(jīng)公布的均勻覆蓋擬南芥5條染色體的27對分子標記為引物，對突變基因進行初步的粗定位。確定突變位點在染色體上的連鎖區(qū)間和側(cè)翼分子標記后，繼續(xù)擴大作圖群體，增加分子標記密度進行精細定位，進一步縮小突變位點所在區(qū)間范圍。

1.2.4 候選基因的確定 根據(jù)精細定位的區(qū)間，從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（www.arabidopsis.org）上獲得區(qū)間內(nèi)所包含的全部基因，查看基因注釋信息及相關參考文獻，篩選出候選突變基因，然后針對這些候選突變基因設計引物，進行PCR擴增并測序，最終確定出突變位點。

1.2.5 ttg1-1與gl2-3突變體之間的遺傳互作分析 將gl2-3與ttg1-1雜交，觀察F2代植株表型，判斷ttg1-1是否能增強gl2-3突變體的表型。

1.2.6 實時熒光定量RT-PCR分析 將不同基因型的植物種子分別種植在充分吸水的商業(yè)營養(yǎng)土上，置于光照培養(yǎng)間中培養(yǎng)。待植物生長10 d后取除子葉外的全部地上部組織，TRIzol法提取總RNA并進行DNAase處理，將1.5 μg 處理后的總RNA用Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板，利用Bio-Rad實時熒光定量PCR試劑盒和TTG1和GL2基因特異性引物進行PCR擴增，以UBQ10基因為內(nèi)參照。相對基因表達量的為2-ΔΔCt，所用的引物序列為：GL2qF1 5'-ATGAAGCTCGTCGGCATGAGTGGG-3'；GL2qR1 5'-TGGATTGCCACTGAGTTGCCTCTG-3'；TTG1qF1 5'-GCGATTTCCTCCGTCTTTGG-3'；TTG1qR1 5'-CGCTCGTTTTGCTGTTGTTG-3'；UBQ10qF1 5'-GGTTCGTACCTTTGTCCAAGCA-5'；UBQ10qR1 5'-CCTTCGTTAAACCAAGCTCAGTATC-3'。

2 結果

2.1 M12-01突變體的獲得和表型分析

為了深入研究GL2參與擬南芥表皮毛發(fā)育的調(diào)控機制，開展了大規(guī)模的遺傳篩選工作，希望通過篩選gl2-3的修飾突變體從而發(fā)掘GL2的新互作因子。在對以gl2-3背景進行的EMS誘變庫的篩選過程中，獲得了一個表皮毛突變體，將其命名為M12-01（代表第12個誘變pool中篩選到的第1個突變體）。與gl2-3相比，M12-01 突變體葉片上完全沒有表皮毛，其他發(fā)育表型與野生型相比沒有明顯差異（圖1），表明M12-01的突變基因可能是GL2基因的增強子。由于M12-01突變體中還包含有gl2突變位點，為了獲得M12-01 single，將M12-01突變體與Col-0進行回交，在F2代植株中挑選出Col-0背景的M12-01 single，并繼續(xù)將M12-01 single與Col-0連續(xù)回交3次，一方面清除遺傳背景，一方面觀察M12-01 single的突變表型是否能穩(wěn)定遺傳。結果（圖1）發(fā)現(xiàn)，M12-01 single與Col-0相比，其葉片表面幾乎沒有表皮毛，只在邊緣有少量的單分支的表皮毛，并且M12-01 single的突變表型能穩(wěn)定遺傳。

由于M12-01 single突變體表型明顯，并且可能與GL2存在一定的互作關系，所以利用圖位克隆的方法對突變基因進行了克隆，以期能發(fā)現(xiàn)GL2的新遺傳因子。首先我們進行了正反交試驗，結果顯示無論是正交還是反交，所獲得的F1代植物均表現(xiàn)與野生型一致的表型，表明該突變體是由核基因控制的隱性突變體。在F1自交后代F2中野生型表型與突變體表型個體的分離比為3∶1，符合孟德爾隱性單基因遺傳規(guī)律，這說明M12-01 single表型是受單個隱性的核基因控制的。

圖1 M12-01及M12-01 single突變體的表皮毛發(fā)育表型

2.2 M12-01 single突變基因的定位

2.2.1 M12-01 single突變位點的粗定位 首先將Ler生態(tài)型擬南芥與M12-01 single BC3突變體植株進行雜交，在F2代中挑選M12-01 single表型植株作為圖位克隆的作圖群體，利用實驗室已有的覆蓋且等分擬南芥5條染色體的27個分子標記（圖2）和M12-01 single突變體DNA混合池bulk進行了染色體的粗定位。根據(jù)與突變位點連鎖的分子標記所擴增出的條帶的遺傳背景偏向突變體來源的Col-0，而用于雜交的另一親本Ler條帶不能擴增或擴增量弱于對照的原理，我們發(fā)現(xiàn)突變位點與第五條染色體上分子標記F13G24（2、501和825），MOJ16（7、464和 555），F(xiàn)14I23（9、935和849）及K18L3（15、085和156）連鎖較為緊密（圖2）。

