功能性分子標記在小麥育種中的應用

劉國圣 張大樂

（河南大學生命科學學院，開封 475000）

功能性分子標記在小麥育種中的應用

劉國圣 張大樂

（河南大學生命科學學院，開封 475000）

功能標記是根據與表型緊密相關的功能基因內部特定區(qū)域的多態(tài)性序列，利用關聯(lián)分析、表達譜分析、RNA干擾和QTL作圖等方法開發(fā)而出的一種新型顯性分子標記，此類標記可以對不同遺傳背景下目標等位基因的有無作直接、快速的判定。簡單介紹了功能標記的概念及特點，著重探討功能標記作為一種輔助育種手段在小麥育種中的應用及其開發(fā)前景，以期為相關分子標記的開發(fā)提供參考。

小麥；分子標記；功能基因；輔助育種

遺傳標記（genetic marker）是指在遺傳分析上用作標記基因的方法，它可追蹤染色體或染色體某一節(jié)段以及某一個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性，具有可遺傳性和可識別性的特征。遺傳標記主要包括形態(tài)標記（morphological maker）、細胞標記（cytological maker）、生化標記（biochemical maker）和分子標記（molecular maker）［1］。由于前3種遺傳標記可標記的位點少并且受外界環(huán)境因素的影響比較大，因而在實際應用中分子標記是遺傳分析上較為普遍采用的方法。

分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記和生化標記之后發(fā)展起來的一種較為理想的遺傳標記，它是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映［2，3］。分子標記具有較大的優(yōu)越性，如大多數分子標記為共顯性，對隱性性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；檢測手段簡單、迅速等。在過去的幾十年中，利用SSR（simple sequence repeats）、RFLP（restriction fragment length polymorphism）、AFLP（amplified fragment length polymorphisms）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）和DArT（diversity arraystechnology）等標記已構建了一些攜帶重要基因染色體區(qū)域的分子標記圖譜［4］。

然而，由于這些遺傳標記與目標基因具有一定距離，其預測值取決于標記與目標基因在特定群體中的連鎖程度，隨著繁殖代數增加，遺傳距離加大，其連鎖關系打破的概率會逐漸上升，使分子標記輔助選擇的準確性下降。相比之下，通過開發(fā)與表型相關的功能基因序列形成的功能標記已成為DNA分子標記的熱點，該標記為顯性標記，是分子育種中標記輔助選擇的理想標記。本文通過對功能標記作為輔助育種手段在小麥中的應用進行綜述，以期為相關分子標記的開發(fā)提供參考。

1 功能標記（functional makers，F(xiàn)Ms）的概念

Andersen 等將功能標記定義為基于與表型性狀緊密相關的功能基因內部的多態(tài)性序列而開發(fā)的分子標記［5］。相比隨機 DNA 分子標記（基于基因組中隨機多態(tài)性位點開發(fā)的標記）和與目的基因連鎖的分子標記（基于基因與基因之間的多態(tài)性位點開發(fā)的標記），功能標記直接反映作物的表型性狀。功能標記的特點可以歸為以下幾點：（1）可準確的檢測、鎖定目標基因；（2）遺傳效應值更加可靠；（3）能準確反應功能性等位基因的遺傳變異［6］。

功能標記開發(fā)的首要條件是明確與作物表型性狀緊密相關的功能基因，目前關于基因功能鑒定的方法是根據相似功能基因之間的序列同源性推測表達序列可能具有的功能。另外，表達譜分析等高通量的檢測方法、RNA干擾、T-DNA轉座子、轉座子基因標簽（插入突變體），QTL作圖、蛋白質數量位點（protein quantityloci，PQLs）、激活標記及病毒誘導基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）等也是鑒別功能基因的重要方法。目前，根據功能標記開發(fā)的兩種有效策略：關聯(lián)分析方法和建立近等位基因系群體，可將功能標記分為直接性功能標記和間接性功能標記。目前，已開發(fā)和利用最多的是直接性功能標記。

1.1 間接性功能標記（indirect functional marker，IFM）

功能性分子標記開發(fā)的前提條件是多態(tài)性的等位基因序列。間接性功能標記是一種以連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）為基礎的分子標記，是通過鑒定群體內的目標性狀與遺傳標記的關聯(lián)性而獲得的［8］，一個群體內不同座位等位基因之間的非隨機關聯(lián)被稱為連鎖不平衡。關聯(lián)性由關聯(lián)分析法計算得到，這種方法只在統(tǒng)計數據方面提供了基因序列與目標性狀之間關聯(lián)性的證據，具體的基因序列的多態(tài)性和目標性狀的關系還需要直接類型的功能性分子標記進行證明。

1.2 直接性功能性分子標記（direct functional maker，DFM）

直接性功能標記是通過直接比較近等基因系中功能基因序列差異開發(fā)的，其中的等位功能基因序列可以通過同源重組（homologous recombination，HR）和定向誘導基因組局部突變技術（targetinginduced local lesions in genomes，TILLING） 獲 得。TILLING技術具有快速、有效地鑒定和定向篩選突變的優(yōu)點［9］，通過借助高通量的檢測手段，可以對轉基因或化學誘變等途徑獲得的近等基因系進行點突變的鑒定。由于化學誘變會產生大量的點突變，并且檢測單個點突變仍然比較困難，因而可以將經過化學誘變的單株與其對照親本回交轉育，使其遺傳背景恢復到對照種水平構建近等基因系。利用化學誘變構建近等基因系并結合TILLING技術是目前最有效的檢測等位功能基因單核苷酸多態(tài)性的方法，由這種開發(fā)策略得到的功能性分子標記被稱為直接類型功能性分子標記。然而，由這種策略開發(fā)的直接性功能標記費用相對較高，目前通常采用的方法是首先通過關聯(lián)分析篩選候選功能基因，然后再利用獲得的近等基因系對等位功能基因序列直接比對，根據差異的核苷酸位點開發(fā)直接性功能標記。

