宏基因組靶向測序分析皮膚表面微生物群落方法優(yōu)化

姚雪劉文麗裴廣倩童貽剛羅亞平

（1. 中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100038；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071）

宏基因組靶向測序分析皮膚表面微生物群落方法優(yōu)化

姚雪1劉文麗2裴廣倩2童貽剛2羅亞平1

（1. 中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100038；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071）

通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，篩選出盡可能真實(shí)反映含量較低的皮膚微生物群落的高通量測序分析方法。使用多因素多水平完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計，分析DNA提取、PCR擴(kuò)增、樣品采集、測序過程中各種實(shí)驗(yàn)因素對微生物群落組成特征分析結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，在樣品采集方面，篩選出了最佳的采集拭子與采集液體；在DNA提取方面，篩選出了最佳的前處理方法及試劑盒種類；在PCR反應(yīng)方面，篩選出了最佳的模板濃度及退火溫度；在測序方面，篩選出了合適的測序深度。通過一系列的實(shí)驗(yàn)條件篩選，確定了適合分析低含量細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成特征的方法，并成功地應(yīng)用于人類手掌面皮膚。

皮膚表面微生物群落；宏基因組靶向測序；16S rRNA基因

高通量測序技術(shù)的發(fā)展，揭示了人類皮膚表面（尤其是手掌面皮膚上）微生物（細(xì)菌）群落的組成有豐富的多樣性［1-7］。不同種族之間，由于受生活方式、環(huán)境條件等因素的影響，皮膚微生物群落的結(jié)構(gòu)組成差異明顯［8-10］。不同家庭的人之間其皮膚微生物群落的差異大于同一家庭內(nèi)部，而同一家庭內(nèi)部，不同個體之間的皮膚微生物群落特征存在差異性［11］。人手掌表面微生物的群落組成受性別、左右手習(xí)慣、洗手后時長的影響［12］。不同的個體其皮膚微生物群落結(jié)構(gòu)隨時間變化會產(chǎn)生一定的變動，而其變動規(guī)律、變化范圍也是因人而異的，在個體間存在明顯差異性［13］。

高通量測序技術(shù)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)步驟較多，每一步驟細(xì)微的差別都可能在最終的測序結(jié)果中放大，并造成測序結(jié)果、分析結(jié)果與實(shí)際情況的偏差［14］。首先，在提取微生物群落DNA的過程中，由于不同種類的細(xì)菌其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，而不同的DNA提取試劑盒裂解細(xì)胞、吸附DNA的原理、方法又各不相同，造成提取效率、提取質(zhì)量上的差異。其次，在PCR擴(kuò)增過程中，又存在多種引起PCR產(chǎn)物成分變化的因素，如不同引物對不同DNA模板的偏好性不同、退火溫度改變時也會引起擴(kuò)增效率的變化等等。再次，在測序過程中，使用不同的測序平臺、樣品的測序深度不同時，也會出現(xiàn)分析結(jié)果與實(shí)際情況的差異。

最新的研究顯示，實(shí)驗(yàn)設(shè)計會顯著地影響皮膚微生物組的分析結(jié)果。宏基因組shotgun測序與基于16S rRNA基因測序相比各有優(yōu)缺點(diǎn)。宏基因組shotgun測序可用于分析微生物群落的代謝途徑和基因功能，但其應(yīng)用受限于微生物群落DNA含量和參考基因組。一方面，在微生物群落DNA含量較低時，往往無法達(dá)到測序要求；另一方面，由于環(huán)境微生物中大多數(shù)微生物的序列仍未知，所以宏基因組數(shù)據(jù)中高達(dá)90%的序列由于缺少參考序列而不能被確定［15］。16S rRNA基因的測序結(jié)果由于有豐富參考序列可供比對，因此在物種識別上有很大優(yōu)勢。但由于16S rRNA基因并非單拷貝基因，即使在同一屬的不同種之間拷貝數(shù)都可能存在差異，因此其測序結(jié)果總體上來說僅僅是半定量的［16］，會使微生物群落的α多樣性及β多樣性的分析結(jié)果出現(xiàn)偏差。16S rRNA基因的通用引物的不同，會導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)特征分析結(jié)果的不同。這是因?yàn)橛糜谕ㄓ靡镌O(shè)計的保守區(qū)間，在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種之間可能保守性不足，導(dǎo)致某些種屬的細(xì)菌擴(kuò)增效率差，從而使得微生物群落的α多樣性及β多樣性的分析結(jié)果出現(xiàn)偏差。與宏基因組shotgun測序相比，實(shí)驗(yàn)16S rRNA基因的V1-V3區(qū)測序獲得的微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與之相似，而V4區(qū)測序獲得的微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果卻不盡人意［17］。在高通量測序過程中，模板的含量高低會對測序結(jié)果造成顯著影響［18］，因此研究各個實(shí)驗(yàn)因素對此類實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果的影響是非常必要的。