圖2 M12-01 single突變位點的粗定位

2.2.2 突變位點的精細定位 確定突變位點與染色體的連鎖關系后，為了進一步確定突變位點在染色體上所在的區(qū)間，以 95個突變體DNA為模板，以F13G24#1（2、501和825）和K18L3（15、085和156）為引物進行PCR（表1），結果顯示突變位點位于分子標記F13G24#1和K18L3#1之間，所以我們將分子標記F13G24#1和K18L3#1作為后續(xù)定位的側(cè)翼分子標記（flanking marker）（圖3）。接著我們通過在flanking marker區(qū)間內(nèi)增加分子標記密度對M12-01 single 突變位點進行精細定位。利用2個新的插入/刪除（In/Del）分子標記MQJ16#1（7、464和555）和F14I23#1（9、935和849）（表1）對F2作圖群體中95株突變體表型植物的基因型分析，最終將突變基因定位在分子標記MQJ16#1和F14I23#1的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間的物理距離為2、471和294 bp（圖3）。

表1 精細定位所用分子標記的引物名稱

2.2.3 候選基因的篩選與確定 確定了M12-01 single突變位點所在的區(qū)間后，對該區(qū)間內(nèi)基因注釋進行分析，重點關注與表皮毛發(fā)育相關的基因。在這個區(qū)間里，基因At5g24520被報道與表皮毛發(fā)育有關，At5g24520基因也被稱為TRANSPARENTTESTA GLABRA 1（TTG1），它編碼一個含有4-5個WD重復的小蛋白［12］。并且，TTG1基因的功能缺失突變體ttg1-1與野生型相比，葉表面光滑，只在葉片邊緣有少量表皮毛，種皮顏色為黃色［13］，與M12-01 single突變體表型相似（圖4）。據(jù)此推測M12-01 single突變體的表型可能為TTG1基因功能缺陷導致。

圖3 M12-01 single突變基因的精細定位

為了驗證我們的推測，設計TTG1基因的特異性引物，以M12-01 single BC3突變體DNA為模板對TTG1編碼區(qū)的DNA片段進行PCR擴增并對擴增產(chǎn)物進行測序。引物序列如下：At5g24520F：5'-GATACTGATTAATCCAGAGG-3'；At5g24520R：5'-GACTATCTGTAATGCAACAC-3'。測序結果（圖5）顯示，TTG1基因的+445 bp處發(fā)生了單堿基突變，由鳥嘌呤（G）突變?yōu)橄汆堰剩ˋ），導致中性氨基酸Gly149突變?yōu)閴A性氨基酸Arg149。這說明TTG1基因的單堿基突變很可能是造成M12-01 single突變表型產(chǎn)生的原因，TTG1可能就是M12-01 single的突變基因。

2.2.4 TTG1與GL2基因間的遺傳互作分析 為了進一步確定TTG1基因的突變是造成M12-01突變表型產(chǎn)生的原因，并且TTG1突變能增強gl2-3突變體的表型，對M12-01 single和ttg1-1突變體進行等位性分析。ttg1-1的突變表型是由于TTG1基因的+949 bp處發(fā)生了單堿基突變，由胞嘧啶（C）突變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），導致該位點的氨基酸由Gln變?yōu)榻K止密碼子產(chǎn)生無義突變，引起了編碼蛋白的提前終止［14］（圖6）。

圖 4 M12-01 single與ttg1-1突變體的表型

首先我們將M12-01 single與ttg1-1進行了雜交，觀察F1植物的表型，發(fā)現(xiàn)F1植物的表型與M12-01 single相似（圖7-a），表明M12-01 single與ttg1-1不能互補彼此的突變表型，M12-01 single與TTG1是等位基因。其次我們將ttg1-1 突變體與gl2-3進行了雜交，構建ttg1-1 gl2-3 雙突變體，觀察ttg1-1是否也能增強gl2-3突變體的表型，結果（圖7-b）表明ttg1-1 gl2-3雙突變的表型與M12-01相似，葉片上完全沒有表皮毛，這表明ttg1-1像M12-01 single一樣也能增強gl2-3突變體的表型。這些結果說明M12-01 single 的突變表型就是由TTG1基因的單堿基突變造成的，TTG1與GL2基因之間存在遺傳互作，TTG1突變可以增強GL2功能缺失突變體的表型。