2 功能性分子標記在中國小麥育種的應用

小麥是世界上最重要的糧食作物之一，全球有超過40%的人口以小麥為主食［11］。功能標記作為一種新型的DNA分子標記可以快速、準確地檢測小麥品種資源所攜帶的基因，有效地提高后代選擇的準確性［12，13］，從而縮短育種年限，加快育種步伐。目前，在小麥育種中已經開發(fā)的功能標記主要應用在種質資源純度鑒定、生長發(fā)育、抗病蟲、抗逆及品質改良等方面（表1）。

表1 小麥中已開發(fā)功能標記的目標基因

續(xù)表

2.1 在小麥抗病性中的應用

小麥條銹病是一種在世界范圍內普遍流行的氣傳性病害，嚴重威脅小麥生產，而我國又是世界最大的小麥條銹病流行區(qū)，條銹菌生理小種的高度變異是造成該病流行的重要原因。伍玲等［52］根據與Lr34/Yr18/Pm38緊密連鎖的STS標記csLV34和基于該基因第11外顯子等位變異開發(fā)了5對功能標記 cssfr1-cssfr5，利用這6對功能標記csLV34以及cssfr1-cssfr5對273個CIMMYT小麥品系的檢測結果和田間驗證結果一致性為 96.7%，表明功能標記csLV34和cssfr1-cssfr5 可準確鑒定小麥的白粉病、葉銹病和條銹病，可應用于小麥抗病育種。Liu等［54］克隆了3個與白粉病和條銹病相關基因PTaRtL、TaSBL和TaHLRG的完整ORF序列，并將PTaRtL和TaSBL的表達定位在細胞膜和細胞核上。根據TaHLRG基因序列開發(fā)了一個功能標記THR1，利用缺體-四體系將TaHLRG定位在小麥的6A染色體上。ANOVA分析結果驗證了TaHLRG與小麥條銹病成株抗性的相關性。在對白粉病表現(xiàn)有成株抗性的DH群體白農64/京雙16和F2：3群體魯麥21/京雙16中，TaHLRG可分別解釋抗、感表型變異的9.3%-9.7%和11.9%-20.5%。在對條銹病表現(xiàn)有成株抗性的F2：3群體Strampelli/輝縣紅中，TaHLRG基因可以解釋表型變異的11.8%-22.5%。

目前，利用功能性分子標記研究條銹菌生理小種與抗病基因之間的關系已取得較大進展，能較好地揭示抗病性內在的分子機理，這對于抗條銹小麥品種培育以及條銹病防治具有重要意義。

2.2 在小麥抗逆性中的應用

干旱是限制農業(yè)發(fā)展的主要逆境因子之一，我國人均的水資源占有量不足世界人均的1/4，且水資源的時空分布極不均勻。我國的小麥主產區(qū)大部分在干旱、半干旱地區(qū)，因而選育和推廣抗旱小麥品種、尋找與抗旱相關的基因，并開發(fā)特異性的分子標記是促進小麥生產持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的重要途徑。由于鐵結合蛋白（ferritin，F(xiàn)er）參與干旱脅迫應答反應，所以開發(fā)Fer基因抗旱相關的分子標記可為抗旱小麥品種選育提供依據。鞠麗萍等［44］通過比對2個抗旱性強與2個抗旱性弱的小麥品種，在1A染色體上的鐵結合蛋白基因（TaFer-A1）基因序列上，發(fā)現(xiàn)TaFer-A1基因的第1個內含子區(qū)域內有3個連續(xù)堿基的TCT缺失和插入，根據該變異位點開發(fā)出共顯性分子標記 FerA1-intr1，并利用150 份抗旱性不同的小麥品系對該功能標記進行了驗證，結果表明該標記與小麥抗旱性密切相關。

硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）是植物體內的一類多功能蛋白，參與光合作用中的電子傳遞、被氧化蛋白質的修復、體內活性氧的清除等生理代謝［13］。張帆等［46］選用旱地小麥品種晉麥47為試驗材料，獲得了普通小麥硫氧還蛋白（Trx）超家族的1個新基因TaNRX，通過測序比較TNRX基因組全序列的差異，設計了4對顯性互補STS標記（Tnrxa-1、Tnrxb-1、Tnrxa-2及 Tnrxb-2），并將TaNRX基因劃分為與抗旱相關的兩種等位變異TNrx-a與TNrx-b，分子標記檢測為TNrx-a基因型群體后代和品種（系）的整體平均相對發(fā)芽率明顯高于TNrx-b基因型，說明開發(fā)的4個STS標記可以進行小麥抗旱性鑒定篩選，表明TNRX基因在小麥調控干旱脅迫的生理適應過程中發(fā)揮著重要作用。

轉錄因子TaDREB1是受多種非生物脅迫誘導而上調表達的調節(jié)基因，在小麥感受逆境脅迫后的基因表達調控網絡中起著重要的作用。Wei等［57］以4份六倍體小麥、3份普通小麥的二倍體野生近緣種和1份普通小麥的四倍體野生近緣種、1套以中國春為背景的缺四體和2個小麥遺傳作圖群體為材料，用直接測序的方法分析了TaDREB1基因的SNPs，并據此設計了一對可以穩(wěn)定檢測RIL群體雙親（Opata85和W7984）之間TaDREB1等位基因SNP的特異引物P40，利用該標記將TaDREB1基因定位于3BS，位于Xfam61和Xfba91之間。并用缺四體和Southern雜交予以驗證。

TaPP2Aa為小麥抗旱相關蛋白磷酸酶結構亞基基因，因此開發(fā)功能標記并作圖可為分子標記輔助選擇抗逆育種提供依據。王智蘭等［45］以154份小麥種質資源材料組成的自然群體、4個遺傳作圖群體、小麥野生近緣種和一套中國春缺四體為材料，將小麥抗旱候選基因TaPP2Aa定位在小麥第5同源染色體群上，其中TaPP2A-D基因開發(fā)的功能標記定位區(qū)間及其鄰近區(qū)間檢測到一個抗逆性狀的QTL；在5B染色體的標記區(qū)間檢測到分別控制穗長和株高的QTL，在其鄰近區(qū)間檢測到株高。株高旱脅迫系數和株高抗旱指數3個性狀共享的QTL區(qū)間。