由于皮膚表面的微生物的含量與土壤、糞便等環(huán)境微生物相比含量較低，因此使用高通量測序技術(shù)分析皮膚表面的微生物群落結(jié)構(gòu)特征時，更容易受到實(shí)驗(yàn)過程中各個環(huán)節(jié)的影響，有必要對樣品采集、DNA提取、PCR擴(kuò)增、測序等各個實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的條件進(jìn)行篩選優(yōu)化。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，篩選出盡可能真實(shí)反映含量較低的皮膚微生物群落的高通量測序分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種來源 本論文實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌種類共計15種，包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、摩氏摩根菌（Morganella morganii）、脫氮假單胞菌（Pseudomonas denitrificans）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）等，所有菌種均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 BactoTMBrain Heart Infusion（Becton，Dickinson and Company Sparks，美國），細(xì)菌DNA提取試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司，中國），PowerSoil DNA Isolation Kit（MO BIO Laborotorise Inc， 美 國 ），High Pure PCR Template Preparation Kit（Roche Diagnostics GMbH， 德 國 ），H2O3-PRO 金屬?。ń疸y杏生物科技有限公司，中國），JY88-II DN 超聲波信號發(fā)生器（南京新辰生物科技有限公司，中國），TissueLyser II（QIAGEN，德國），Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems，美國），Qubit?2.0 Fluorometer（Life technologies，美國），Ion Torrent Personal Genome Machine（Life Technologies，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌菌種的培養(yǎng)及計數(shù) 菌種從-70℃冰箱取出后，于BHI固體培養(yǎng)基上劃線，放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌落形成以后挑取單克隆于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃空氣搖床中培養(yǎng)至對數(shù)期。然后將菌液按梯度稀釋后，選取稀釋度為10-7、10-8、10-9的菌液100 μL涂布于BHI固體培養(yǎng)基上（每個稀釋梯度設(shè)置3個重復(fù)），放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，菌落形成后計數(shù)。

1.2.2 影響提取細(xì)菌群落DNA效率的因素分析 挑選菌液濃度在1.0×108個/mL以上的細(xì)菌，稀釋至1.0×108個/mL的濃度，然后等比例混合，形成濃度為1.0×108個/mL的模擬細(xì)菌群落。并選用一定濃度1.0×108個/mL的模擬細(xì)菌群落，將濃度稀釋為1.0×107個/mL的模擬細(xì)菌群落。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計為有重復(fù)的3因素混合水平實(shí)驗(yàn)，主要考查3種DNA提取的前處理方法（65℃加熱處理10 min、超聲2 s，間隔3 s，功率18%，處理10 min、30 Hz勻漿處理5 min）、3種DNA提取試劑盒（SimGen、MoBio、Roche）在提取兩種濃度不同（1.0×108個/mL、1.0×107個/mL）的模擬細(xì)菌群落時獲得的DNA質(zhì)量、數(shù)量（表1）。本部分實(shí)驗(yàn)做了3次重復(fù)，分別標(biāo)記為A組、B組、C組，提取到的DNA使用1%瓊脂糖凝膠，140 V電壓下電泳30 min后凝膠攝像。A組、B組、C組提取到的DNA均使用Qubit 2.0熒光定量。