圖 5 M12-01single 突變位點的確定

圖6 M12-01 single和ttg1-1突變體分析

圖 7 M12-01single和ttg1-1突變體的等位性分析

確定GL2與TTG1在遺傳互作中的上下游關系。通過實時熒光定量RT-PCR檢測TTG1突變對GL2基因表達水平的影響以及GL2基因突變對TTG1基因表達水平的影響。結果（圖8）顯示在M12-01 single突變體中，GL2的表達水平顯著受到抑制，在ttg1-1突變體中，也看到了相似的結果。這表明TTG1作用于GL2的上游。在gl2-3突變體中，TTG1基因的表達水平顯著增加，在GL2功能缺失突變體cs65中，TTG1的表達水平也有所上升（圖8），這表明GL2可能對TTG1的轉(zhuǎn)錄有潛在的調(diào)節(jié)作用。

3 討論

遺傳突變體的獲得是研究基因功能的強有力手段。為了進一步發(fā)掘與GL2互作的新因子，揭示GL2參與調(diào)控表皮毛發(fā)育的作用機制，本實驗利用EMS高效誘變擬南芥gl2-3突變體所建立的二次突變體庫，篩選gl2-3的修飾突變體，以期能獲得GL2的新的互作因子。通過對擬南芥表皮毛發(fā)育狀態(tài)的觀察，篩選出了一個gl2-3的增強突變體M12-01并獲得了M12-01 single?；蚩寺”砻鱉12-01 single的突變表型是由TTG1基因的+445 bp處發(fā)生由鳥嘌呤到腺嘌呤的單堿基突變，從而使中性氨基酸Gly149突變?yōu)閴A性氨基酸Arg149所導致的。進一步的等位性分析證實TTG1基因突變是造成M12-01 single表型產(chǎn)生的原因，M12-01 single是TTG1的一個新的等位突變體。

圖 8 GL2（A）及TTG1（B）基因的表達水平分析

早期對GL2基因的研究發(fā)現(xiàn)其編碼一個HDZip轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)控表皮毛形成和發(fā)育的關鍵因子，它的功能喪失導致表皮嚴重缺失和發(fā)育受阻［15］。GL2和TTG1均參與早期表皮毛發(fā)育過程，TTG1編碼一個含有4-5個WD重復的小蛋白，它能與GL3相互作用形成bHLH/WD40轉(zhuǎn)錄復合體，通過調(diào)控GL2的表達從而調(diào)控表皮毛細胞的形成及發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)TTG1突變能增強GL2突變體的表型，這表明TTG1和GL2在調(diào)控表皮毛發(fā)育的過程中可能處于不同的途徑上，GL2在表皮毛發(fā)育過程中對TTG1部分依賴又相互獨立。

本實驗所獲得的M12-01突變體為進一步研究TTG1與GL2基因之間的互作關系提供了新的遺傳材料，為深入研究GL2參與植物表皮毛發(fā)育的調(diào)控關系奠定了基礎。

4 結論

通過對gl2-3突變體背景的EMS誘變體庫的篩選獲得一株完全沒有表皮毛的突變體M12-01，圖位克隆發(fā)現(xiàn)該突變基因是TTG1的等位基因。遺傳分析證實TTG1突變可以增強GL2突變體的表型。

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（責任編輯 李楠）

Screening and Identification of New Genetic Factors Interacting with GL2 During Plant Trichome Development

SHI Shuang-yue CHEN Zi-yu AN Li-jun
（State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Area /College of Life Sciences，Northwest A&F University，Yangling 712100）

Trichomes widely exist on aboveground parts of terrestrial plants，exhibiting as natural barriers between plants and the environment，and also servering many biological functions. The transcription factor GLABRA 2（GL2）is a key factor regulating trichome initiation and the following developmental processes. Screening and identification of new GL2 interactors will lay a foundation for further uncovering the regulatory molecular mechanisms of trichome development. Through large-scale genetic screening and cloning，a new mutant M12-01 without trichome in the leaves was found，and genetic analysis indicated that the phenotype of M12-01single mutant was controlled by a recessive single nuclear gene. The phenotype of M12-01 single mutant was similar to that of functional deletion mutant of Arabidopsis TTG1 gene. Sequencing TTG1 gene revealed that a single nucleotide replacement from guanine to adenine in +445 of TTG1 gene occurred，which resulted in the encoded glycine changed to arginine. This work confirmed that mutation of TTG1 enhanced the phenotype of gl2-3 mutant，and genetic interaction between gene GL2 and TTG1，which provides new genetic materials for further studying the molecular mechanism of GL2 regulation on the development of plant trichome.

trichome；GL2；map-based cloning；TTG1；genetic interaction

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.019

2016-04-15

國家自然科學基金項目（31470290），中央高?；究蒲袠I(yè)務費（2014YB036，Z109021537）

侍雙月，碩士研究生，研究方向：植物分子遺傳學；E-mail：zhongyu.best@163.com

安麗君，副教授，碩士生導師，研究方向：植物分子遺傳學；E-mail：lijunan@nwsuaf.edu.cn