蔗糖非發(fā)酵相關蛋白激酶家族2（sucrose nonfermentingl-related protein kinase2，SnRK2）參與逆境條件下植物體內逆境信號傳遞和能量代謝，在抵御非生物脅迫和調節(jié)植物的生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要的作用。張照貴等［55］利用中國春缺體-四體系將TaSnRK2.10定位到小麥第4同源群上，并根據TaSnRK2.10-4A基因序列1 907 bp處的序列差異開發(fā)了功能標記TaSnRK2.10-4A-CAPS，將該功能標記與128份材料的農藝性狀進行關聯(lián)分析，結果表明，TaSnRK2.10-4A的兩種單倍型（Hap-4A-H和Hap-4A-L）的千粒重、株高和穗長在所有的環(huán)境條件下均達到了顯著差異。

目前，在小麥抗逆性方面已經挖掘出不少基因，初步建立起了基因與小麥抗逆作用之間的關系，但對小麥抗性研究主要集中在抗性機理和遺傳分析及影響因素等方面，而通過分離克隆小麥的抗性相關基因，對其進行基因功能分析及自身調控研究，進而通過分子育種培育抗性小麥的文章還比較少。

2.3 在小麥品質改良中的應用

面粉顏色是決定小麥品質的重要指標，對面條及其它相關制品品質有重要影響。小麥籽粒中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性、黃色素含量（kernel yellow pitmen）和籽粒顏色是影響面制品顏色性狀的重要指標。多酚氧化酶是導致面制品在加工過程中發(fā)生酶促褐變的主要原因，黃色素含量過高將導致面粉黃度增加，同時面粉的白度降低，紅色籽粒小麥在磨粉時會隨著出粉率的升高造成鼓星混雜使面粉色澤變差，因此合適的酚氧化酶活性、黃素含量和籽粒顏色對小麥品質具有重要意義。Sun等［14］和王曉波等［15］分別根據2A和2D染色體上PPO基因序列開發(fā)了籽粒PPO活性的共顯性功能標記：PP018和STS01，可以區(qū)分2A和2D染色體上PPO基因的等位變異（PPO-2Aa1/bl，PPO-2Da2/b2），為深入了解中國小麥PPO基因的等位類型及其分布提供了可能。He等［24，25］克隆了普通小麥及其近緣種2A和2D染色體上PPO基因的全序列，并根據PPO-D1位點等位變異開發(fā)了一對互補的顯性標記PP016和PP029，通過對217份中國冬小麥材料的檢測，確定了該互補標記與PPO活性的相關性。以中優(yōu)9507/CA9632 DH群體為材料，將PP016與PP029被定位在2D染色體的長臂上，并與該區(qū)域的主效QTL共分離。

Wei等［18］以TaPod-A1基因的兩個等位變異（TaPod-A1a和TaPod-A1b）為依據，開發(fā)了一對顯性互補的功能標記POD-3A1和POD-3A2。POD-3A1在TaPod-A1a的材料中僅能擴增出291 bp的片段，與低POD活性相關。POD-3A2也只能在TaPod-A1b型的材料中擴增出766 bp的片段，與高POD活性相關。利用此功能標記POD-3A1和POD-3A2檢測281份來白3個麥區(qū)的小麥材料，不同麥區(qū)不同基因型的POD活性差異均達到5%顯著水平。此外，還利用豆麥/石4185RIL群體的214個品系對標記進行了驗證，4個環(huán)境下不同基因型的POD活性差異達到1%顯著水平；同時QTL的分析結果表明QPod. caas-3AL即是TaPod-A1。因此，顯性互補的標記POD-3A1和POD-3A2可有效地用于小麥POD活性的遺傳改良。

八氫番茄紅素合成酶（Psy）基因影響小麥谷物的黃色素（YP）含量，并與最終用途產品的質量有關。周渭皓等［75］為研究我國小麥面粉色澤形成的分子機理，利用功能標記YP7A、YP7A-2、YP7B-1、YP7B-2、YP7B-3、YP7B-4、YP7D-1和 YP7D-2對來自我國甘肅省的62份春小麥主栽品種Psy1位點的等位變異類型進行了檢測，并對其黃色素含量進行了測定。結果表明，擁有Psy-Ala、Psy-B1c和Psy-Dla基因型組合的小麥品種黃色素含量顯著高于其他基因型組合，而擁有Psy-Alb、Psy-Blc和Psy-Dla。基因型組合的小麥品種黃色素含量顯著低于其他基因型組合，為我國春小麥面粉色澤的遺傳改良提供重要信息。董長海等［29］克隆了與黃色素含量緊密相關的基因（TaPds-A1、TaPds-B1、TaLcye-B1和TaLcye-D1），針對TaPds-B1位點的2個等位變異TaPds-B1a和TaPds-B1b，開發(fā)了相應的顯性標記YP4B-1和YP4B-2；針對TaLcye-B1位點的等位變異TaLcye-B1a和TaLcye-B1b，開發(fā)了一個顯性標記YP3B-1；針對TaZds-A1位的等位變異TaZds-A1a和TaZds-A1b開發(fā)了共顯性標記YP2A-1，并可解釋11.30%的表型變異，TaZds-A1a基因型與低黃色素含量相關，而TaZds-A1b基因型與高黃色素含量相關。胡蘿卜素脫氫酶（Zds）影響小麥面制品色澤品質的關鍵酶，Zhang等［27］根據TaZds-D1基因在染色體2DL的等位基因TaZds-D1a和TaZds-D1b的差異，開發(fā)了功能標記YP2D-1。QTL分析證明這個標記與小麥黃色素含量連鎖，并且對表型的貢獻率為18.4%。用該功能標記檢測了71個DH群體，也證明它與黃色素含量有關，同時又用近300個小麥栽培品種（系）驗證了該標記的適用性。