表1 影響提取細(xì)菌群落DNA效率分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計

1.2.3 影響模擬細(xì)菌群落PCR擴(kuò)增效率的因素分析

為了盡可能減小引物偏好性對最終測序結(jié)果的影響，本部分實(shí)驗(yàn)所用模擬細(xì)菌群落模板制備方法為分別使用單克隆菌液提取DNA，Qubit 2.0定量后統(tǒng)一將稀釋為2 ng/μL，等比例混合之后梯度稀釋為1、0.5、0.25和0.125 ng參與PCR反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計為無重復(fù)的兩因素混合水平實(shí)驗(yàn)，主要考查模板量（4、2、1、0.5、0.25和0.125 ng）和退火溫度（55℃、60℃、65℃）2個因素對測序結(jié)果的影響。本部分實(shí)驗(yàn)選取引物為皮膚微生物組研究中使用廣泛的擴(kuò)增16S rRNA基因V1-V2區(qū)的通用引物：F27（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），R338（5'-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'）。PCR體系為50 μL體系：Q5 High-Fidelity 2×Master Mix 25 μL，上下游引物（每個處理所用引物均在5'端帶有4 bp barcode，引物濃度為10 pmol）各1 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL。PCR條件：預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火55℃/60℃/65℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，25個循環(huán)；延伸7 min。該部分實(shí)驗(yàn)根據(jù)退火溫度的不同分為3組（標(biāo)記為D組、E組、F組），同時在3臺9700 PCR儀上擴(kuò)增，每組設(shè)置一個陰性對照，不添加模板DNA。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、Qubit 2.0熒光定量，濃度大于10 ng/μL的PCR產(chǎn)物建庫后使用Ion torrent PGM測序儀測序。

1.2.4 影響采集細(xì)菌群落DNA效率的因素分析 將菌液分別稀釋至107個/mL，等比例混勻后充分渦旋震蕩，形成107個/mL的模擬群落。吸取100 μL混合模擬群落的菌液，滴于載玻片上，待其完全干燥后，用于該部分采集實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)操作均在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行）。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計為三因素混合水平實(shí)驗(yàn)，主要考查3種樣品采集工具（圓頭棉簽、尖頭棉簽、尼龍簽）、3種前處理方法（加熱、超聲、勻漿）、2種采集液體（PBS緩沖液、0.1% Tween 20+0.15 mol/L NaCl）在采集微量模擬細(xì)菌群落（106個）時，會對測序結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響。本部分實(shí)驗(yàn)設(shè)置為G、H兩組，G組實(shí)驗(yàn)使用Roche High Pure PCR Template Preparation Kit提取，H組實(shí)驗(yàn)使用Mo Bio PowerSoil DNA Isolation Kit提取，然后根據(jù)Ⅱ部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用最優(yōu)的PCR條件擴(kuò)增16S rRNA基因V1-V2區(qū)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、Qubit 2.0熒光定量，濃度大于10 ng/μL的PCR產(chǎn)物建庫后使用Ion torrent PGM測序儀測序。

1.2.5 測序深度對皮膚微生物組結(jié)構(gòu)特征分析的影響分析 樣品采集自一名29歲健康女性左右兩手手掌部皮膚，在其洗手3 h后采樣（因?yàn)橄词謺鹌つw表面細(xì)菌群落的改變）。

測序平臺選擇目前應(yīng)用廣泛的Ion Torrent Personal Genome Machine，測序深度設(shè)置為10000條/樣品、20 000條/樣品及40 000條/樣品。樣品采集方式、DNA提取方法、PCR反應(yīng)條件均選用前三部分實(shí)驗(yàn)篩選出的條件。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、Qubit 2.0熒光定量后建庫、測序。測序結(jié)果使用QIIME1.8.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌菌種的培養(yǎng)及計數(shù)

細(xì)菌菌落計數(shù)結(jié)果及推算的細(xì)菌菌液濃度見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌種類及濃度

2.2 影響提取細(xì)菌群落DNA效率的因素分析

圖1為A組實(shí)驗(yàn)重復(fù)的電泳圖，從圖中可以看出，3種試劑盒中，Simgen試劑盒提取的DNA含量最低，電泳檢測的條帶微弱甚至沒有；MoBio試劑盒在配合各種前處理方法時均能得到整齊的基因組DNA條帶；而Roche試劑盒在配合各種前處理方法時除了能提取出基因組DNA，同時還能提取到其他一些小片段DNA。B組實(shí)驗(yàn)重復(fù)和C組實(shí)驗(yàn)重復(fù)所獲電泳圖檢測結(jié)果與A組類似。

