不同沉淀方法處理膠乳總RNA對基因擴增效率的影響

吳春太黎瑜馮偉瑜曾日中

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室 海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室，儋州 571737；2. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228）

不同沉淀方法處理膠乳總RNA對基因擴增效率的影響

吳春太1黎瑜1馮偉瑜2曾日中1

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所 農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室 海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點實驗室，儋州 571737；2. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228）

為探明沉淀方法對膠乳總RNA提取及PCR擴增效率的影響，并尋求較好的RNA沉淀方法，針對膠乳中蛋白、多糖、橡膠粒子含量高的特點，在本實驗室改進的SDS法的基礎(chǔ)上，分別用LiCl、NaCl+異丙醇、NaCl+NaAc+無水乙醇和NaAc+無水乙醇對橡膠樹膠乳總RNA進行沉淀，并對所得RNA的完整性、純度、含量和RT-PCR擴增效率進行比較。結(jié)果表明，4種方法均可獲得完好的RNA，但其純度、含量和PCR擴增效率隨方法不同而有所差別，其中NaCl+NaAc+無水乙醇沉淀的橡膠樹膠乳總RNA純度、產(chǎn)率和18S、REF基因擴增效果均較高，故認為用NaCl+NaAc+無水乙醇沉淀膠乳總RNA是一種較為有效的方法。

橡膠樹膠乳；總RNA提?。籖NA沉淀

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是熱帶山地主要的經(jīng)濟作物，種植面積大，林產(chǎn)品產(chǎn)量高，其林產(chǎn)品是由膠工通過周期性切割橡膠樹樹干樹皮（即割膠）刺激乳管細胞釋放出的天然膠乳，是一種豐富的天然橡膠資源。因其膠乳量極為豐富，并且干膠含量較高，已廣泛應(yīng)用于商業(yè)、防御和運輸?shù)刃袠I(yè)［1］。從分子生物學(xué)的角度分析膠乳的形成機制將有助于對天然橡膠生產(chǎn)過程的全面了解。高質(zhì)量膠乳總RNA的提取是研究橡膠樹膠乳形成分子機制的基礎(chǔ)。目前已報道的橡膠樹RNA提取方法主要有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、十二烷基硫磺酸鈉（SDS）法、異硫氰酸胍法、Trizol試劑盒法等［2-4］，盡管不同的橡膠樹組織及在不同生理狀態(tài)下的供試材料，其細胞與組織的成分各不相同，但這些方法對于不同生理狀態(tài)橡膠樹的根、樹皮、花、葉和膠乳都有其一定的適用性，其中SDS法及試劑盒法是近年來常用的提取膠乳RNA方法，且沉淀膠乳RNA的常用方法有異丙醇沉淀法、乙醇沉淀法和LiCl沉淀法［3-7］。已有研究表明，橡膠樹膠乳中富含的蛋白、多糖、橡膠粒子等成分，在一定程度上使提取高質(zhì)量膠乳RNA成為困難［8，9］。集中表現(xiàn)為膠乳中高含量的蛋白質(zhì)難以有效去除，導(dǎo)致提取的RNA純度不高；膠乳的橡膠粒子含量達到了30%-50%，嚴重地影響RNA提取。本研究針對橡膠樹膠乳的特點，在本實驗室改良的SDS法［4］的基礎(chǔ)上，分別用4種單方或復(fù)方沉淀劑對RNA進行沉淀，并將不同沉淀方法獲得的橡膠樹膠乳總RNA和以核糖體18S rRNA基因和膠乳優(yōu)勢表達基因橡膠延伸因子REF（rubber elongation factor）mRNA作為研究對象的擴增效果進行比較，找出受蛋白和橡膠粒子干擾最小的沉淀劑，改進RNA沉淀方法，旨在為提高改良SDS法提取膠乳總RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為大規(guī)模推廣級橡膠樹優(yōu)良品種熱研7-33-97，林段位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院（儋州）試驗場十二隊，種植于2005年，至2012年開割，實驗當年為3 a割齡的成齡幼樹。