小麥成熟期穗發(fā)芽是一種世界性的自然災害，不僅影響產量，且嚴重惡化小麥的加工品質和種用價值，給世界及我國各主要小麥產區(qū)造成了很大的經濟損失。基因Tamyb10屬于MYB家族的一種轉錄因子，決定著小麥種皮的顏色，同時對穗發(fā)芽杭性也具有一定影響。Yang等［63］依據普通小麥Vp1基因在穗發(fā)芽抗性與敏感品種中的差異開發(fā)出一個與穗發(fā)芽抗性相關的STS共顯性標記Vp1B3，該標記在抗性品種中擴增出845 bp和569 bp的片段，在感性品種中擴增出652 bp的片段，這一標記更適合于白粒品種的穗發(fā)芽抗性篩選。Zhang等［22，70］以水稻控制籽粒休眠和籽粒大小的基因OsSdr4和OsGS3為候選基因，克隆小麥同源基因TaSdr和TaGS?；赥aSdr-A1基因643位點的SNP，開發(fā)了CAPS標記Sdr2A，用此標記檢測44份中國小麥品種，不同TaSdr-A1等位基因間發(fā)芽指數（GI）平均值差異不顯著。根據TaSdr-B1基因-11位點的SNP開發(fā)了CAPS標記Sdr2B，可解釋表型變異的7.8%、6.4%和8.7%。根據TaGS-D1基因第2內含子中40 bp的InDel，開發(fā)了1個共顯性標記GS7D，最高可解釋千粒重表型變異的14.6%，解釋粒長表型變異的6.8%。

另外，在小麥品質改良育種中，蛋白含量及其種類也是決定小麥品質的重要因素。在六倍體小麥中，Slade 等［76］利用TILLING 技術在 800 個個體組成的 EMS 誘變群體中鑒定出 246 個 Waxy 基因的等位變異，其中 1/3 的Waxy 基因位點為功能失活突變體，這在一定程度上為低直鏈淀粉含量小麥功能標記的開發(fā)奠定了基礎。李冰［71］用二倍體和四倍體小麥對普通小麥品種中的TaGDH1基因的gDNA序列進行所屬染色體組劃分，分為A、B和D組。根據A組TaGDH1的gDNA序列其中一種單倍型，開發(fā)了一種InDel分子標記，命名為TaGDH1a-InDel。利用中國春缺體-四體體系和“泰農18×臨麥6號”RIL群體將這個標記定位到5A染色體上，該標記與SNP標記Ku-c47168-562連鎖，距離為2.1 cM。該研究開發(fā)的標記有助于GDHl在小麥中功能的研究以及TaGDHl基因型的鑒別，為今后結合5A上已知產量性狀相關QTL研究TaGDH1基因功能奠定了基礎。王昊龍等［43］克隆了抗性淀粉含量不同的小麥品種（系）中淀粉分支酶SBEⅡa基因、SBEⅡb基因和SBEⅡa基因啟動子序列，根據SBEⅡb基因ORF2248和2302等位位點AHG的突變產生的差異，設計了AS-PCR特異性引物2248A8、2248A9、224853和2302A8、2302S4和224855。AS-PCR結果顯示，2248A8、2248A9和共用引物224853的互補選擇可以作為SBEⅡb基因2248位點上A/G的有效鑒定。230254、230255及共用引物2302A8的互補選擇可以作為SBEⅡb基因2302位點上A/G的差異鑒定。4對引物的相互補充利用可以有效地用于小麥抗性淀粉含量分子標記輔助選擇，為后期小麥高抗性淀粉含量品種（系）的篩選工作提供一種便利的手段。

目前，雖然已經有70個左右的關于小麥加工品質功能標記開發(fā)和驗證，大大促進了小麥的品質育種進程，但與高產育種相比，品質育種則進展相對較慢，主要原因是品質性狀優(yōu)良的基因資源總體較為缺乏，以后應加強優(yōu)良種質資源的篩選來加快品質育種的進程。

2.4 在小麥農藝性狀培育中的應用

在小麥農藝性狀培育，千粒重是高產育種重要目標性狀之一。劉亞男等［72］以控制水稻穗型結構OsDepl為候選基因，采用同源克隆方法克隆了普通小麥TaDepl基因。根據TaDep1-A1和TaDepl-B1位點不同等位變異的SNP和InDel開發(fā)了3對顯性互補標記（70A1/A2R和82A1/A2R；95A2/A1R和96A2/A1R；95B3/2R和96B3/2R）和1個共顯性標記（dep19），可以準確鑒別不同等位基因；用這些標記對4個群體和430多份小麥品種進行檢測，發(fā)現(xiàn)不同基因型的株高、穗長、小穗數、穗節(jié)間和千粒重均沒有顯著差異，即小麥的TaDepl基因與產量相關性狀沒有顯著關聯(lián)。其中，可準確區(qū)分TaDep1-B1c與TaDepl-Bla、TaDepl-Blb和TaDepl-B1d的 共顯性標記Dep 19是根據第5外顯子上一個30 bp的InDel開發(fā)的。

雷夢林等［73］以六倍體普通小麥及其以野生近緣種的二倍體和四倍體為材料，克隆出小麥DREB轉錄因子基因W16 的DNA序列，利用DH群體親本（旱選10號和魯麥14）W16的單核苷酸多態(tài)性，開發(fā)了CAPS和AS-PCR（1728F/R）標記，利用該標記在154份六倍體普通小麥材料構成的自然群體中進行關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，W16的3種單倍型分別與單株穗數、穗粒數、每穗小穗數和籽粒飽滿度關聯(lián)。其中HapⅡ為增加單株穗數和籽粒飽滿度的優(yōu)良單倍型，HapⅢ為提高穗粒數的優(yōu)良單倍型。呂廣德等［47］克隆到了一個抗旱基因（TaOSCA1.4），通過中國春缺體-四體系將該基因定位到小麥第一部分同源群上。根據TaOSCA1.4-1B的SNP（4253bp A-C）位點開發(fā)成CAPS標記（TaOSCA1.4-1B-CAPS），將該功能標記與134份小麥品種（系）組成的自然群體12個環(huán)境調查數據進行關聯(lián)分析，結果表明，TaOSCA1.4的兩種單倍型Hap-1B-A與Hap-1B-C的總小穗數（TSS）和株高（PH）在不同的個體環(huán)境中達到了極顯著差異，單倍型Hap-1B-C比Hap-1B-A多0.70個小穗，株高矮3.23 cm，并且該基因對頂部不育小穗數、穗粒數和產量都有一定的影響。