對A、B、C三組重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得的DNA濃度測量值使用SPSS 21.0進(jìn)行方差分析和多重比較分析，發(fā)現(xiàn)試劑盒種類和模擬細(xì)菌群落的濃度對最終DNA提取的濃度有極顯著影響，而不同的前處理方法對最終DNA提取的濃度沒有顯著影響。多重比較分析顯示，Roche試劑盒相對于Simgene試劑盒存在極顯著差異，而Roche試劑盒與MoBio試劑盒、MoBio試劑盒與Simgene試劑盒之間存在顯著差異；模擬細(xì)菌群落中不同細(xì)菌濃度之間（1.0×108個/mL、1.0×107個/mL）也存在極顯著差異。綜合考慮3種不同的試劑盒在DNA提取的數(shù)量和質(zhì)量上的結(jié)果，決定選取Roche試劑盒和MoBio試劑盒進(jìn)入下一階段的實(shí)驗(yàn)?？疾椴煌脑噭┖屑扒疤幚矸椒▽y序結(jié)果的影響。

圖1 A組重復(fù)DNA提取結(jié)果電泳圖

2.3 影響模擬細(xì)菌群落PCR擴(kuò)增效率的因素分析

測序結(jié)果使用CLC DNA Workbench處理分析，統(tǒng)計各個種類細(xì)菌16S rRNA基因序列的條數(shù)。模擬細(xì)菌群落中，由于各種細(xì)菌DNA的總量、基因組DNA大小、以及16S rRNA基因拷貝數(shù)已知，因此各種細(xì)菌的16S rRNA基因拷貝總數(shù)及比例可以計算得出。使用SPSS 21.0軟件對實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計結(jié)果和模擬群落的細(xì)菌組成比例相似性進(jìn)行分析，使用Euclidean 距離（0.142）、Chebychev距離（0.070）、平方 Euclidean 距離（0.020）等方法分析的結(jié)果均顯示，在退火溫度為55℃、模板濃度為2 ng的條件下，PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果中各種細(xì)菌的比例與實(shí)際投入的模擬群落的細(xì)菌組成比例最為接近。

2.4 影響采集細(xì)菌群落DNA效率的因素分析

測序結(jié)果使用CLC DNA Workbench處理分析，統(tǒng)計各個種類細(xì)菌16S rRNA基因序列的條數(shù)。由于各種細(xì)菌的數(shù)量，以及16S rRNA基因拷貝數(shù)已知，各種細(xì)菌的16S rRNA基因拷貝總數(shù)及比例可計算得出。使用SPSS 21.0軟件對統(tǒng)計結(jié)果和模擬群落的細(xì)菌組成比例相似性進(jìn)行分析，使用Euclidean 距離（0.276）、Chebychev距離（0.179）、平方 Euclidean距離（0.076）等方法分析的結(jié)果均顯示，選用尖頭棉簽或尼龍簽，蘸取0.1% Tween 20+0.15 mol/L NaCl采集樣品后，經(jīng)過超聲前處理，再使用Roche High Pure PCR Template Preparation Kit提取DNA，能使得PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果中各種細(xì)菌的比例與實(shí)際投入的模擬群落的細(xì)菌組成比例最為接近。

2.5 測序深度對皮膚微生物組結(jié)構(gòu)特征分析的影響分析

測序結(jié)果使用QIIME 1.8.0軟件進(jìn)行分析。選擇質(zhì)量＞20且長度＞200 bp的序列進(jìn)行分析，根據(jù)97%的序列相似性進(jìn)行OTU的劃分。結(jié)果（表3）顯示，在序列條數(shù)少于10 000條時，隨著測序深度增加，樣品中可檢測到的OTU種類呈迅速增加的趨勢，但當(dāng)測序序列的數(shù)目在10 000-20 000條之間時，檢測到OTU種類的增長較為緩慢。測序數(shù)據(jù)達(dá)到30 000條之后就趨于平臺期。因此，在分析此類樣品時，測序序列選擇在20 000-30 000條之間較為合適。將所有樣品中獲得的OTU種類的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計，占比例最高的4個屬分別是Propionibacterium、Corynebacterium、Staphylococcus及Ochrobactrum（圖2，編號同表2）。

表3 不同測序深度下獲得的OTU數(shù)目及種的數(shù)目

使用加權(quán)unifrac距離對不同測序深度的樣品間的群落組成相似度進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，不同測序深度的左手手掌的樣品間加權(quán)unifrac距離為0.086 717-0.154 386，而不同重復(fù)的右手手掌的樣品間加權(quán)unifrac距離為0.084 148-0.142 199，左右兩只手掌樣品間的加權(quán)unifrac距離為0.130 406-0.246 853。因此，不論測序深度存在怎樣的差異，左右兩只手掌間的皮膚微生物組群落組成還是存在顯著差異的?；诩訖?quán)unifrac距離的UPGMA建樹（圖3，編號同表3）顯示自兩只手掌的樣品各自聚類成一枝。