1.2 方法

1.2.1 膠乳的采集 橡膠樹割膠后，棄去前30 s流出的膠乳，然后引流膠乳滴入保溫瓶里的液氮中，采集好的膠乳分裝入40 mL的保鮮管內(nèi)，并將保鮮管放入裝有液氮的保溫瓶中帶回實驗室，可直接用于RNA提取，或-80℃冰箱中保存待用。

1.2.2 總RNA的提取 根據(jù)所處理樣品的特性，對本實驗室改進的SDS法略作了改良：在沉淀RNA時設(shè)計了4個處理。因此，本實驗使用改良SDS法提取橡膠樹膠乳總RNA的具體操作如下：

（1）量取2 mL新鮮膠乳或-80℃保存的樣品迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷（4℃）的含有2 mL 2×SDS提取液（0.1 mol/L Tris-HCl，0.3 mol/L LiCl，10 mmol/L EDTANa2，100 g/L SDS，pH9.5）的EP管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），渦旋振蕩5 min至充分混勻，4℃、12 000 r/min 離心 10 min。

（2）將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的EP管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），渦旋振蕩5 min至充分混勻，4℃、12 000 r/min 離心10 min。

（3）將上清轉(zhuǎn)移到另一新的EP管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），渦旋振蕩5 min至充分混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min。

（4）將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的EP管中，隨后從上清液中取樣并等量分裝于4個新的EP管中，每管作不同處理。處理A：上清液中加入1/3體積的8 mol/L LiCl，使其終濃度為2 mol/L，-20℃沉淀RNA 2 h以上，4℃、15 000 r/min離心25 min。處理B：加入1/4體積的5 mol/L NaCl，再加入總體積1倍的-20℃預(yù)冷的異丙醇，-20℃放置2 h以上，4℃、15 000 r/min離心25 min。處理C（乙醇沉淀法I）：加入1/4體積的5 mol/L NaCl和1/10體積的3 mol/L NaAc（pH5.2），再加入總體積2.5倍-20℃預(yù)冷的無水乙醇，-20℃放置2 h 以上，4℃、15 000 r/min離心25 min。處理D（乙醇沉淀法II）：加入1/10 體積3 mol/L NaAc（pH5.2），再加入總體積2.5倍-20℃預(yù)冷的無水乙醇，-20℃放置2 h，4℃、15 000 r/min離心25 min。

（5）4℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清。

2）消除設(shè)計不足造成的質(zhì)量問題。對有問題的質(zhì)量工程應(yīng)通過設(shè)計方案的改進來治理。要力促設(shè)計人員與施工人員做好技術(shù)交底和會審，對交底中反映出的質(zhì)量問題要逐一加以研究解決。如果設(shè)計方案細致周到，即使工程造價難以降低，也可以有效的減少工程質(zhì)量問題，從而減少建設(shè)后的維護費用。

（6）用70%乙醇洗滌RNA沉淀3次。

（7）4℃、15 000 r/min離心15 min，棄乙醇。

（8）將RNA沉淀置于超凈臺內(nèi)晾干，加入20 μL無菌DEPC·H2O溶解沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總RNA的質(zhì)量檢測

1.2.3.1 RNA含量與純度的紫外光吸收法檢測 取1 μL總RNA溶液，加入DEPC-H2O稀釋至200 μL，用紫外分光光度計測定其在230、260、280 nm波長下的紫外吸光值（A），每個樣品重復(fù)3次，取平均值。計算A260nm/A280nm、A260nm/A230nm值，判定其純度。并按照下式計算總RNA的得率：

1.2.3.2 RNA完整性與純度的電泳法檢測 用1×TBE電泳緩沖液配制含0.5 μg/mL溴化乙錠（EB）的12 g/L瓊脂糖凝膠，取1-1.5 μg RNA（由原液換算成）與適量的loading buffer混勻后上樣，90 V電泳30 min，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照記錄。并利用Quantity One軟件分析電泳條帶的光密度。