SAP是一類具有A20/AN 1鋅指結構域的抗逆相關蛋白，Chang等［74］基于TaSAP1-A1啟動子區(qū)3個多態(tài)性位點InDel5-1810、SNP-2606和InDel39-1637開發(fā)了3個分子標記，分別命名為T7AM5、T7AM2606和T7AM39。其中T7AM5和T7AM2606是CAPS標記，T7AM39是等位基因特異PCR標記。關聯(lián)分析表明3個分子標記T7AM5、T7AM2606和T7AM393與5個農藝性狀顯著關聯(lián)，包括穗長、穗下節(jié)長、每穗總小穗數、穗粒數和千粒重。

基于大麥的光周期調控基因TaC09基因核酸序列，冉從福等［67］利用同源克隆技術在小麥中克隆了其同源基因TaC09，以序列在距CCT結構域22 bp內含子差異為依據設計了分子標記rF/R，利用中國春缺-四體材料將其定位于小麥1A染色體，命名為TaC09-1A，根據基因TaC09等位變異開發(fā)了共顯性分子標記F/R，在不同小麥品種中擴增，發(fā)現(xiàn)具有堿基插入突變的品種普遍為春性品種，抽穗及開花相對于未突變品種較早，冬性品種未發(fā)現(xiàn)突變，該標記與小麥冬春性密切關聯(lián)，可輔助鑒定品種冬春習性。

迄今為止，重要農藝性狀如株高、光周期反應、春化作用、粒重和耐逆境的基因已經開發(fā)了30個左右功能標記并在小麥育種中應用。由于農藝性狀與品質性狀相比更易描述，它們的田間表現(xiàn)可以直接選擇，所以在育種中農藝性狀的功能標記不如品質性狀的標記使用廣泛。

2.5 在小麥種質資源中的應用

傳統(tǒng)小麥基因鑒定方法，技術要求較高，影響因素多，實際操作有局限性，尤其在鑒定和篩選含兩個以上基因的材料時更為復雜，難以準確區(qū)分基因的具體歸屬和涉及的基因數目。利用與功能標記追蹤基因，可使目的基因的鑒定擺脫上述因素帶來的困難且結果更加準確可靠。Yang 等［20］發(fā)現(xiàn)大粒小麥TaGW2-6A 基因序列在第 8 外顯子 977 bp處相比于中國春有一個T 堿基缺失，這一堿基的缺失導致了TaGW2 基因編碼的氨基酸發(fā)生變化并應用此位點多態(tài)性開發(fā)的 AS-PCR分子標記可有效鑒定蘭考小麥和中國春雜交后代品系。陳杰等［62］在粗山羊草中克隆了3個新的等位基因，分別命名為Tamybl0-D1c、Tamyb10-D1d和Tamybl0-D1e，根據這3個等位基因序列之間的差異設計了兩對共顯性的功能標記DD3和DD5。用DD3和DD5對110參試的粗山羊草進行分子檢測，試驗結果表明：新疆地區(qū)粗山羊草材料的Tamybl0基因型較為豐富，有Tamyb10-D1c、Tamyb10-D1d和Tamyb10-D1e 3種變異類型。而黃河中游地區(qū)（河南和陜西）的粗山羊草材料的Tamybl0基因型較為單一，只有Tamyb10-D1d一種變異類型。利用DD3和DDS擴增出的目的片段條帶清晰，穩(wěn)定性好，可以直接用于粗山羊草Tamybl0基因的標記輔助選擇。張麗等［77］為建立長穗偃麥草（Lophopyrum elongatum）Ee染色體組特異的分子標記，以普通小麥（Triticum aestivum L.）中國春、中國春-長穗堰麥草二體代換系和附加系為材料，利用獲得的STS（STS318、STS241、STS116和STS182）標記對5個長穗堰麥草居群和8個小麥品種進行了鑒定。結果表明，這些STS標記在長穗堰麥草居群中能檢測到，但在其它小麥背景中檢測不到。說明這些標記可以用于小麥-長穗堰麥草異源附加系和代換系中長穗堰麥草遺傳物質的檢測。

3 展望

DNA分子標記技術的開發(fā)是近年來分子生物學領域研究的熱點，雖然分子水平遺傳標記的發(fā)展和利用只有短短的20多年，但它已被廣泛應用于遺傳育種中。開發(fā)分子標記的目的是為了進行生物種質資源鑒定、品種改良及相關遺傳基礎研究。

建立分子標記輔助育種體系可大幅度提高動植物品種改良的效率和定向性，縮短育種周期和降低育種成本。功能性分子標記的這種通過對基因序列的擴增而與表達序列緊密連鎖的特性使其可被廣泛而高效地應用于高密度圖譜的構建、QTL檢測、基因定位、圖位克隆及分子標記輔助育種等［10］。

功能性分子標記的開發(fā)首先需要鑒定出群體中與表型相關的功能基因的功能性基序的序列，具有明確基因功能的基因分離是功能性分子標記開發(fā)的前提。盡管小麥中已有許多功能基因可以用來開發(fā)功能性分子標記，但迄今為止，小麥中也僅有20個左右的控制農藝性狀的基因被分離出來，比如抗病性基因中的Lr10、Lr21和Pm3等，谷物品質基因中的Pina、Pinb、A2*和Bx7/Bx17等。對小麥中不同群體連鎖不平衡程度的信息量的掌握很有限，更多基因并未明確注釋功能。另外，得到注釋的也是其生物學意義大于其農藝性狀意義的，遠不能滿足農藝性狀意義的功能。因此，在進行FMs開發(fā)以前不僅要深入研究基因及序列的功能，對所有控制農藝性狀上同一位點的全部等位基因都需要檢測與鑒定。

［1］劉光興. 遺傳標記技術在海洋橈足類生物多樣性和系統(tǒng)發(fā)生研究中的應用［J］. 中國海洋大學學報, 2007, 37（1）：33-37.