圖2 不同樣品在屬一級上的相對豐度

圖3 基于加權(quán)unifrac距離的UPGMA建樹

3 討論

DNA測序技術(shù)的發(fā)展確立了宏基因組學(xué)在科學(xué)研究領(lǐng)域中的地位，但由于第一代測序方法存在低通量的原因，限制了所能研究的樣品的物種復(fù)雜度［19，20］。利用新一代測序技術(shù)對來自大量手掌皮膚樣本的研究，獲得了更深度的DNA樣品序列信息［21，22］。極大促進(jìn)了更深入的挖掘人類皮膚微生物的種類，拓展了人們對皮膚微生物群落組成的認(rèn)識。因此，新一代高通量測序技術(shù)促進(jìn)了皮膚微生物組群落結(jié)構(gòu)應(yīng)用于法庭科學(xué)人身同一認(rèn)定的發(fā)展。Fierer等［12］研究了51名志愿者雙手上的皮膚微生物群落，平均每人每只手上有156種系統(tǒng)發(fā)育型（phylotype）。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著測序深度的增加，手掌面皮膚上細(xì)菌OTU的種類平均可達(dá)510種，說明測序深度的增加會使得皮膚生物群落的分析更加詳盡。

美國印第安人Yanomami部落是與外界接觸非常少的一個族群，其皮膚微生物組的優(yōu)勢屬為 Staphylococcus、Corynebacterium、Neisseriaceae及 Propionibacterium［9］。Leung等［10］的 研 究 結(jié)果顯示，黃種人皮膚上細(xì)菌的優(yōu)勢屬主要是Propionibacterium、Corynebacterium、Staphylococcus及Enhydrobacter，且黃種人手掌部皮膚微生物群落的結(jié)構(gòu)組成與美國白種人有顯著差異。在本文的實(shí)驗(yàn)中，從志愿者手掌皮膚上所取樣品里占比例最高的4個屬分別是Propionibacterium、Corynebacterium，Staphylococcus及Ochrobactrum，與Leung等的結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化篩選出的適合于分析人類皮膚微生物組的實(shí)驗(yàn)方法如下：選用尖頭棉簽或尼龍簽，蘸取0.1% Tween 20+0.15 mol/L NaCl采集樣品，超聲處理后使用Roche High Pure PCR Template Preparation Kit試劑盒提取DNA，PCR退火溫度為55℃，模板濃度為2 ng時，16S rRNA基因V1-V2區(qū)的測序數(shù)據(jù)分析的細(xì)菌群落組成結(jié)果與模擬細(xì)菌群落中各種細(xì)菌的含量比例最為接近。測序深度達(dá)到20 000-30 000條時即可以滿足后續(xù)細(xì)菌群落多樣性分析的要求。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Optimization of Method for Analyzing Microbial Community on Human Skin by Targeted Sequencing of Metagenomics

YAO Xue1LIU Wen-li2PEI Guang-qian2TONG Yi-gang2LUO Ya-ping1
（1. School of Criminal Science and Technology，People’s Public Security University of China, Beijing 100038；2. Institute of Microbiology and Epidemiology，the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071）

Based on the experimental design and data analysis, we screened a high-throughput sequencing method which may measure the community of microorganisms in a low level on the human skin as real as possible. By completely random design of the experiments with multi-factor multi-level, we analyzed the effects of varied factors in the DNA extraction, PCR amplification, sample collection and sequencing on the composition characteristics of microbial community. The results showed that regarding the sample collection, the optimal collection swab and extraction liquid were screened out. In the aspect of DNA, the optimal pretreatment method and reagent box type were selected; on PCR reaction, the optimal template concentration and annealing temperature were determined; and on the sequencing aspect, the suitable sequencing depth was also chosen. In conclusion, through above series of experiments to screen the conditions, the appropriate method for analyzing the composition characteristics of community structure of bacteria in a low level was determined, and successfully applied to human palm skin.

microbial community on human skin；targeted sequencing of metagenomics；16S rRNA gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.016

2016-03-28

北京市科技新星計劃交叉學(xué)科合作課題（xxhz201510），上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院現(xiàn)場物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2014XCWZK14）

姚雪，女，博士研究生，研究方向：刑事科學(xué)技術(shù)；E-mail：yaoxue1986@163.com