1.2.3.3 RNA質(zhì)量及完整性的RT-PCR檢測 為了進一步驗證RNA的質(zhì)量，以等摩爾的上述總RNA樣品作為反轉(zhuǎn)錄的模板，采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（#K1621；Fermentas，Lithuania）并按照其操作程序合成第一鏈cDNA，并以稀釋10倍的此1st cDNA為模板。PCR擴增反應(yīng)采用20 μL反應(yīng)體系，在該體系中，加入了cDNA 2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa）10 μL，上游和下游引物各 0.5 μL，無核酸酶的雙蒸水7 μL。PCR程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃終延伸7 min，4℃保存。檢測RNA質(zhì)量引物根據(jù)橡膠樹18S rRNA和延伸因子（REF）序列設(shè)計，Hb18SF：5'-GGTCGCAAGGCTGAAACT-3'，Hb18SR：5'-ACGGGCGGTGTGTACAAA-3'；RefF1：5'-GGCTACAGTTTATGCCAGGGCT-3'，RefR1：5'-GACGGGTCTAACCACGCTCTTA-3'，所有引物由上海英駿生物公司合成。

2 結(jié)果

用紫外分光光度法測定不同沉淀方法得到的膠乳總RNA純度，結(jié)果如表1所示，LiCl沉淀法所得 RNA的 A260nm/A280nm為 2.04-2.16，A260nm/A230nm均大于2.0；異丙醇沉淀法所得RNA的A260nm/A280nm為2.04-2.16，A260nm/A230nm均大于1.9；乙醇沉淀法I所得 RNA的 A260nm/A280nm為 2.05-2.12，A260nm/A230nm均大于1.8；乙醇沉淀法II所得RNA的A260nm/A280nm為2.03-2.11，A260nm/A230nm均大于1.8。這表明4種方法所沉淀的終產(chǎn)物含多糖、多酚、DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較少，RNA純度較高。

表1 橡膠樹膠乳組織總RNA的產(chǎn)量和純度（x-±s）評價

2.2 不同方法沉淀的RNA完整性比較

對不同方法沉淀的橡膠樹膠乳RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，4種方法的電泳結(jié)果見圖1。前3泳道的28S、18S兩個條帶均完整清晰，且前者的亮度約是后者的1.26-1.33倍，表明前3種方法提取的RNA降解少，完整性好，基本沒有DNA、多糖和蛋白污染；而泳道4出現(xiàn)一條清晰5S條帶，且28S的亮度僅為18S的1.02倍，說明泳道中RNA出現(xiàn)降解，其原因可能是乙醇沉淀法II提取的RNA中存在RNA水解酶的污染。

圖1 橡膠樹膠乳總RNA的電泳檢測結(jié)果

2.3 不同沉淀方式對RNA得率的影響

由表1可知，LiCl沉淀法、異丙醇沉淀法、乙醇沉淀法I和乙醇沉淀法II沉淀的RNA的平均產(chǎn)量分別為24.17、33.51、39.36、和23.40 μg/g鮮重，但差異顯著性檢驗結(jié)果表明4種方法間均無明顯差異。結(jié)合2.1和2.2分析結(jié)果說明，用這4種方法得到的RNA可用于cDNA合成或RT-PCR擴增等分子實驗。而且異丙醇沉淀法、乙醇沉淀法I的變異系數(shù)分別比乙醇沉淀法II的93.40%小45.91%、39.33%，前二者產(chǎn)量高且穩(wěn)定，還能滿足RNA用量大的Northern分析等實驗的需要。

2.4 沉淀方式對18S和REF基因擴增效果的影響

實驗利用4種沉淀法成功地從橡膠樹新鮮膠乳中提取了RNA，并對不同沉淀方法提取的總RNA分別進行反轉(zhuǎn)錄，再以兩對基因特異性引物（18S、REF1）分別對4種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進行RT-PCR擴增，PCR反應(yīng)體系中其余成分及其濃度完全一致，PCR循環(huán)參數(shù)均相等。RT-PCR檢測結(jié)果（圖2）顯示，各方法分別在500、100 bp左右得到一條清晰的RT-PCR擴增條帶，特異性強，無雜帶出現(xiàn)；擴增產(chǎn)物大小與設(shè)計的長度529、124 bp相符，即為所要擴增的目的基因片段?？梢姡@4種方法提取的RNA均能滿足RT-PCR技術(shù)對擴增帶長度的要求。