［2］周延清. DNA分子標記技術在植物研究中的應用［M］. 北京：化學工業(yè)出版社, 2005：56-57.

［3］Pang M, Percy RG, Hughs E, et al. Promoter anchored amplified polymorphism based on random amplified polymorphic DNA（PAAPRAPD）in cotton［J］. Euphytica, 2009, 167（3）：281-291.

［4］Bagge M, Xia X, Lübberstedt T. Functional markers in wheat［J］. Current Opinion in Plant. Biology, 2007, 10（2）：211-216.

［5］Andersen JR, Lübberstedt T. Functional markers in plants［J］. Trends in Plant Science, 2003, 8（11）：554-560.

［6］楊景華, 王士偉, 劉訓言, 等. 高等植物功能性分子標記的開發(fā)與利用［J］. 中國農業(yè)科學, 2008, 41（11）：3429-3436.

［7］The Arabidopsis genome initiative. analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana［J］. Nature, 2000, 408（6814）：796-815.

［8］Sherry A, Thuillet Anne-Céline, Yu JM, et al. Maize association population：a high-resolution platform for quantitative trait locus dissection［J］. The Plant Journal, 2005, 44（6）：1054-1064.

［9］Kurowska M, Daszkowska-Golec A, Gruszka D, et al. TILLING-a shortcut in functional genomics［J］. Journal of Applied Genetics, 2011, 52（4）：371-390.

［10］Sunnucks P. Efficient genetic markers for population biology［J］. Trends in Ecology and Evolution, 2000, 15（5）：199-203.

［11］Brenchley R, Spannag M, Pfeifer M, et al. Analysis of the bread wheat genome using whole genome shotgun sequencing［J］. Nature. 2012, 491（7426）：705-710.

［12］Bagge M, Xia XC, Lubberstedt T. Funetional markers in wheat［J］. Current Opinion in Plant Biology, 2007, 10（2）：211-216.

［13］Arnér ESJ, Holmgren A. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase［J］. European Journal of Biochemistry, 2000, 267（20）：6102-6109.

［14］Sun DJ, He ZH, Xia XC, et al. A novel STS marker for polyphenol oxidase activity in bread wheat［J］. Molecular Breeding, 2005, 16（3）：209-218.

［15］王曉波, 馬傳喜, 何克勤, 等. 小麥2D染色體上多酚氧化酶（PPO）基因STS標記的開發(fā)與應用［J］. 中國農業(yè)科學, 2008, 41（6）：1583-1590.

［16］He XY, He ZH, Zhang LP, et al. Allelic variation of polyphenol oxidase（PPO）genes located on chromosomes 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes in common wheat［J］. Theoretical Applied Genetics, 2007, 115（1）：47-58.

［17］He XY, He ZH, Morris CF, et al. Cloning and phylogenetic analysis of polyphenol oxidase genes in common wheat and related species［J］. Genetic Resources and Crop Evolution, 2009, 56（3）：311-321.

［18］Wei JX, Geng HW, Zhang Y, et al. Mapping quantitative trait loci for peroxidase activity and developing gene-specific markers for TaPod-A1 on wheat chromosome 3AL［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2015, 128（10）：2067-2076.

［19］Su ZQ, Hao CY, Zhang XY. Identification and development of a functional marker of TaGW2 associated with grain Weight in bread wheat（Triticum aestivum L. ）［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2010, 122（1）：211-223.

［20］Yang ZB, Bai ZY, Li XL, et al. SNP identification and allelicspecific PCR markers development for TaGW2, agene finked to wheat kernel weight［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2012, 125（5）：1057-1068.

［21］Jiang QY, Hou J, Hao CY, et al. The wheat（T. aestivum）sucrose synthase 2 gene（TaSus2）active in endosperm development is associated with yield traits［J］. Funct Integr Genomics, 2011, 11（1）：49-61.

［22］Zhang YJ, Liu JD, Xia XC, et al. TaGS-D1, an ortholog of rice OsGS3, is associated with grain weight and grain length in common wheat［J］. Mol Breeding, 2014, 34（3）：1097-1107.

［23］ Ma DY, Yan J, He ZH, et al. Characterization of a cell wall invertase gene TaCwi-A1 on common wheat chromosome 2A and development of functional markers［J］. Mol Breeding, 2012, 29（1）：43-52.

［24］He XY, He ZH, Ma W, et al. Allelic variants of phytoene synthase 1（Psy1）genes in Chinese and CIMMYT wheat cultivars and development of functional markers for flour colour［J］. Mol Breeding, 2009, 23（4）：553-563.

［25］He XY, Zhang YL, He ZH, et al. Characterization of phytoene synthase 1 gene（Psy1）located on common wheat chromosome 7A and development of a functional marker［J］. Theor Appl Genet, 2008, 116（2）：213-221.

［26］Wang JW, He XY, He Z, et al. Cloning and phylogenetic analysis of phytoene synthase 1（Psy1）genes in common wheat and related species［J］. Hereditas, 2009, 146（5）：208-256.

［27］Zhang CY, Dong CH, He XY, et al. Allelic Variants at the TaZds-D1 locus on wheat chromosome 2DL and their association with yellow pigment content［J］. Crop Sci, 2011, 51（4）：1580-1590.

［28］Dong CH, Ma ZY, Xia XC, et al. Allelic variation at the TaZds-A1 locus on wheat chromossome 2A and development of a functional marker in common wheat［J］. Journal of Integrative Agriculture, 2012, 11（7）：1067-1074.

［29］董長海. 普通小麥籽粒黃色素含量相關基因的克隆與功能標記開發(fā)［D］. 保定：河北農業(yè)大學, 2011.

［30］Geng HW, Xia XC, Ghang LP, et al. Development of functional markers for a lipoxygenase gene Talox-B1 on chromosome 4BS in common wheat［J］. Crop Science of America, 2012, 52（2）：568-576.

［31］吳萍. 小麥籽粒脂肪氧化酶活性功能標記的開發(fā)與應用［D］.合肥：安徽農業(yè)大學, 2013.

［32］Guo GA, Song YX, Zhou RH, et al. Discovery, evaluation and distribution of haplotypes of the wheat Ppd-D1 gene［J］. New Phytologist, 2010, 185（3）：841-851.

［33］Slierman JD, Yan L, Talbert L, et al. A PCK marker for growth habit in common wheat based on allelic variation Vrn-A1 gene［J］. Crop Science Society of America, 2004, 44（5）：1832-1838.

［34］Zhao XL, Ma W, Gale KR, et al. Identification of SNPs and development of functional markers for LMW-GS genes at Glu-D3 and Glu-B3 loci in bread wheat（Triticum aestivum L. ）［J］. Molecular Breeding, 2007, 20（3）：223-231.

［35］Liu SX, Chao SM, Anderson JA. New DNA markers for high molecular weight glutenin subunits in wheat［J］. Theor Appl Genet, 2008, 118（1）：177-183.

［36］Ma W, Zhang W, Gale KR. Multiplex-PCR typing of high molecular weight glutenin alleles in wheat［J］. Euphytica, 2003, 134：51-60.

［37］Schwarz G, Felsenstein FG, Wenzel G. Development and validation of a PCR-based marker assayfor negative selection of the HMW glutenin allele Glu-B1-1d（Bx-6）in wheat［J］. Theor Appl Genet, 2004, 109（5）：1064-1069.

［38］Ragupathy R, Naeem HA, Reimer E, et al. Evolutionary origin of the segmentalduplication encompassing the wheat GLU-B1 locus encoding the overexpressed Bx7（Bx70E）high molecular weight glutenin subunit［J］. Theor Appl Genet, 2008, 116（2）：283-296.

［39］Lei ZS, Gale KR, He ZH, et al. Y-type gene specific markers for enhanced discrimination of high-molecular weight glutenin alleles at the Glu-B1 locus in hexaploid wheat［J］. J Cereal Sci, 2006, 43（1）：94-101.

［40］Wang LH, Li GY, Pena RJ, et al. Development of STS markers and establishment of multiplex PCR for Glu-A3 alleles in common wheat（Triticum aestivum L. ）［J］. J Cereal Sci, 2010, 51（3）：305-312.

［41］Wang LH, Zhao XL, He ZH, et al. Characterization of lowmolecular-weight glutenin subunit Glu-B3 genes and development of STS markers in commonwheat（Triticum aestivum L. ）［J］. Theor Appl Genet, 2009, 118（3）：525-539.

［42］Mika S, Patricia V, Goro I, et al. A novel codominant marker for selection of the null Wx-B1 allele in wheat breeding programs［J］. Molecular Breeding, 2009, 23（2）：209-217.

［43］王昊龍, 韓俊杰, 李衛(wèi)華, 等. 不同抗性淀粉含量的小麥品種（系）SBEⅡa基因啟動子序列分析［J］. 石河子大學學報：自然科學版, 2015, 33（1）：60-66.

［44］鞠麗萍, 張帆, 蔣雷, 等. 小麥TaFer-A1 基因抗旱相關分子標記的開發(fā)［J］. 麥類作物學報, 2013, 33（5）：901-906.

［45］王智蘭, 毛新國, 李昂, 等. 小麥蛋白磷酸酶2A結構亞基基因TaPP2Aa的功能標記作圖［J］, 中國農業(yè)科學, 2011, 44（12）：2411-2421.

［46］張帆, 蔣雷, 鞠麗萍, 等. 一個普通小麥Trx超家族新基因TaNRX的克隆與抗旱相關標記開發(fā)［J］. 作物學報, 2014, 40（1）：29-36.

［47］ 呂廣德. 小麥TaOSCA1.4基因的克隆、標記開發(fā)和功能分析［D］. 泰安：山東農業(yè)大學. 2015.

［48］Gennaro A, Koebner RMD, Ceoloni C. A candidate for Lr19, an exotic gene conditioning leaf rust resistance in wheat［J］. Funct Integr Genomics, 2009, 9（3）：325-334.

［49］Helguera M, Vanzetti L, Soria M, et al. PCR markers for Triticum speltoides leaf rust resistance gene Lr51 and their use to develop isogenic hard red spring wheat lines［J］. Crop Sci, 2005, 45（2）：728-734.

［50］劉興舟. Vrn、Ppd-D1和Lr34/Yr18基因在山東小麥品種中的分子檢測和分布的研究［D］. 泰安：山東農業(yè)大學, 2009.

［51］Tommasini L, Yahiaoui N, Srichumpa P, et al. Development of functional markers specific for seven Pm3 resistance alleles and their validation in the bread wheat gene pool［J］. Theor Appl Genet, 2006, 114（1）：165-175.

［52］伍玲, 夏先春, 朱華忠, 等. CIMMYT 273個小麥品種抗病基因Lr34/Yr18/Pm38的分子標記檢測［J］. 中國農業(yè)科學, 2010, 43（22）：4553-4561.

［53］Lagudah ES, Krattinger SG, Herrera-Foessel S, et al. Genespecific markers for the wheat gene Lr34/Yr18/Pm38 which confers resistance to multiple fungal pathogens［J］. Theor Appl Genet, 2009, 119（5）：889-898.

［54］Liu D, Xia XC, He ZH, et al. A novel homeobox-like gene associated with reaction to stripe rust and powdery mildew in common wheat［J］. Phytopathology, 2009, 98（12）：1291-1296.