圖2 不同質(zhì)量的cDNA對PCR效率的影響

圖2還顯示，cDNA模板來源對18S、REF擴增結(jié)果的影響主要表現(xiàn)在條帶豐度隨其來源的不同而不同。當擴增18S的模板cDNA為乙醇沉淀法I時呈現(xiàn)出較為清晰條帶，并且當模板為乙醇沉淀法II時最為清晰，當模板cDNA為LiCl沉淀法、異丙醇沉淀法時，擴增條帶逐漸變淡；其中，乙醇沉淀法I的18S表達量分別是LiCl沉淀法、異丙醇沉淀法18S的1.38、2.50倍，乙醇沉淀法II的18S的表達量分別是LiCl沉淀法、異丙醇沉淀法18S的1.44、2.61倍。當擴增REF的模板為異丙醇沉淀法時擴增條帶很淺，LiCl沉淀法為模板時與異丙醇沉淀法時相比擴增條帶略微清晰，乙醇沉淀法I和乙醇沉淀法II同LiCl沉淀法相比擴增條帶表現(xiàn)出逐漸清晰的趨勢；其中，乙醇沉淀法I的REF表達量分別是LiCl沉淀法、異丙醇沉淀法REF的1.40、1.75倍，乙醇沉淀法II中REF的表達量分別是LiCl沉淀法、異丙醇沉淀法REF的1.12、1.40倍。這說明乙醇沉淀法I、乙醇沉淀法II提取的RNA均能滿足RT-PCR技術(shù)對擴增帶豐度的要求。

3 討論

橡膠樹膠乳組織中含有大量的多糖、蛋白類物質(zhì)，嚴重干擾完整RNA的提取，進而影響下游的實驗操作。去除多糖的方法很多，除通常的低濃度乙醇沉淀法［10］和醋酸鉀沉淀法［11］外，還可通過提高緩沖液中NaCl濃度也有助于去除多糖［12］。本實驗主要使用了含有Tris-HCI、LiCl、EDTA-Na2的SDS提取液，并通過在RNA沉淀時結(jié)合使用乙醇+醋酸鈉、乙醇+氯化鈉+醋酸鈉，對SDS法進行改良，最后去除多糖的效果均較好。

在沉淀方法上，本研究采用了4種方法沉淀橡膠樹膠乳RNA，這幾種方法都能獲得18S、28S帶型清晰、完整性好、純度和產(chǎn)率高的總RNA，完全適用于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。但是在沉淀質(zhì)量、產(chǎn)量、成本等方面，不同方法是有差別的。例如，從提取RNA的電泳圖、吸光度比值以及逆轉(zhuǎn)錄后內(nèi)參基因18S和目標基因REF的qRT-PCR檢測值，可以明顯地看出乙醇結(jié)合NaCl和NaAc沉淀法與LiCl沉淀法、NaCl +異丙醇沉淀法以及NaAc +乙醇沉淀法沉淀的結(jié)果相比，其RNA的完整性、得率和基因擴增效果的優(yōu)勢均明顯。盡管用LiCl沉淀的RNA完整性比NaCl和異丙醇，NaAc和乙醇沉淀的RNA完整性更好，但用NaCl和異丙醇沉淀的RNA產(chǎn)量比LiCl，NaAc和乙醇沉淀的RNA產(chǎn)量高，其中LiCl沉淀時導(dǎo)致RNA產(chǎn)率低的可能原因是LiCl專門沉淀溶液中的高分子量RNA。而且，使用NaCl +異丙醇、NaCl + NaAc +乙醇、NaAc +乙醇沉淀RNA比用LiCl沉淀RNA所需要的成本低。綜上所述，在4種RNA沉淀方法中，以NaCl + NaAc +乙醇沉淀法最優(yōu)。筆者應(yīng)用該方法還成功地提取了杜仲、橡膠草的膠乳RNA，說明該方法可以適用于大多數(shù)產(chǎn)膠植物膠乳的提取，這對膠乳RNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)研究具有重要的現(xiàn)實意義。此外，用乙醇結(jié)合兩種高濃度單價鹽沉淀的方法富集RNA，既提高了總RNA的濃度，同時也相應(yīng)地提高了miRNA的濃度，進而為miRNA后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。