［55］張照貴. 小麥TaSnRK2_10基因的克隆_標記開發(fā)和功能分析［D］. 泰安：山東農業(yè)大學, 2014.

［56］王倩, 毛新國, 昌小平, 等. 小麥TaSnRK2. 10的多態(tài)性及與農藝性狀的關聯(lián)［J］. 中國農業(yè)科學, 2014, 47（10）：1865-1877.

［57］Wei B, Jing RL, Wang CS, et al. Dreb1 genes in wheat（Triticum aestivum L. ）development of functional markers and gene mapping based on SNPs［J］. Molecular Breeding, 2009, 23（1）：13-22.

［58］Himi E, Noda K. Red gain colour gene（R）of wheat is a myb-type transcription factor［J］. Euphytica, 2005, 143：239-242.

［59］Himi E, Maekawa M, Miura H, et al. Development of PCR markers for Tamyb10 related to R-1, red grain color gene in wheat［J］. Theor Appl Genet, 2011, 122（8）：1561-1576.

［60］李婷, 陳杰, 陳鋒, 崔黨群. 黃淮麥區(qū)地方小麥品種子粒顏色相關基因Tamyb10-1等位變異檢測［J］. 植物遺傳資源學報, 2014, 15（5）：1089-1095.

［61］陳杰, 陳鋒, 詹克慧, 等. 普通小麥籽粒Tamyb10基因等位變異的分子檢測［J］. 麥類作物學報, 2013, 33（2）：224-229.

［62］陳杰. 小麥籽粒和面粉顏色相關性狀的基因型鑒定及其功能標記開發(fā)［D］. 鄭州：河南農業(yè)大學, 2013.

［63］Yang Y, Zhao XL, Xia LQ, et al. Development and validation of a Viviparous-1 STS marker for pre-harvest sprouting tolerance in Chinese wheats［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2007, 115（7）：971-980.

［64］劉世鑫. 休眠基因Viviparous-1A在中國小麥3A染色體上等位變異的鑒定及STS分子標記的開發(fā)［D］. 呼和浩特：內蒙古農業(yè)大學, 2012.

［65］Chen F, Zhang FY, Xia XC, et al. Distribution of puroindolinealleles in bread wheat cultivars of the Yellow and Huai valley of China and discovery of a novel puroindoline a allele without PINA protein［J］. Mol Breeding, 2012, 29（2）：371-378.

［66］Ellis M, Spielmeyer W, Gale R, et al. “Perfect” markers for the Rht-B1b and Rht-Dlb dwarfing genes in wheat［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2002, 105（6-7）：1038-1042.

［67］冉從福, 邵慧, 余靜, 等. 小麥CO-like基因TaC09的克隆及結構分析［J］. 麥類作物學報, 2014, 34（10）：1319-1326.

［68］Distelfeld A, Uauy C, Fahima T, et al. Physical map of the wheat high-grain protein content gene Gpc-B1 and development of a highthroughput molecular marker［J］. New Phytologist, 2006, 169（4）：753-763.

［69］Uauy C, Distelfeld A, Fahima T, et al. A NAC gene regulating senescence improves grain protein, zinc, and iron content in wheat［J］. Science, 2006, 314（5803）：1298-1301.

［70］Zhang YJ, Miao XL, Xia XC, et al. Cloning of seed dormancy genes（TaSdr）associated with tolerance to pre-harvest sprouting in common wheat and development of a functional marker［J］. Theor Appl Genet, 2014, 127（4）：855-866.

［71］李冰, 張照貴, 王佳佳, 等. 小麥GDH1基因克隆及其功能標記開發(fā)［J］. 山東農業(yè)科學, 2014, 46（10）：6-11.

［72］劉亞男, 夏先春, 何中虎. 普通小麥TaDep1基因克隆與特異性標記開發(fā)［J］. 作物學報, 2013, 39（4）：589-598.

［73］雷夢林, 李昂, 昌小平, 等. 小麥轉錄因子基因W16的功能標記作圖和關聯(lián)分析［J］. 中國農業(yè)科學, 2012, 45（9）：1667-1675.

［74］Chang JZ, Zhang JN, Mao XG, et al. Polymorphism of TaSAP1-A1 and its association with agronomic traits in wheat［J］. Planta, 2013, 263（6）：1495-1508.

［75］周渭皓, 孫建喜, 陳杰, 等. 甘肅春小麥八氫番茄紅素基因的等位變異［J］. 麥類作物學, 2014, 34（8）：1036-1043.

［76］Slade AJ, Fuerstenberg SI, Loeffler D, et al. A reverse genetic, nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING［J］. Nature Biotechnology, 2004, 23（1）：75-81.

［77］張麗, 顏澤洪, 鄭有良, 等. 小麥中國春背景下長穗堰麥草Ee染色體組特異AFLP及STS標記的建立［J］. 農業(yè)生物技術學報，2008，16（3）：465-473.

（責任編輯 狄艷紅）

The Application of the Functional Molecular Marker in Wheat Breeding

LIU Guo-sheng ZHANG Da-le
（School of Life Science，Henan University，Kaifeng 475000）

Based on the polymorphic sequence of a particular area in a functional gene closely related to phenotype, functional marker is a novel dominant molecular marker developed by correlation analysis, spectrum analysis, RNA interference and QTL mapping method, etc. Using these functional markers, whether or not the target allele from different genetic backgrounds exist can be directly and rapidly determined. In this work, the concept and characteristics of functional markers are briefly introduced, mainly exploring the application and prospect of functional markers as an assistant means in wheat breeding, in order to provide reference for the development of related molecular markers

wheat；molecular marker；functional gene；assistant breeding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.003

2016-03-23

國家自然科學基金項目（31401379），河南省青年骨干教師項目（2015GGJS-019）

劉國圣，男，研究方向：植物科學與技術；E-mail：15515228983@163.com

張大樂，男，副教授，研究方向：小麥遺傳育種；E-mail：zhangdale97@126.com