據(jù)文獻報道，用于SDS法提取橡膠樹膠乳總RNA的沉淀方法主要有LiCl沉淀法和乙醇沉淀法［13］。也有研究者將這兩種沉淀法同步或分步結(jié)合使用，如黃貴修等［14］先使用終濃度為0.3 mol/L的LiCl和2.5倍體積冰乙醇/等體積異丙醇-20℃下沉淀RNA 30 min，隨后進行離心和去上清，并對沉淀作溶解處理；當沉淀完全溶解時，再使用終濃度為2 mol/L的LiCl冰浴下沉淀1 h，所獲橡膠樹膠乳總RNA的純度、完整性和產(chǎn)量均較高，可以滿足Northern雜交實驗的要求。曾日中等［4］先使用終濃度為2 mol/L的LiCl -20℃條件下沉淀RNA過夜，然后進行離心和去上清，并對沉淀作溶解處理，當沉淀溶解充分時，再使用終濃度為2 mol/L的LiCl -20℃下沉淀2 h，隨后離心，棄上清，并充分溶解沉淀，最后使用終濃度為0.3 mol/L的NaAc和2.5倍體積的無水乙醇-20℃沉淀l h，實驗獲得質(zhì)量較好的膠乳總RNA，可以滿足cDNA消減文庫構(gòu)建的要求。同時也發(fā)現(xiàn)，上述RNA沉淀劑LiCl和乙醇的兩種結(jié)合方法，其環(huán)節(jié)多，耗時長，成本高。張治禮等［15］采用2倍體積無水乙醇沉淀RNA 10 min，所得RNA完整性較好，純度和得率較高，可以滿足RT-PCR和RACE實驗的要求，但泳道中出現(xiàn)一條十分明顯的5S條帶，其亮度顯著超過28S和18S的值。由此可見，該法更有利于小分子量RNA沉淀。而本研究的NaCl+NaAc+乙醇沉淀法則彌補了傳統(tǒng)沉淀法步驟較繁瑣和小分子量RNA含量高等不足。

4 結(jié)論

通過對RNA提取的沉淀步驟研究，發(fā)現(xiàn)沉淀劑的選擇對RNA提取量與品質(zhì)的影響較大，采用NaCl、NaAc和無水乙醇配合沉淀RNA，能明顯提高RNA純度和產(chǎn)率，完全滿足相應(yīng)的分子實驗要求，還節(jié)省成本和時間。由此，改良的SDS酸酚法更適合橡膠樹膠乳總RNA提取。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Effects of the Latex Total RNA Precipitated with Different Methods on Amplification Efficiency

WU Chun-tai1LI Yu1FENG Wei-yu2ZENG Ri-zhong1
（1. Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree，Ministry of Agriculture，the People’s Republic of China/Hainan Provincial Key Laboratory of Physiology for Tropical Crops，Danzhou 571737；2. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228）

This work is to find out the effects of different precipitation methods on the latex total RNA and amplification efficiency of PCR as well as to seek the better precipitation method. According to the characteristics that Herva brasiliensis latex was rich in proteins，polysaccharides and rubber particles，on the basis of SDS method modified in our laboratory，the total RNA in the latex of H. brasiliensis was precipitated respectively with LiCl，NaCl + isopropanol，NaCl + NaAc + absolute ethanol，and NaAc + absolute ethanol，and then the integrity of the RNA，purity，content，and RT-PCR amplification efficiency were compared. The results indicated that complete RNA was obtained by any of 4 methods. But the differences in purity and content of RNA and amplification efficiency of RT-PCR among 4 methods were also observed. In which the purity and yield of total RNA precipitated with NaCl + NaAc + absolute ethanol and 18S and REF gene amplification efficiency of latex tissues in rubber tree were higher，indicating that NaCl + NaAc + absolute ethanol was effective method to precipitate total RNA.

Hevea brasiliensis latex；total RNA extraction；RNA precipitation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.014

2016-03-28

國家自然科學(xué)基金資助項目（31270713），橡膠研究所基本科研業(yè)務(wù)費資助項目（1630022012008）

吳春太，男，博士，副研究員，研究方向：橡膠樹產(chǎn)膠特性研究，E-mail：chuntaiwu@163.com；黎瑜同為本文第一作者

曾日中，男，博士，研究員，研究方向：橡膠樹產(chǎn)膠分子生物學(xué)研究；E-mail：hnzrz@aliyun.com